文摘

盘尾丝虫病是一种寄生感染影响全球人口相对较小但非常严重的病理结果。伊维菌素和最近该药是唯一药物批准用于临床疾病的管理,两者都有一些局限性。特别是,他们是有效的对微丝蚴(microfilaricidal)没有活动对成虫(nonmacrofilaricidal)。有前途的打虫药活动一直在报道一些地衣。本研究调查了三个地衣,松萝关节动物,Parmotrema tinctorum,Heterodermia obscurata喀麦隆、山上,发现潜在的macrofilaricidal活动。有机提取筛选anti-Onchocerca活动盘尾属ochengi孤立的从牛的皮肤使用蠕虫能动性和MTT甲瓒化验。高度活跃的提取物的毒性进行了调查在猴肾上皮细胞(LLCMK2)和BALB / c小鼠(2000毫克/公斤体重)包括对肝酶的影响。的甲醇提取物p . tinctorum(Pam_见过对成年雄性蠕虫()是最活跃的 μ最高的g / mL)选择性指数( )。美国关节动物是最活跃的成年女性( μg / mL),但有一个低SI值(3.4)。没有死亡率和不良反应记录的急性毒性试验。这两个最活跃的提取物对肝酶无显著影响,丙氨酸转氨酶和天冬氨酸(值< 0.05),但高AST: ALT Pam的比率(2.59)_见过表明可能可逆不利的肝毒性。macrofilaricidal高的活性和选择性p . tinctorum表明它是一个潜在的新macrofilaricides来源应该进一步调查确定其生物活性成分。

1。介绍

盘尾丝虫病(河盲症)引起的盘尾属肠扭结、传染性丝虫特性在世界卫生组织的被忽视的热带病1]。感染是普遍的在一个相对较小的地理区域(热带非洲中东部分地区的99%和1%,中美洲和南美洲)和人口风险小(1.6亿)相比常见的传染病。尽管如此,这种疾病有毁灭性的疾病包括严重的皮炎、瘙痒,和伟大的医学的重要性,视力障碍,和随后的失明没有早期化疗治疗(2,3]。因此具有很高的负面经济影响尤其在河边的人口主要从事农业。

矢量控制规划后辅以过程用伊维菌素治疗有显著成绩在减少疾病的负担和负面影响,但盘尾丝虫病尚未消除3]。化疗仍对活动性疾病的主要工具,但面临两个挑战,也就是说,缺乏合适的anti-Onchocerca药物和新兴伊维菌素耐药性的威胁,而直到最近是唯一推荐的药物治疗的疾病在过去三十年里4]。此外,伊维菌素,虽然非常有效,只对其效果的微丝蚴没有杀死成虫即使长时间重复治疗剂量(5)和生产领域的严重不良事件贷款贷款coendemicity。该药最近,伊维菌素的化学模拟,通过对盘尾丝虫病也microfilaricidal临床使用和潜在的严重毒性6]。因此,需要新的有效和安全anti-Onchocerca代理仍然很高。

努力发现anti-Onchocerca代理商特别是macrofilaricides包括筛选天然产物和有前景的结果(7]。感兴趣的是地衣antihelminthic活动没有进行了广泛的调查。您正在和Sudha8重要的驱肠虫的活动报道Heterodermia boryimacrolichen反对印度蚯蚓Pheretima posthuma。类似的结果被报道Kumar et al。9),对同样的蠕虫。因此,本研究筛选原油提取三种地衣松萝关节动物(l)Hoffm,Parmotrema tinctorum(Despr。Nyl交货)。黑尔,Heterodermia obscurata(Nyl)。特列维,诺沃Giorn,不是之前检测anti-Onchocerca活动使用在体外模型中,盘尾属ochengi,一个已知的近亲o .肠扭结。活跃的细胞毒性和急性毒性地衣也被调查。在进一步的研究中,化合物活性提取物将孤立和调查的发现潜在的新的有效的药物治疗盘尾丝虫病。

2。材料和方法

2.1。提取制备和植物化学的分析

三个地衣,松萝关节动物(l)Hoffm,Parmotrema tinctorum(Despr Nyl交货)。黑尔,Heterodermia obscurata(Nyl)。诺沃Giorn特列维,收集2018年9月,从喀麦隆和山被Ayuk伊丽莎白Orock博士,一个系的Lichenologist植物学、布埃亚大学理学院。描述的提取同样为软化et al。10]。短暂,地衣切碎,风干在树荫下四个星期,和磨成粉。每个粉末浸渍顺序在己烷其次是甲醇和滤液通过旋转蒸发浓缩(68°C和己烷和甲醇65°C,分别),干燥,称重,并存储在冰箱4°C到测试。植物化学的分析来确定化学类次生代谢物的描述(11]。

2.2。测定Anti-Onchocerca活动

完全培养基(CCM)是使用含有碳酸氢钠的RPMI 1640媒体准备的。消息灵通的补充以25毫米,0.3 gγ辐照谷酰胺粉,5%的新生牛血清(国家统计局)、青霉素200单位/毫升,200年μ0.25 g / mL链霉素,μg / mL两性霉素B;pH值7.4。不完全培养基(ICM)不包含国家统计局。所有试剂使用来自Sigma-Aldrich。所有的实验都做两次。

2.2.1。对于成虫化验

这是描述(12)做了一些调整。短暂的、新鲜的感染脐牛皮肤从屠宰场购买在杜阿拉和布埃亚,喀麦隆、清洗和消毒的无菌罩板流。结节切除,很仔细,恢复蠕虫群众被淹没在2毫升完成培养基12-well文化板块(美国NUNC)。一夜之间,盘子被孵化的37°C, 5%的公司₂heracell - 150我孵化器(美国),在此期间雄性蠕虫出现在大众媒介和女性仍在。文化之后,蠕虫和不育的可行性进行了评估采用倒置显微镜(Eclipse TS100尼康,中国)前测试和1毫升的CCM添加在每个包含蠕虫。主屏幕做是为了消除活性提取物。每个提取(25毫克/毫升股票在二甲亚砜,DMSO)稀释在CCM 4 x最终测试浓度添加(1毫升)一式三份,一个成年人蠕虫在3毫升CCM /给500年的最终浓度μ克/毫升。积极的(10μ金诺芬)和消极的控制(RPMI 2% DMSO)包括在内。上面的板是一样培养5天,和男性蠕虫可行性评估使用基于虫蠕动的倒置显微镜;抑制活性的得分如下:100%(没有能动性),75%(只是偶尔头或尾巴摇动),50%(全虫能动的,但缓慢),25%(只在活性变化不大),0%(无运动性可观察到的变化)。活动对女性蠕虫被视觉评估估计百分比抑制甲瓒孵化后形成的虫500年大众μL(0.5毫克/毫升MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)30分钟(13];活动分数范围从100%寄生虫杀死(没有蓝色甲瓒颜色),90%,75%,50%,25%,0%(负控制整个虫出现蓝色)。提取活动基于蜗杆运动性或甲瓒形成分级如下: 抑制;适度活跃的50 - 89% 抑制。第二个屏幕完成提取100%的活动在主屏幕通过重复实验系列稀释8浓度(3.91至500人μg / mL),确定集成电路₅₀值(14]。

2.2.2。分析在微丝蚴

这些都是对成虫进行了同样的分析详细描述之前的研究(13,14与猴肾脏上皮)(美国弗吉尼亚LLCMK2,写明ATCC)细胞作为支线层。短暂,细胞在CCM,直到完全汇合的激增,中浆,细胞脱落和0.125%胰蛋白酶和0.5毫米的EDTA ICM然后离心两次( 分钟)。细胞悬液被转移到96 - microtitre文化板块(100μ信用证上面)和孵化成长,直到完全汇合的。微丝蚴(mf)隔绝牛皮肤详细描述(13,14),悬浮在CCM,分布在96孔板(约15 mfs / 100μL CCM /包含LLCMK2细胞层),及其可行性和不育确定了24小时之前提取。每个提取的解决方案是在重复井在500进行测试μ克/毫升。积极的和消极的控制包括孵化如上紧随其后。曼氏金融的可行性被意味着运动性得分每日5天以上。第二个屏幕做了类似的(14)的成虫确定集成电路₅₀只有一个提取的价值。

2.3。细胞毒性测试

这也是使用猴肾上皮细胞(15]。简而言之,这些细胞被处理和发展融合如上所述乘96孔板一式两份。中被替换为新的CCM,提取被添加在最后3.9063 - 500的浓度μ克/毫升。积极的和消极的控制包括孵化5天同上紧随其后。中被丢弃,井被摇晃decolorised与ICM (IKA Labortechnik KS125基本瓶)在600 rpm 5分钟两次。MTT (100μL 1毫克/毫升的ICM)补充道,和上面的板被孵化为2小时。中被丢弃,100μL DMSO溶液添加到甲瓒溶解沉淀,和板轻轻摇动混合内容。光学密度在595 nm,抑制百分比计算使用公式:

2.4。急性口服毒性试验

这样做是最活跃的提取物的成虫,己烷提取美国关节动物,和甲醇提取的p . tinctorum每一个在2% DMSO(描述15,16]。指南423年经济合作与发展组织(oecd)版本随访和伦理批准机构获得动物保健和使用委员会,布埃亚大学(UB-IACUC N^O014/2019)。短暂,十五BALB / c小鼠组成一个控制和两个测试五组(9周大,两个女性每组)和三个雄性动物屋的研究实验室被与会的一周。每个测试组一个动物禁食隔夜水提供和管理2000毫克/公斤体重由口腔填喂法提取,进一步观察到的15]。没有死亡或严重不良毒性24小时后,其他四个测试动物禁食和治疗相同。所有的动物被观察到的总变化和不良的迹象毒性为14天。然后,一夜之间,动物被禁食和氯胺酮麻醉/甲苯噻嗪(90/10毫克/公斤),和血液被收集retroorbital出血。血液凝固了30分钟和离心机( ),肝酶的活性,丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶测定使用Biorex诊断包(联合王国),遵循制造商的指示。

2.5。数据分析

Filaricidal活动数据分析使用GraphPad Prism 5.0软件(美国)获得IC₅₀活跃的提取物。提取液浓度的对数是对活动策划,获得非线性回归曲线拟合和可变斜率s形的剂量反应曲线。CC₅₀(浓度50%的细胞死亡)是源自一个阴谋%抑制的可行性对生成日志提取浓度使用相同的软件。酶活性进行了分析使用相同的软件,和一个未配对的双尾 - - - - - -测试是用来检查任何显著差异( )之间的控制和测试组。

3所示。结果

3.1。产量和植物化学的提取物的成分

的甲醇提取物p . tinctorum产量最高(12.9%),甲醇提取的h . obscurata最低收益率(1.1%)、表吗1。皂苷、类固醇、类黄酮和单宁的共同和相对丰富的类次生代谢产物粗提取物的地衣。发现只有在己烷提取的生物碱美国关节动物(美国_十六进制)。

3.2。Anti-Onchocerca活性提取物

所有6提取筛选,享年500岁μg / mL积极反对成人男性和女性ochengi蠕虫抑制100%在这两种情况下的主屏幕上。在二级屏幕,IC₅₀值从8.1到52.4不等μ成年雄性蠕虫g / mL;的甲醇提取物p . tinctorum(Pam_见过与IC)是最活跃的₅₀值为8.1μ克/毫升。集成电路₅₀在成年女性蠕虫从36.3到115.2不等μg / mL;己烷提取的美国关节动物(美国_十六进制以IC)是最活跃的₅₀值为36.3μ克/毫升(表2)。提取显示活动存在剂量依赖的相关性作为最活跃的提取图说明1,对成年雄性蠕虫整体较高的活动。当集成电路_{One hundred.}被认为是,提取的p . tinctorum(Pam_十六进制和帕姆_见过对成年雄性蠕虫()是最活跃的 μg / mL),提取的美国关节动物(美国_十六进制和美国_见过)对成年女性最活跃的蠕虫( μg / mL),展示活动(表的一致性2)。

微丝蚴,所有6提取筛选,享年500岁μg / mL还显示100% anti-Onchocerca活动。集成电路₅₀对微丝蚴只有甲醇提取物的决定松萝关节动物(美国_见过)值为101.8μ克/毫升。

3.3。毒性的提取

3.3.1。细胞毒性

五提取CC₅₀值大于缺乏细胞毒性的分界点( μg / mL) (17),和一个提取(Het_十六进制)有一个CC₅₀价值低于30μg / mL表示轻微的细胞毒性(表2)。所有提取显示,相对较低的选择性和SI值从1.08到3.89的成年雄性和雌性的甲醇提取除外p . tinctorum(Pam_见过),显示出高选择性指数(21.33)。提取的h . obscurata更与SI对哺乳动物的肾脏细胞的毒性 。在ochengi美国微丝蚴_见过记录一个SI值为1.25。

3.3.2。急性毒性

最活跃的提取物,Pam_见过和美国_十六进制,在ochengi成年雄性和雌性蠕虫,分别显示没有急性毒性的迹象在2000毫克/公斤体重Balb / c小鼠治疗后14天。这些动物postdosing前两小时内缓慢,但没有在第14天死亡率记录。与控制的老鼠相比,摄入的食物和水是相同的。增加小鼠的平均重量控制和测试组,但在14天组之间的差异没有统计学意义( )。没有改变外表,行为,皮毛,观察皮肤,粘膜和体育活动。

3.3.3。提取物对肝酶的影响

为了比较的己烷提取物对肝酶的影响美国关节动物(美国_十六进制),这是最活跃的对女性蠕虫,一个未配对的双尾 - - - - - -测试是为天冬氨酸转氨酶(AST)在95%置信区间( )因为控制和测试组有相同的方差。这也是为丙氨酸转氨酶(ALT)和韦尔奇的修正,因为变化是不一样的。之间没有显著差异(2% DMSO)和控制测试(美国_十六进制)组织AST和ALT值0.77860和0.5943分别如图2。AST: ALT的意思是测试组的酶活性比= 0.54,表明没有不利影响小鼠肝脏是< 1。

也没有发现显著差异之间的控制和老鼠Pam处理_见过体重( ),和酶活性AST和ALT值0.59和0.52分别如图3。然而,AST: ALT比率是2.59表明肝脏的不利影响。

4所示。讨论

盘尾丝虫病的化疗仍然是一个挑战,鉴于可用filaricides数量非常有限。本研究筛选提取三种地衣filaricidal分子考虑他们的潜在来源广泛的抗菌和驱虫剂演示活动8]。本研究记录高anti-Onchocerca活动地衣的甲醇提取物,p . tinctorum成年雄性蠕虫,选择性高。此外,适度活动显示了己烷提取的美国关节动物对成年女性选择性相对较低(表2)。这是第一次报告的anti-Onchocerca活动研究地衣来自喀麦隆山。

所有的精华都积极与IC对成虫₅₀值低于100μg / mL除了一个(甲醇提取的h . obscurata)。总的来说,地衣中提取更积极的对成年雄性蠕虫(降低集成电路₅₀比女性。这种差异可能是由于规模较小的雄性蠕虫允许更大的渗透和生物利用度的蠕虫组织生物活性次生代谢产物的提取,通过目标(s)或行动中独特的存在需要进一步调查的男性。的有前途的性质p . tinctorum值得进一步调查。这可能会产生一个有效的macrofilaricide杀死雄性蠕虫会阻止受精后的女性,因此废除微丝蚴的生产。由此产生的效果会明显改善病人的福利,因为微丝蚴主要负责盘尾丝虫病的毁灭性的病理。提取的部分筛选微丝蚴还显示活动反对这个蠕虫舞台指示潜在的宏观和microfilaricidal活动地衣测试。进一步的研究将充分评估其microfilaricidal完成活动。的研究p . tinctorum包括其他Parmotrema物种发现在马来西亚弱抗菌活性地衣,与其他两个的提取和孤立的纯天然产品相当活跃18]。本研究结果进一步支持的驱虫剂潜力地衣报道(8]。

细胞毒性测试显示一个微不足道的所有的风险,但提取(己烷提取h . obscurata), μ克/毫升(17]。然而,只有一个(甲醇提取的p . tinctorum成年雄性蠕虫)显示高选择性(表2)。这可能是由于定量(产量)和定性(化学成分)的植物化学物质的差异p . tinctorum相比其他地衣(表1)。相对丰富的植物化学物质(皂苷、丹宁酸、黄酮类化合物和类固醇),发现(表1),可能负责观察打虫药的效果,应该孤立和特征。

最活跃的两个提取物对雄性和雌性没有造成死亡的老鼠没有不良反应观察治疗。作为证据缺乏逆境,没有显著差异之间的肝酶的活动控制和测试组数据2和3)。AST: ALT比(0.54)对小鼠接受己烷提取的美国关节动物小于1的进一步指示没有毒性肝脏(19]。然而,高AST: ALT比2.59的甲醇提取物p . tinctorum表明线粒体损伤小鼠肝细胞释放大量的AST进入血液(19]。因为没有死亡率和不良严重影响观察的迹象,这表明肝细胞的损害可能是可逆的考虑肝脏储备容量高。的剂量2000毫克/公斤的治疗剂量远高于10毫克/ 70公斤的身体伊维菌素用于治疗盘尾丝虫病和旨在揭示人类的潜在毒性最高安全剂量。急性毒性的研究Stachytarpheta cayennensis提取高剂量(2500 - 5000毫克/公斤)在大鼠高AST报道:ALT 死亡率为零但重要的组织病理学变化相比,控制动物表明肝损伤(20.];这被认为是严重毒性更高的剂量可能是致命的。王等人。19]证明增加AST: ALT比碳tetrachloride-induced肝损伤有明显的组织病理学变化,增加炎症和损耗控制相比,小鼠的抗氧化生物标志物。使用药理代理人所有病变明显逆转,表明高AST: ALT比指出,严重的可逆损伤可能是严重和致命剂量更高。也有相当多的实验证据对乙酰氨基酚损伤后肝细胞增殖的21];这或许可以解释在小鼠无死亡的结果尽管严重伤害的证据。

5。结论

本研究揭示了成年男性高的活性和选择性ochengi虫,p . tinctorum发现在喀麦隆山;因此,它是一个潜在的新macrofilaricides来源。在这个地衣次生代谢物应该孤立进一步化学驱虫剂表征。的相当大的活动美国关节动物对雌虫也应进一步探讨。

数据可用性

所有数据的工作可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

确认

我们承认科学的生物技术单位的教职工,布埃亚大学为技术和物资援助。实现这项工作作为研究活动的一部分,作者在布埃亚大学,国家机构在喀麦隆的高等教育。