血管紧张素ⅱ诱导分化的人类神经母细胞瘤细胞通过增加MAP2和ROS水平

文摘

介绍。的角色在大脑中血管紧张素ⅱ(Ang II)仍在调查之中。在这项研究中,我们调查了如果Angⅱ影响人类神经母细胞瘤细胞的分化同时激活的NADPH氧化酶和活性氧(ROS)。此外,我们调查了Angⅱ受体类型涉及在分化。方法。人类神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y; 细胞)暴露在Angⅱ为24小时(600海里)。分化是通过测量监控MAP2和NF-H水平。细胞大小和ROS被流式细胞术分析,和NADPH氧化酶激活使用apocynin化验(500μ米)。Angⅱ受体(ATR)激活化验使用ATR阻滞剂或Angⅱ代谢抑制剂(10⁷米)。结果。(1)细胞大小和II-treated细胞明显减少;(2)MAP2和活性氧显著增加Ang II-treated细胞没有生存能力的变化;(3)细胞内ROS MAP2明显减少与Angⅱ+ apocynin孵化。(4)显著减少MAP2观察细胞暴露于Angⅱ+ PD123.319 (AT2R拦截器)。结论。我们的研究表明,Angⅱ影响分化SH-SY5Y通过增加MAP2 AT2R。MAP2的增加和ROS也通过NADPH氧化酶介导的细胞死亡。

1。介绍

肾素血管紧张素系统(RAS)在大脑中一直强调有一个角色在一些神经退行性疾病的病理生理学。众所周知,Ang II,它的主要效应肽,在氧化应激中起着重要的作用,中枢神经系统炎症、神经损伤、细胞衰老和细胞分化[1- - - - - -4]。新兴证据支持Angⅱ是一个重要的中介不同哺乳动物细胞的细胞分化[5- - - - - -9]。吴等人,郑等人表明,Angⅱ促进小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞由心脏标记物表达水平增加,如GATA4临床[5),或为平滑肌细胞由平滑肌的表达水平增加标记如calponin [6]。此外,金等人透露,Angⅱ作为区分小鼠造血干细胞成髓细胞因子表达水平增加分析的趋化因子受体2型(CCR2) [7]。Angⅱ也能导致神经元分化神经突PC12W细胞产物,来自克隆的鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤肿瘤(PC12)用于一些研究监测神经元分化(8,9]。证实了细胞分化MAP2水平和增加β微管蛋白引起的蛋白质和II。

它也是众所周知,Angⅱ诱导活性氧产量在不同哺乳动物细胞(10- - - - - -12]。El Bekay等人发现,Angⅱ增强活性氧的生产在人类中性粒细胞孵化时浓度从10到1000海里一段1到10分钟(10]。其他报告记录,Angⅱ增加超氧化物含量大鼠系膜细胞暴露于Angⅱ(10⁸-10年⁵人类星形胶质细胞在100海里(M)和11,12]。尽管这些研究支持,Angⅱ在氧化应激激活作用,ROS生产之间的关系和分化诱导人神经母细胞瘤细胞的肽仍有待阐明。众所周知,ROS本身能够促进许多哺乳动物细胞的分化。Tsatmali等人发现胚胎大鼠皮层细胞表达高水平的活性氧引起的纤维母细胞生长因子2 (FGF2)分化成两种类型,大pyramidal-like神经元和小神经元表达核calretinin;然而,FGF2切除后神经元ROS水平较低分化成神经元、胶质细胞和星形胶质细胞在克隆的文化13,14]。此外,Katoh等人表明,缺氧增强神经元分化的信号生成活性氧PC12细胞(15]。

活性氧激活诱导的另一个需要考虑的重要方面和二肽采用的可能机制,增强了生产这些氧化应激的介质。几项研究显示,Angⅱ刺激ROS的产生通过NADPH氧化酶的活化在骨骼肌16),心血管系统(17),和大脑18,19]。Kazama等人报道,Angⅱ增加活性氧产量分离小鼠大脑微血管通过gp91phox包含NADPH氧化酶(18]。此外,太阳等人发现Angⅱ增加ROS水平通过在老鼠神经细胞NADPH氧化酶激活下丘脑和脑干区域(19]。虽然这些报告支持,NADPH氧化酶参与Ang II-induced ROS生产在不同的细胞,没有明确的数据可能存在的人类神经母细胞瘤细胞分化的作用。

基于这些观察结果,我们决定首先调查如果Angⅱ影响人类神经母细胞瘤细胞的形态和分化和细胞内ROS的产生而不影响细胞的生存能力。此外,我们分析了如果神经母细胞瘤的生成MAP2表达和ROS水平通过NADPH氧化酶的活化介导的。此外,我们研究了血管紧张素ⅱ受体的类型(ATR)参与Ang II-induced神经母细胞瘤分化。

2。方法

2.1。细胞大小通过显微镜和流式细胞术分析

人类神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)培养( 细胞)的最低基本培养基(MEM)补充10%胎牛血清在37°C公司为5%₂。当细胞达到70%的融合,他们暴露于盎II(600海里),和细胞大小是可视化使用evo®不健全细胞成像站(生活技术,圣胡安,公关)配备20 x固定目标和单色高灵敏度铁路联运CCD相机。捕获的图像在亮场模式下使用不健全的软件版本1.4(生活技术,圣胡安,公关)。细胞大小也通过流式细胞术分析。

2.2。分析MAP2 NF-H水平细胞暴露于Angⅱ

神经母细胞瘤细胞孵化与Angⅱ(600海里)24 h和MAP2和NF-H用单克隆抗体荧光标记特定的细胞骨架蛋白标记树突和轴突,分别。简单地说,细胞permeabilized使用BD Cytofix / Cytoperm™固定/透化作用解决方案工具包(BD生物科学,圣何塞,CA)然后用Alexa萤石孵化488 anti-MAP2(1: 1000)或Alexa萤石647 anti-NF-H (1: 1000) 1 h。这两个抗体购自BioLegend (CA)圣地亚哥。样品被流式细胞术分析。

2.3。AngⅱROS生产和细胞凋亡的影响分析

神经母细胞瘤细胞暴露于Angⅱ为24小时(600海里)。ROS是染色使用氧化应激检测试剂(绿色荧光)所描述的制造商(法明岱尔恩佐生命科学,纽约)。细胞凋亡的检测,SH-SY5Y resuspended annexin-binding缓冲区(10毫米玫瑰,140毫米氯化钠和2.5毫米CaCl₂,pH值7.4)的浓度 细胞/毫升。然后,5μL (Annexin-V异硫氰酸荧光素(FITC)共轭和5μL (propidium碘(PI)(4毫克/毫升)被添加到100μL细胞悬液和孵化在室温下15分钟。最后,400年μL annexin-binding缓冲区被添加并通过流式细胞仪样本进行了分析。

2.4。MAP2表达水平和活性氧引起的生产和II NADPH氧化酶抑制后

神经母细胞瘤细胞孵化和II(600海里)或Angⅱ+ apocynin (500μM;NADPH氧化酶抑制剂)24小时为了调查如果活性氧诱导的神经母细胞瘤分化和生成肽通过NADPH氧化酶介导。未经处理的细胞和那些暴露在药物仅被用作控制。MAP2水平或细胞内ROS水平用荧光标记的单克隆抗体或试剂,分别如上所述,然后通过流式细胞术分析。

2.5。MAP2 Angⅱ受体阻滞剂后表达水平或Angⅱ代谢抑制剂

调查如果Angⅱ的影响或其代谢物(Ang IV或Ang -(1 - 7)]对MAP2 AT1介导通过绑定,at₂, AT4,或Ang -(1 - 7)受体,细胞被孵化与Angⅱ(600海里)的存在与否洛沙坦(选择性AT1R拦截器;10⁷米),PD123.319(选择性AT2R拦截器;10⁷米),AP-N / CD13 4-tert-butylphenyl氢1-aminopropylphosphonate (N氨肽酶抑制剂;10⁷米),或者mln - 4760 (ACE2抑制剂;10⁷米)24 h。未经处理的细胞和那些暴露在药物仅被用作控制。所有药物都购自微孔σ(圣路易斯,密苏里州)。MAP2水平分析了使用特定的荧光单克隆抗体如上所述,然后通过流式细胞术分析。

2.6。流式细胞术

所有流仪分析进行了使用FACSAria血细胞计数器(BD生物科学,CA)。FACSDiva软件(BD生物科学,CA)是用于数据采集和多变量分析。SH-SY5Y细胞被封闭在向前/侧散射(FSC / SSC)点的阴谋,和细胞大小取决于获得FSC的平均峰值通道直方图。细胞内ROS, MAP2水平,或膜联蛋白V测量FL1(带通滤波器525海里),π是FL3测量(长传球670海里),和FL4 NF-H水平进行了分析(带通滤波器661海里)通道。散射参数数据和直方图获得日志模式。一万事件对每个样本进行评估,从FL1获得平均峰值通道和FL4直方图被用来确定细胞内ROS, MAP2, NF-H神经母细胞瘤细胞的水平。健康的百分比频率、早期凋亡晚期凋亡或坏死细胞点阴谋被用来决定细胞生存能力。

2.7。统计分析

数据表示为 。学生的 - - - - - -检验和方差分析。正常的人口和方差的同质性在每个方差分析之前进行测试。差异被认为是重要的时候 。数据规范化治疗组的均值。

3所示。结果

3.1。可视化Angⅱ治疗后的形态

人类神经母细胞瘤细胞暴露于盎II(600海里)24 h在亮场显微镜可视化。形态变化在细胞大小和形状后在显微镜下观察细胞孵化Angⅱ(图1(b))相比,未经处理的(图1(a))。soma细胞大小与神经突细长的减少和II的处理。流式细胞仪获得的直方图显示神经母细胞瘤细胞的大小差异之前和之后孵化Angⅱ(图1(c))。显著减少大小( )观察接触Angⅱ一段后24 h(图1(d))。

3.2。MAP2和NF-H水平Ang II-Treated神经母细胞瘤细胞

细胞孵化与Angⅱ(600海里)24 h,和MAP2 NF-H水平衡量流式细胞仪监测神经母细胞瘤分化。我们的数据显示,MAP2水平显著增加,当细胞受到Angⅱ( 小额信贷机构; )相比未处理( 小额信贷机构)(图2(a))。没有观察到显著差异水平的NF-H ( MFI)当细胞受到盎II比未经处理的( 小额信贷机构)(图2(b))。

3.3。Ang II-Induced ROS水平和细胞生存能力

神经母细胞瘤细胞孵化和二世在600 nM 24 h,细胞内活性氧的水平和健康的比例,凋亡、坏死细胞被流式细胞术量化。我们的数据显示,当细胞ROS水平大幅提高受到盎二世在600 nM ( 小额信贷机构; )相比未处理( 小额信贷机构)(图3(a))。另一方面,我们的结果表明,健康的百分比,凋亡、坏死细胞相似的Ang II-treated细胞和参与组织(图3(b))。

3.4。NADPH氧化酶的抑制效果和II-Induced MAP2表达水平和ROS生产

细胞培养与Angⅱ(600海里)的存在与否apocynin (500μ米)24 h, MAP2或细胞内ROS水平通过流式细胞仪测定。我们的数据显示,MAP2水平显著增加时,神经母细胞瘤细胞暴露在独自Angⅱ( 小额信贷机构)比未经处理的( 小额信贷机构)。另一方面,明显降低MAP2水平观察细胞孵化时Angⅱ+ apocynin ( 小额信贷机构; )相比单独细胞孵化和二世。MAP2水平无显著变化观察神经母细胞瘤细胞间孵化Angⅱ+ apocynin ( 小额信贷机构)和单独apocynin ( 小额信贷机构)(图4(a))。同样,ROS水平显著增加细胞孵化时单独使用Angⅱ( 小额信贷机构)比未经处理的( 小额信贷机构),明显降低时观察到的细胞暴露在Angⅱ+ apocynin ( 小额信贷机构; )相比单独细胞暴露于Angⅱ。此外,ROS水平无显著变化观察细胞间接触和II + apocynin ( 小额信贷机构)和单独apocynin ( 小额信贷机构)(图4(b))。

3.5。Angⅱ受体拮抗对MAP2水平的影响

我们首先调查如果MAP2 Angⅱ的影响是通过其绑定到或at₂AT1受体介导。为此,细胞被孵化与Angⅱ(600海里)的存在与否洛沙坦(10⁷米)或PD123.319 (10⁷米)24 h, MAP2水平通过流式细胞仪测定。我们的研究结果表明,MAP2水平显著下降,当细胞与Angⅱ+ PD123.319孵化( 小额信贷机构; )相比单独细胞孵化和二世。然而,没有观察到显著变化MAP2水平之间的神经母细胞瘤细胞孵化与单独Angⅱ( 小额信贷机构),Angⅱ+洛沙坦( 小额信贷机构)(图5)。

在其他的实验中,我们调查了如果Angⅱ的影响或其代谢物MAP2介导通过其绑定到AT4或Ang -(1 - 7)受体使用抑制剂Angⅱ代谢。为此,细胞暴露于盎II(600海里)的存在与否AP-N / CD13抑制剂(10⁷或mln - 4760(10米)⁷米)24 h。MAP2水平无显著变化观察到当细胞受到单独Angⅱ( 小额信贷机构)相比Angⅱ+ AP-N / CD13抑制剂( 小额信贷机构)或者Angⅱ+一个mln - 4760 ( 小额信贷机构)(图6)。

4所示。讨论

大脑中的许多角色和二世尚不清楚。氧化应激激活的肽被认为是一个中介,可能导致神经炎症,但其行为在其他系统可以从血管收缩,交感神经激活,钠和液体潴留,心脏重建、细胞生长、细胞分化[20.- - - - - -22]。虽然氧化应激诱导的激活和二世一直在研究不同的哺乳动物细胞,没有明确的数据使用的机制和二世在神经母细胞瘤分化及其与ROS生成之间的关系。

人类神经母细胞瘤细胞暴露在我们的研究中,我们在600 nM Angⅱ,形态大小和形状的变化和有趣的是在显微镜下观察和流式细胞术当细胞被证实了孵化和二世一段24小时。细胞soma大小降低了Angⅱ治疗,但同时,探明从胞体观察,表明一个激活的细胞分化。确认和II能够诱导神经母细胞瘤分化,我们分析的表达MAP2(神经元分化的一个标志,稳定微管在postmitotic神经元的树突)(23,24]和NF-H亚基(标记神经元分化所需的径向增长轴突)(25,26]。我们的数据显示在MAP2表达水平显著增加神经母细胞瘤细胞与Angⅱ孵化24小时;然而,没有观察到显著变化NF-H水平相比,未经处理的细胞。这些结果与其他研究是一致的,使用MAP2水平监测和二世在神经元分化的影响。作为一个例子,Ang II能够促进PC12W神经元分化细胞,克隆大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤肿瘤的几项研究中使用监测神经元分化。证实了老鼠PC12W细胞神经元的分化增加神经突伸长(27)和聚合β微管蛋白和MAP2水平(9]。

另外,我们观察到,Angⅱ在600 nM显著增加细胞内ROS水平孵化24 h后神经母细胞瘤细胞的分化。还说,是很重要的在此期间没有观察到的细胞死亡。因此,ROS的可能性可以作为第二信使负责不能排除神经母细胞瘤细胞的分化(28,29日]。李等人报道,NADPH氧化酶产生的ROS同种型Nox4激活p38-MAPK和驱动核易位的心脏肌细胞增强因子转录因子2 c (MEF2C)导致CGR8心肌细胞分化细胞(28]。此外,肖等人证明Nox4-derived ROS调解ES-D3细胞的分化,克隆老鼠胚胎干细胞来源于胚泡,为平滑肌细胞通过促进upregulation表达和血清的磷酸化反应的元素(SRF)和驾驶的易位SRF成核基因转录(29日]。

在我们的研究中,我们还研究了如果神经母细胞瘤引起的活性氧的生产和二世是通过NADPH氧化酶介导的。我们观察到,Angⅱ下降引起的活性氧的水平时,细胞NADPH氧化酶抑制剂孵育,apocynin。许多研究都集中在NADPH氧化酶的作用在细胞内ROS生产。在血管细胞的研究表明活性氧生成诱导Angⅱ涉及的信号通路的激活,包括NADPH氧化酶(30.)、蛋白激酶C (PKC) [31日],Rac-1 [32]。Lijnen等人也证明了Angⅱ增加超氧化物阴离子和活性氧的生产在心脏成纤维细胞NADPH氧化酶激活,一个效果由apocynin废除(33]。此外,Thakur等人表明,急性Angⅱ刺激30分钟(100海里)促进活性氧产量NADPH氧化酶同种型Nox2内皮细胞与小鼠(34]。其他研究星形胶质细胞细胞显示Angⅱ增加活性氧和过氧化物水平通过NADPH氧化酶浓度和时间的方式(12]。我们与这些研究结果可比由于apocynin NADPH氧化酶的抑制减少ROS水平增加了Angⅱ的分化成神经细胞瘤细胞。

我们的数据也支持,NADPH氧化酶的活化Angⅱ参与神经母细胞瘤细胞的分化。这是确认当我们分析了MAP2水平细胞暴露于Angⅱ+药物apocynin。尽管我们发现ROS和MAP2水平增加同时通过NADPH氧化酶的活化和II,受雇于ROS的机制在神经母细胞瘤分化需要更多的调查。

在我们的研究中,我们还研究了血管紧张素ⅱ受体的类型(ATR)参与神经母细胞瘤分化。为此,我们使用AT1 at₂受体阻滞剂或Angⅱ代谢抑制剂与可能的肽或其代谢物的影响相应的受体。我们观察到的水平MAP2 Angⅱ下降引起的细胞at₂孵育时受体阻滞剂(PD123.319)没有改变当他们暴露在肽+洛沙坦(AT1R拦截器),AP-N抑制剂或ACE2抑制剂。尽管大多数已知的生化和细胞反应和二世在许多组织已经发现被AT1受体介导,肽的行动及其代谢物在大脑中尚未定义。研究表明,at₂受体广泛表达于胎儿胎盘单位,但发现在成人组织中处于非常低的水平35]。这种受体的高丰富胎儿也是暂时性的啮齿动物中表达,表明at₂Angⅱ可以作用在开发过程中受体和细胞分化36]。例如,这种受体的激活可以诱导神经突形成和神经分化在体外从大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12W和胎鼠神经元(9,37]^,revin [38]。在人类中,at₂受体的突变被发现在女性或男性精神发育迟滞患者,与大脑发育和成熟39,40]。

5。结论

我们的研究结果支持的重要性理解受雇于Angⅱ在神经母细胞瘤分化的机制和活性氧生成,可能有助于开发新的治疗方法在病理条件下促进本次。

数据可用性

数据支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

谢谢塞巴斯蒂安·佩雷斯,Jennifer Mendez-Estrada安德里亚·Delgado-Nieves NIGMS-RISE UPR MSC程序,RCMI UPR MSC程序,和马克UPR RPC程序请提供支持的手稿。这项工作是由美国国立卫生研究院的资助数字R01NS099036 R25GM061838 U54MD007600 5 t34gm007821-34。

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