乙酸乙酯提取物的体内外研究菖蒲属菖蒲(甜旗)根茎刚地弓形虫

摘要

背景.弓形虫病是一种人群病变，可引起人类特殊胎儿持续时间和免疫缺陷条件的各种表现形式。由于目前处理的毒性和副作用，我们在体内评估了乙酸乙酯提取物的体外影响菖蒲属菖蒲根状茎（根茎）刚地弓形虫.方法.工厂，Acorus Calamus，是春季在伊朗北部的沙里采集的。采用索氏装置从植物根茎中提取乙酸乙酯。采用福林法测定提取物中总酚和黄酮的含量。不同浓度的死亡率(1-256μ.提取物的g / ml）弓形虫通过流式细胞术和碘化丙啶染色评估速殖子。为了评估治疗效果，将速殖子腹腔接种于小鼠，然后这些小鼠口服和腹腔注射不同浓度（32、64、128和256 此外，感染组接受PBS（包括1%二甲基亚砜）作为阴性对照，感染组接受磺胺嘧啶作为阳性对照。对于该提取物的毒性评估，一组仅接受256剂量 毫克/千克。结果植物提取物富含酚类化合物( ),然而，它含有较少的黄酮类化合物( ).体外实验结果显示，寄生虫的浓度与死亡率呈反比关系( ).最高百分比（62％）死于提取物的最大浓度。显着的寿命（8.9天）属于口服施用提取物剂量的小鼠（256毫克）/公斤/天)。结论.乙酸乙酯提取物菖蒲根状茎具有明显的抗弓形虫在体外或体内的活动。它可以连接到大量的酚类化合物。我们认为将在寄生虫上评估不同分数和提取物的疗效的影响。

1.介绍

弓形虫病是一种具有全球患病率的人群寄生疾病，其造成的普及造成的细胞内突出植物;刚地弓形虫. 弓形虫病的临床先天性表现为流产和早产、脑积水、小头畸形、黄疸以及婴儿的脉络膜视网膜炎、贫血、肺炎和颅内钙化。弓形虫病也可导致免疫缺陷患者的严重疾病，如HIV阳性和癌症患者，以及因使用免疫抑制剂治疗而接受移植的患者[1.–4.］.

目前弓形虫病的治疗与一系列副作用有关，如妊娠毒性和骨髓抑制、需要长疗程以及对寄生虫囊型缺乏影响[5.]由于化学药物的毒性和人们使用传统药物和方法的倾向，世界上对草药和传统方法进行了许多研究[6.］.菖蒲属菖蒲（甜旗）在中国和印度用作传统药用草药。美国本地人，干根及其粉末，鼻子抑制粘膜炎症[5.,7.].本品的其他药理特性菖蒲含抗炎、解热、止泻、抗诱变、抗细胞和免疫抑制、杀幼虫、抗菌、抗溃疡和细胞保护[8.］.豆科植物的根茎和叶油菖蒲在印度下喜马拉雅地区已报道，主要化合物在根茎油，而β-细辛酮和芳樟醇的叶油[9］.乔希等人展示了香精油菖蒲及其主要化合物β-细辛醚，对病原菌和真菌有杀菌作用[10］.根茎的Zhelmintic和抗菌性质可能属于苯丙醇β-细辛脑[11］.进行该研究以确定乙酸乙酯提取物的乙酸乙酯提取物的影响菖蒲属菖蒲在刚地弓形虫体内和体外。

2.材料和方法

2．1．伦理批准

本研究基于实验动物的护理和使用指导性[12西拉兹医科大学动物实验伦理委员会批准了这项研究项目（许可号IIR，和，R.1398355）。

2.2.样本的收集

几批新鲜植物的根茎菖蒲属菖蒲是2015年3月在伊朗北部Sari市的高海拔森林地区准备的。鉴定工作在设拉子医科大学药学院进行。植物的部分被晒干并磨成粉末。植物标本室标本采集于马扎达兰大学(Payam Noor University of Mazadaran)，干根茎标本(编号:MPRCM-94-87)保存于设拉子医科大学药用植物加工研究中心。

2．3.提取

根状茎阴干(26℃，2周)。为制备乙酸乙酯提取物，将干燥部位的粉末30 g倒在含有600 ml乙酸乙酯的黑暗消毒卡托什中。用索氏提取器提取。索氏法的每一步都要延长约6个小时。提取液经旋转蒸发器浓缩后，真空速干48小时。提取液在2-8°C的深色瓶中保存。

２.４.寄生虫

RH强毒株弓形虫是伊朗德黑兰医学科学大学提供的。RH菌株的速殖子弓形虫通过BALB/c近交系小鼠连续的腹腔传代维持。72小时后，10小时^6.用pH为7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)反复冲洗腹腔，收集速殖子。收集速殖子，室温下200 g离心5 min，去除腹膜细胞和细胞碎片。收集上清，800 g离心10分钟[1.］.将富含寄生速殖子的颗粒用PBS回收并用于实验。

2.5.细胞外活性测定

我们将提取物溶解在DMSO中，然后PBS，得到最终浓度为10 mg/ml。DMSO的最终浓度不应超过1%。不同浓度(25,50,100,200,400,800μ.G /ml)，按2.5 ~ 80μ.将最终浓度的l添加到920-997.5中 μ.l的PBS tachyzoites。将Tachyzoites与DMSO（作为对照）或在4℃下的稀释化合物温育1.5小时。接下来，在EPPendorf管中收集Tachyzoites，并在4℃下孵育30分钟 μ.G / ml碘化丙啶（PI，Sigma公司，美国）。孵育后，将寄生虫在冰上和黑暗中保持直至分析。通过在0.2％皂苷存在下孵育寄生虫来获得PI染色的阳性对照。将细胞悬浮液转移到聚苯乙烯流体调量管（BD Falcon公司，USA）中。我们进行了数据采集和分析，具有FACS Calibur流式细胞仪（Becton-Dickinson，San Jose，USA）和Cell Quest Pro软件。以前建立的区域中共有1000-30000个事件，与寄生虫相对应这一区域[13]。所有测试均一式两份进行。

2.6.体内实验

在该研究中，考虑了总共9组，包括10balb / c自粘小鼠。 将速殖子皮内接种分为8组，包括10只小鼠。根据体外实验结果，分为6组，剂量分别为32、64、128和256 mg/kg，口服，剂量分别为128和256 mg/kg，腹腔注射：VII接受磺胺嘧啶作为阳性对照，VIII接受PBS，包括DMSO 1%。这些浓度在接种后24小时每天给药，连续给药10天。在接种后对小鼠进行15天的跟踪观察。如果小鼠死亡，则用Giemsa s对其肝脏接触涂片进行染色tain，并在光镜下观察寄生虫检测[13］.

2.7.提取物的急性毒性试验

对于该提取物的毒性评估，一组仅接受最大剂量（256 然后，在最初4小时内观察小鼠的任何表现，包括舔爪子、全身伸展、流涎、虚弱、呼吸窘迫、睡眠、昏迷和死亡，随后每天观察14天。

2.8。提取物中总酚含量的测定

采用Folin–Ciocalteu法和Folin酚试剂测定提取物的总酚含量。本实验中，以大蒜酸为标准。首先，连续稀释大蒜酸（0.024,0.03,0.075,0.105 mg/ml）由甲醇提供，然后用Whatman 1级滤纸过滤。0.5 用2.5%稀释不同浓度的ml Folin–Ciocalteu试剂和2毫升 在20°C下添加7.5%（w/v）碳酸钠ml。在765°C下测量吸光度 所有试验一式三份，并绘制校准曲线。500 μ.用2.5%稀释粗提取物的L Folin–Ciocalteu试剂和2毫升 在20°C下添加7.5%（w/v）碳酸钠ml。在765°C下测量吸光度 根据校准曲线计算总酚含量。

2.9。总类黄酮含量

250mg干粉用20ml稀释后超声15分钟。将提取液过滤，其中5ml与5ml 2% (w/v) AlCl混合_3.溶液在黑暗条件下15分钟。在415℃下测量吸光度 根据槲皮素的校准曲线计算总黄酮含量。

2.10.数据分析

数据采用SPSS软件收集(版本16，美国芝加哥)。体外结果采用Kuruskal-Wallis和Spearman相关检验，而体内结果采用Kaplan-Meier和log rank (Mentel-Cox)。 被认为具有统计学意义。

3.结果

在这项研究中，死亡率弓形虫不同浓度乙酸乙酯提取物对速殖子细胞的影响菖蒲属菖蒲采用流式细胞术测定。

数据1.和2.结果表明，寄生虫速殖子的浓度和死亡率之间存在着反比关系弓形虫在最大浓度（256）下杀死速殖子 μ.g/ml）₅₀对寄生虫的提取物进行了计算 (μ.g/ml）。

体内实验结果显示，最大灌胃浓度(256 mg/kg)与灌胃剂量( ),而腹腔接种该浓度对小鼠寿命无影响。

在受试动物中未检测到属于提取物毒性的任何物理变化迹象，整个小鼠组均存活（表1）1.).

数字3.根据没食子酸标准图显示提取物中酚类化合物的含量。该植物提取物富含酚类化合物( ).

数字4.根据槲皮素的标准图显示提取物中黄酮类化合物的含量。植物提取物中黄酮类化合物含量为 .

4。讨论

菖蒲属菖蒲在传统医学中消耗，其根茎广泛用于消退慢性腹泻，痢疾，发烧和风湿病等临床症状[8.]此外，它传统上用于治疗各种疾病，包括神经痛、消化不良、肾脏和肝脏疾病、湿疹、鼻窦炎、哮喘、支气管炎、脱发和其他疾病[14］.

我们对提取物毒性的体内实验结果表明，实验动物没有出现任何临床症状。类似地，Muthuraman等人证明，高剂量的植物根茎水醇提取物不能在老鼠身上产生任何毒性作用[15］.另一项研究表明，大剂量的提取物对啮齿动物的耐受性很好，但它与肝酶水平的轻微升高有关[16］.

在我们的研究中，根茎的乙酸乙酯提取物富含酚类化合物。通常认为，植物的药理基础，如抗抑郁、抗焦虑、抗阿尔茨海默病、抗帕金森病、抗癫痫、抗癌、抗高脂血症、抗血栓、抗胆固醇和辐射防护活性ere与酚类化合物有关，如α.和β-细辛脑分子。α和β细辛脑是苯丙烷类化合物[14,17,18］.Isoeugenol，另一种酚类化合物，在菖蒲离开样品(19］.

Oliveira等人发现，弓形虫病小鼠的死亡率可以被酚类化合物抑制，如香兰素[20.］.此外，Choi等人指出，生姜提取物中的酚类化合物可以灭活受感染的宿主细胞中的凋亡蛋白弓形虫。值得注意的是，这些蛋白在体内抑制炎症细胞因子的分泌[21］.

在本研究中，植物提取物中黄酮类化合物含量较低，但在其他研究中，黄酮类化合物中发现芹菜素、木犀草素和黄花素菖蒲[22]MacLaren等人表明，一些黄酮类化合物，如芹菜素和染料木素，可以抑制弓形虫抑制蛋白质酪氨酸激酶的生长[23］.柚皮素、染料木素等黄酮类化合物也具有明显的抗氧化活性隐孢子虫在细胞培养中[24］.

作为一种类黄酮化合物的槲皮素可以抑制合成保护因子，例如Hsp90，Hsp70和Hsp27，因此弓形虫由于宿主免疫反应的影响而保持敏感[25］.

Lehane和Saliba表明，某些常见的膳食黄酮尤其是木犀草素可以抑制氯喹敏感和氯喹耐药菌株的红细胞内生长P。恶性疟原虫[26］.

在我们的研究中，不同浓度的乙酸乙酯提取物直接影响菖蒲在弓形虫使用流式细胞术技术测量速殖子。在该技术中，荧光DNA结合染料碘化丙啶用于评估死亡细胞。结果表明，浓度与寄生虫死亡率呈反比关系。

体内实验结果显示，灌胃给药的最大浓度存在显著差异，而腹腔注射该浓度对小鼠寿命无影响。然而，腹腔注射128浓度 μ.g / ml优于口服浓度。

5.结论

我们的研究表明菖蒲属菖蒲提取物有显著的抗氧化酶活性刚地弓形虫体内和体外可能与大量酚类化合物有关。我们建议研究该提取物的不同部分对寄生虫的影响。或者，必须评估提取物对寄生虫的给药类型和剂量。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从相应作者处获得。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者谨此感谢Shiraz医学院研究事务副校长，以便在经济上支持这个项目。他们还要感谢动物实验室的工作人员进行实验研究的发展。

参考

1. Q.Asgari、H.Keshavarz、M.Rezaeian、H.Sadeghpour、R.Miri和M.H.Motazedian，“2-（萘-2）的抗弓形虫活性-γ.lthiol) 1 h吲哚,“伊朗寄生虫学杂志，第10卷，第5期。2, pp. 171-180, 2015。视图:谷歌学者
2. F.Robert Gagneux和M.-L.Dardé，“弓形虫病的流行病学和诊断策略，”临床微生物学综述，第25卷，第2期2, pp. 264-296, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. j·p·杜贝，《弓形虫的历史gondiiâ€《最初的100年》，真核微生物学杂志，第55卷，第55期6，页467-475,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. C. D.杜邦，D. A.克里斯蒂安，C. A.亨特，《弓形虫病的免疫反应和免疫病理学》免疫病理学研讨会第34卷第3期6，第793-813页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. P. H. Alday和J. S. Doggett，“弓形虫病的发育中的药物：进步，挑战和现状，”DDDT， vol. 11, pp. 273-293, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. R.Palacios、L.E.Osorio、L.F.Grajalew和M.T.Ochoa，“一项随机临床试验中，儿童因利什曼原虫引起的皮肤利什曼病使用10天和20天的锑酸葡胺治疗失败，”美国热带医学和卫生杂志，第64卷，第3期，第187-193页，2001年。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. P. K. Mukherjee, V. Kumar, M. Mal, P. J. Houghton，《菖蒲:自然资源对阿育吠陀传统的科学验证》，生物制药第45卷第5期8，第651-666页，2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. V.Sharma，I.Singh和P.Chaudhary，“菖蒲（治疗植物）：对其药用潜力、微繁殖和保护的回顾，”天然产物的研究第28卷第2期18, pp. 1454-1466, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. V. K. Raina, S. K. Srivastava, and K. V. Syamasunder， " facorus calamus L. from the lower region of the Himalayas， "香精杂志第18卷第2期1，页18-20,2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. R.K.Joshi，“菖蒲：植物成分和杀菌性能，”世界微生物与生物技术杂志，第32卷，第2期10，页164,2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. L. J. McGaw, A. K. Jäger, J. van Stadenβ-细辛酮，一种抗菌驱虫药，产自南非菖茅。南非植物学杂志第68卷第2期1，第31-35页，2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. 国家研究委员会,实验动物护理和使用指南，第10卷，美国国家科学院出版社，2010年，17226/12910。
13. Q.Asgari，H.Keshavarz，S.Shojaee等人，“弓形虫RH株（I型）在组织囊肿形成中的体内外潜力，”伊朗寄生虫学杂志，第8卷，第3期，第367-375页，2013年。视图:谷歌学者
14. A.D.Khwairakpam，Y.D.Damayenti，A.Deka等人，“菖蒲：具有药用价值的生物储备，”中国基础与临床生理学和药理学杂志，第29卷，第2期，第107-122页，2018年。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. A. Muthuraman, N. Singh, A. S. Jaggi，“菖藤水醇提取物对大鼠胫骨和腓肠神经横断诱导的疼痛性神经病的影响”，天然药物杂志，第65卷，第5期2，页282-292,2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. A. Muthuraman和N. Singh，“菖蒲(甜菖蒲)对啮齿动物的急性和亚急性口服毒性分析”，亚太热带生物医学杂志，第2卷，第2期，第S1017-S1023页，2012年。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. R. Chellian, V. Pandy, and Z. Mohamed， "药理学和毒理学α.- - -β-细辛脑：临床前证据综述，“植物医学里，卷。32，pp。41-58,2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. R. Chellian和V. Pandy， "保护作用α.- 对小鼠的尼古丁诱导的癫痫发作，但不是其与烟碱乙酰胆碱受体的相互作用，“生物医学和药物治疗，第108卷，1591-1595页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. J. Radušienė， A. Judžentienė， D. Pečiulytė，和V. Janulis，“不同野生种群菖蒲叶精油成分和抗菌分析”，植物遗传资源，第5卷，第5期。1，页37-44,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. C. B. Oliveira, Y. S. Meurer, T. L. Medeiros等，“雌二醇和百里酚在先天性和非先天性弓形虫病小鼠模型中的抗弓形虫活性”，寄生虫学杂志第102卷第1期3, pp. 369-376, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. Choi，M.Jiang和J.Chu，“生姜提取物对小鼠的抗寄生虫作用刚地弓形虫”,应用生物医学杂志，卷。11，不。1，pp。15-26,2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. S.S.Selçuk，M.Bahar和A.H.Meriçli，“来自土耳其的鸟类群叶片的黄酮类化合物”Acta Pharmaceutica Sciencia，卷。51，没有。1，pp。83-85,2009。视图:谷歌学者
23. A.MacLaren，M.Attias和W.De Souza，“植物速殖子之间相互作用的早期阶段的方面”刚地弓形虫与中性粒细胞兽医寄生虫学，第125卷，第3-4号，第301-312页，2004年。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. J.R.Mead和N.McNair，“类黄酮和异黄酮对微小隐孢子虫和肠道脑炎动物的抗寄生虫活性，”《微生物学字母，第259卷，第1期，第153-157页，2006年。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. C. a . Dobbin, N. C. Smith, and a . M. Johnson，“热休克蛋白70在小鼠中是一种潜在的毒性因子弓形虫通过对宿主NF-kappa B和一氧化氮的免疫调节感染，”免疫学杂志第169卷第1期2，页958-965,2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. A. M. Lehane和K. J. Saliba，“常见的膳食类黄酮抑制红细胞内疟疾寄生虫的生长”，BMC研究笔记第26卷第2期1，页1 - 5,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者

版权

版权所有©2021 Maryam Nikkhoo等。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是原作被正确引用。