醛固酮诱导肾小管上皮细胞的增殖体内但不是在体外

摘要

客观的．探讨醛固酮对肾小管上皮细胞增殖的影响在活的有机体内和体外．方法．Thirty-two male C57BL/6J mice (20–22 g) were divided randomly into four groups: sham, unilateral nephrectomy (UN), unilateral nephrectomy plus aldosterone infusion (UA), and UA plus eplerenone (UAE). The kidneys were removed 6 weeks after treatment. Expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was detected by immunohistochemistry and western blotting. Human kidney proximal tubular epithelial (HK2) and mouse distal convoluted tubule (mDCT) cell lines were stimulated by aldosterone (0, 10^-9, 10^-8, 10^-7和10.^-6 mol/L)体外．在3,6,12,24,36和48小时后收集细胞，并通过蛋白质印迹，流式细胞术，实时成像和MTT测定检测的每组的增殖。此外，MDCT细胞与含有终浓度为161mmol / L Na的培养基的级联⁺采用MTT法和流式细胞仪检测细胞数量和细胞DNA含量。结果．醛固酮可以诱导小鼠肾脏的PCNA阳性细胞数量的显着增加，伴随胶原纤维的沉积增加。Eplerenone可以抑制醛固酮诱导的细胞增殖和胶原沉积。施用不同浓度的HK2细胞和MDCT细胞，并且不同时间的醛固酮刺激未能引起细胞增殖，并且醛固酮和盐的共同刺激不会引起MDCT细胞的增殖变化。结论．醛固酮灌注可以诱导小鼠肾细胞的增殖在活的有机体内而醛固酮则刺激HK2细胞和mDCT体外而不会引起它们的扩散。

1.介绍

纤维化是慢性肾病的病理变化，后者进展到终末期肾功能衰竭。纤维化的主要病理特征是器官萎缩，细胞外基质（ECM）的过度沉积，细胞增殖[1］．

ECM的过度沉积是肾间质纤维化最明显的标志物。细胞增殖通常发生在纤维化的早期阶段，并且在ECM积累和肾小球粥样硬化中持续存在[2］．Ruster和同事表明，肾间质纤维化的超过三分之一的成纤维细胞源自肾小管上皮细胞（RTEC）[3.］．抑制细胞增殖可减少ECM的积累。相反，刺激细胞增殖导致ECM的沉积增加。之前，我们发现单侧输尿管梗阻(UUO)后10天，对侧肾rtec中出现增殖细胞核抗原(PCNA)高表达，并伴有ECM沉积[4.］．这些数据表明REC增殖可能涉及肾纤维化的发展。

醛固酮是盐皮质激素的主要活性物质，并通过其在肾小管上皮细胞[表达与盐皮质激素受体（MRS）的相互作用介导的盐和水动态平衡5.那6.］．醛固酮在慢性肾疾病中的作用和矿物质激素受体阻滞剂（MRB）的保护作用近年来受到关注。醛固酮刺激激活的MR激活通过细胞增殖参与纤维化的形成（包括肾小球纱线细胞[7.]，RECS [4.]，肺巨噬细胞[8.和心脏成纤维细胞[9.]），表型转化，其他[10.-13.］．MRB能有效地阻断这种病变。之前，我们发现在UUO 10天后，对侧肾脏的rtec和间质细胞可以增殖[4.］．尽管有报道称醛固酮对间质有直接增殖作用体外[14.-16.，关于醛固酮对RTECs直接作用的报道较少。醛固酮能直接刺激动物特别是体外肾小管细胞增殖吗?MRB能否有效抑制醛固酮诱导的肾小管上皮细胞增殖?

为了进一步探讨醛固酮的作用机制对RTEC增殖，小鼠与醛固酮注入在活的有机体内，并通过不同浓度的醛固酮刺激recs体外．我们的目的是探讨醛固酮在UUO后早期对背侧肾脏的肥大和纤维化的作用，以及如何在该过程中干预ePlerenone。

2。材料和方法

2.1。材料

醛固酮购自Cayman Chemicals（Ann Arbor，Mi，USA）。胎儿牛血清（FBS）和青霉素 - 链霉素是从Gibco（Grand Island，Ny，USA）获得的。从北京Solarbio科学技术购买二甲基亚砜，3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴铵（MTT），细胞循环检测试剂盒，用于胰蛋白酶消化的溶液（北京，中国）。PCNA是从Proteintech（武汉）获得的。

２.２.动物实验设计

本研究方案获得河北中医药大学动物实验伦理委员会批准。实验是按照美国国立卫生研究院(Bethesda, MD, USA)制定的指导方针进行的。

雄性C57BL/6J小鼠32只(8周;20 - 22 g;采用HFK实验动物(北京，中国)检测醛固酮(生长促进物质)对RTECs的增殖作用。小鼠被喂食标准鼠粮和自来水，温度为22℃，光照-暗循环12小时。

将小鼠随机分为四组八组：车辆（假），单侧肾切除术（联合国），单侧肾切除术+醛固酮输注（UA）和UA + Eplerenone（UAE）。

对于UA组，小鼠在麻醉（异氟烷）下进行了单侧肾切除术。在手术中恢复5天后，术语（1002系列; alzet，Cupertino，Ca，USA）被植入（S.C.）到InfuseAldosterone（0.75 μg / h) (17.6个星期。

对于阿联酋群，经过单侧肾切除术+醛固酮输注的小鼠100毫克·kg^-1D.^-1eplerenone(辉瑞，纽约，NY, USA)， MRs的特异性阻滞剂。

允许小鼠免费获得食物和饮用水。在第6周结束时收获肾脏样品6.在斩首后，除去右肾，称重，固定在10％福尔马林中，并嵌入石蜡中以进行组织学。

２.３.细胞培养

从Procell Life Special和Technology（武汉）获得人肾近端管状上皮（HK2）细胞。鼠标远端卷曲小管（MDCT）细胞是从Tatsuo Shimosawa教授（国际健康和日本东京）的教授。两种类型的细胞在95％空气和5％CO的气氛中生长₂在37°C。细胞维持在Dulbecco 's modified Eagle 's培养基(DMEM)/F12培养基中(由DMEM、10%胎牛血清、10000单位/mL青霉素和10000μg/mL链霉素)。一个high-Na⁺介质(145.3更易·L^-1）含有额外的氯化钠，最终浓度Na⁺是161mmol·L.^-1．细胞在 96孔板或烧瓶中每毫升细胞。第1天，细胞在37°C磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，在0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸溶液中孵育1 - 2分钟，进行胰蛋白酶化。将1毫升等量的细胞悬液分配到96孔板上，或将6毫升等量的细胞悬液分配到烧瓶中。第2天，用无血清培养液替代培养液24h，使细胞静止。随后，细胞在用醛固酮处理的血清培养基中孵育(0,10^-9, 10^-8, 10^-7和10.^-6 mol/L) diluted in ethanol for 3, 6, 12, 24, 36, or 48 h. Cells were harvested at different times.

2.4。染色

使用标准程序进行染色（Sirius Red，Masson）。肾脏固定在10％中性缓冲福尔马林中并嵌入石蜡中。通过染色评估肾切片中间质纤维化的存在。

2.5。免疫组织化学

将肾脏在4％多聚甲醛中固定过夜，并嵌入石蜡中。将六微米切开，脱蜡和脱水在梯度系列的醇溶液中。在柠檬酸溶液（pH6.0,95℃-100℃）中检出抗原20分钟。接下来，将部分置于3％H的气氛中₂O.₂用10%山羊血清孵育30分钟。切片用抗PCNA的一抗(1:30 0稀释;产品目录号:0086617;在4°C下过夜。然后冲洗切片，用生物素化二抗孵育15分钟。孵育完成后，通过形成亲和素生物素复合物放大信号，并通过二氨基联苯胺和苏木精的反染色得到信号。

2.6。西方墨点法

在冷PBS中裂解细胞并超声处理。然后，30 μg of protein from the whole-cell preparation was denatured in boiling water for 15 min, separated by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis, and transferred onto polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes. As an index of their proliferation activity, mDCT cells and HK2 cells expressing PCNA were assessed. Immunoblotting was done with primary antibodies against PCNA (1 : 1000 dilution), followed by the addition of appropriate fluorescence-labeled secondary antibodies.

2.7。根据MTT测定的细胞活力/增殖

用MTT (5 mg/mL)在5% CO的湿化气氛中培养4 h，测定活细胞数₂．然后，150 μ在室温下加入L二甲基亚砜10 min。最后，在570 nm处用酶标仪(Molecular Devices, Silicon Valley, CA, USA)测量吸光度。

2.8。细胞周期分析

将细胞接种在六孔板中并如部分所述施用醛固酮3.2．处理后，收集细胞并用PBS洗涤。随后，将细胞固定在冰冷的70％乙醇中过夜，并在37℃下与RNasea反应30分钟。最后，加入碘化丙锭（0.01mg / ml）并在4℃下培养30分钟。通过流式细胞术检测DNA含量。通过Cell Quest™（Beckman Coulter，Fullerton，Ca，USA）分析了数据。计数细胞（10,000-20,000）并分析为G1，S或G2阶段的百分比。

2.9。活细胞的成像

将制备的细胞悬浮液加入到100个96孔板中 μL /。随后放入Incucyte®S3 (Essen Bio Science, Ann Arbor, MI, USA)。每隔1小时选取一个细胞数量相对平均的视野。醛固酮刺激48 h后观察细胞融合程度和细胞数量。

2.10。统计分析

采用spss24.0 (IBM, Armonk, NY, USA)进行统计分析。结果是 ．不同的组由学生进行比较 -测试。组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，其次采用最小显著性差异/学生-纽曼- keuls检验。采用单因素方差分析比较剂量依赖性差异，然后采用Tukey诚实显著性差异检验。 (双尾)被认为是显著的。

结果

3.1。通过醛固酮灌注诱导的小鼠肾脏间质纤维化的变化可以通过Eplerenone逆转

为了确定醛固酮灌注对单侧肾切除术后肾纤维化的影响，我们对肾组织进行了染色（Sirius Red，Masson）。在UA组中，许多胶原纤维沉积在血管周围。胶原蛋白在UA组中的表达显着增强，联合国胶原蛋白的表达比假组合在略微增强（图1）。

3.2。醛固酮诱导PCNA表达体内和在体外

我们希望检测醛固酮对RECS的增殖效应在活的有机体内，采用免疫组化方法检测PCNA表达。在随机选择三个区域后，使用ImageJ(美国国立卫生研究院)计算每个小管中pcna阳性细胞的数量。pcna阳性细胞占总细胞数的百分比为 在假组中， 在联合国群体中， 在UA组，和 在阿联酋集团。UA组阳性细胞数较假手术组和UN组明显增加( ），但依普利酮可降低PCNA表达( ）（数字2）。

体外，我们使用HK2细胞和MDCT细胞来测量PCNA的蛋白质表达。施用不同浓度的醛固酮对HK2细胞中PCNA表达没有影响（图3（a）)或mDCT细胞(图3（b））与不使用醛固酮的引发（ ）在不同的刺激时间。

3.3。醛固酮对HK2细胞和MDCT细胞的影响根据剂量，时间和细胞周期

我们希望确定细胞的存活率和生长。选择MTT测定以检测（间接地）在不同时间和浓度下的细胞数的变化。MTT测定证明，在HK2细胞系中，与0mol / L的醛固酮相比，它没有通过不同时间的不同醛固酮浓度刺激;与HK2的结果一致，MDCT没有增殖（图4.）。该结果表明，在这些试验条件下，醛固酮没有刺激HK2细胞的增殖。

我们希望探索醛固酮诱导的细胞增殖与细胞周期骤停。我们在使用流式细胞术中检测到HK2细胞和MDCT细胞中细胞周期相的分布以分析细胞DNA含量。与未施用的醛固酮的组相比，在施用不同浓度的醛固酮后，M / G2相中的HK2细胞或MDCT细胞的百分比没有显着增加（ ）(数据5（a）和5（b））。

3．4．盐和醛固酮联合作用对多层螺旋ct细胞增殖的影响

为了确定醛固酮和盐是否协同刺激细胞增殖，我们选择MR受体较多的mDCT细胞，检测细胞周期12h和24h后细胞数量和DNA含量的变化。与未给予醛固酮组相比，高水平盐和不同浓度醛固酮联合刺激不会引起细胞数量或细胞DNA含量的显著变化( ）（数字6.）。

3.5。醛固酮刺激后HK2细胞和MDCT细胞的实时成像

实时观察不同醛固酮浓度下HK2细胞数量、mDCT细胞数量及融合程度的变化。随着时间的增加，HK2细胞的融合程度和数量显著增加(图2)7(一)(一)- (E))。与未给予醛固酮组相比，醛固酮刺激后36 h和48 h细胞融合程度略有下降，但差异无统计学意义( ）（数字7.(A1))。醛固酮刺激的细胞数(10^-6 mol/L) decreased slightly at 36 h compared with that in the group not administered aldosterone, but the difference was not significant ( ）（数字7.（A2））。MDCT细胞数量和融合的动态图像如图所示7 (b)，（a） - （e），（b1），（b2）。

4.讨论

醛固酮在电解质运输中具有重要作用通过太太。它是在内皮，心脏，血管平滑肌和脑中合成的[17.-19.］．以前，肾远端小管被认为是醛固酮的唯一靶点。如今，我们知道非上皮组织(如心脏、血管、脂肪组织和巨噬细胞)也是醛固酮的潜在靶点[20.］．除了离子转运之外，醛固酮可以刺激细胞生长（例如，肾小球纱线细胞[21.]血管平滑肌细胞[22.和心脏成纤维细胞[23.]）通过快速激活信号级联通过激活信号组织。醛固酮对细胞（肥大或增生）的刺激作用取决于细胞类型。

如果肾脏组织发生炎症或损伤，则醛固酮激活RTEC，以分泌细胞因子，例如血小板衍生的生长因子[24.]表皮生长因子[25.] interleukin-4 [26.，转化生长因子[25.，或肿瘤坏死因子[27.]，促进直接在肾间隙中的成纤维细胞增殖。相反，醛固酮促进细胞上表型转化并参与肾纤维化的进展。以前，我们报道称，在早期的UUO诱导的损伤中，许多管状细胞在对侧肾脏中增殖伴有血浆和肾纤维化中的醛固酮浓度增加[4.］．醛固酮对正常小管细胞增殖和分化的影响已在幼龄动物中得到证实[28.］．然而，几乎没有证据表明血浆中的醛固酮水平增加可以诱导成熟肾小管细胞的分化和增殖。因此，我们探讨了醛固酮是否可以直接刺激抗rec增殖以诱导肾纤维化。

醛固酮是矿物质皮质激素的主要活性物质。一些研究表明，矿物质激素可以促进急性期肾小球和管状实质细胞的增殖，从而加速慢性肾病。障碍者对肾脏损害具有保护作用。例如，在大鼠缺血再灌注诱导的一些急性肾损伤的模型中，显示培训后24小时施用螺旋酮，显着减少蛋白尿和肾小球肥大有效[29.］．在灌注盐和醛固酮的单侧肾切除术模型中，已经观察到肾小管肥大和肾小球高纤维状的过度变化。Eplerenone管理可以减轻这些变化[30.］．以前，我们报道过在uo诱导的早期损伤中，如果给予MR阻滞剂依普利酮，则对侧肾脏RTEC增殖减少[4.］．我们推测肾小管细胞的增殖是由于MRS。

为了确定细胞是否通过MRs进行增殖，对接受单侧肾切除术的小鼠给予MR激动剂醛固酮。接受单侧肾切除加醛固酮灌注的小鼠同时给予MR阻滞剂。检测肾组织中PCNA的表达。PCNA是细胞增殖的敏感指标，在DNA合成/修复和细胞增殖中发挥重要作用[31.］．在与醛固酮灌注的小鼠中，与假组合相比，PCNA表达显着增加。Eplerenone给药可以显着降低PCNA表达。与PCNA表达一致，肾纤维化程度在UA群小鼠中更严重，纤维化可以通过Eplerenone逆转。

选择HK2细胞和mDCT细胞，验证醛固酮通过激活MRs诱导RTEC增殖体外．我们使用了四种方法来验证醛固酮诱导的RTEC增殖。第一种方法是使用MTT测定间接验证醛固酮的增殖效应：未观察到对RTEC的增殖效应。第二种方法是测量PCNA的蛋白质表达。在不同时间的不同浓度的醛固酮刺激下没有显着差异。体外，醛固酮诱导肾上实质细胞的增殖（主要是肾小球乳腺细胞[32.]）但不是RTEC。第三，我们使用实时成像来检测细胞的融合和数量。随着培养时间的增加，细胞数量和融合程度增加，但在不同浓度的醛固酮的刺激下，细胞融合的数量和程度不会显着变化。在醛固酮浓度为10^-6mol/L时，细胞数量和融合程度略有下降，但不显著。我们推测这一结果可能是由醛固酮对细胞损伤的影响造成的。第四种方法是流式细胞术分析细胞周期变化。我们检测了两种细胞系在不同浓度醛固酮刺激下不同时间的周期变化。各组的G2/M期无明显变化。

研究表明，醛固酮和盐对盐敏感高血压的发展具有协同作用。Shibata和同事[33]发现，在肾上腺切除术伴醛固酮灌注盐敏大鼠模型中，高盐可诱导Racl和醛固酮相互依赖，引起MR过度激活和血压升高。一些研究表明，盐也可以直接与MRs结合而不依赖于肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)。例如，对盐敏感的个体，高盐摄入量可以促进钠⁺通过直接激活MRS的重吸收独立于raas [34］．在盐敏感性高血压的啮齿动物模型中，高盐饮食显示激活Rac1，升高血压，并导致肾损伤，尽管抑制醛固酮。啮齿类动物肾脏中的Rac1 GTPase在盐敏感性高血压和工作中也是必不可少的通过先生依赖途径[35］．除了RAC1外，饮食中的高摄入量增加了糖皮质激素诱导的激酶1的血清水平，是MRS的下游效应器[36，在不依赖醛固酮的盐敏达尔大鼠中[37］．与高水平盐和不同浓度的醛固酮的组合刺激在本研究中未施用的醛固酮中的基团中的细胞数或细胞DNA含量没有造成显着变化。

5。结论

醛固酮增加了RTECs中PCNA的表达在活的有机体内但是，醛固酮没有增加HK2细胞或MDCT细胞中的PCNA表达。其他实验方法没有证明醛固酮对RTEC的增殖效应体外．因此，我们推测阻塞性肾病和其他CKD具有raas的激活，这不仅刺激了醛固酮的分泌，而且均分泌大量其他血管活性肽和细胞因子，如angii，Et-1和TGF-β1，参与细胞增殖。肾小管上皮细胞的增殖可以由不同的途径引起。醛固酮的激活是醛固酮的一种方式之一。是否涉及其他配体或与醛固酮配合的其他物质引起激活先生，这一现象是预期的，研究人员会注意它。

数据可用性

如果您需要本文的基本数据，可以通过电子邮件(qingyouxu@sohu.com.）。

伦理批准

伦理审定河北中医药大学医学伦理委员会(DWLL2018043)。

信息披露

提交的文章中表达的观点是我们自己，而不是机构或资助者的官方立场。

的利益冲突

作者声明在本文的研究、作者身份和/或出版方面没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

郝娟和刘凌锦对这项工作贡献相当。

致谢

我们感谢河北省河北中医大学肝肾图案河北省综合医学重点实验室。我们感谢Tatsuo Shimosawa教授（日本国际福利大学）提供MDCT细胞。作者披露了对本文的研究，作者和/或出版的以下财政支持：本工作得到了中国国家自然科学基金项目（授予号码81473652和81873251）。

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