优化Loop-Mediated等温扩增试验作为即时检测的工具班氏丝虫在塔纳河三角洲人体血液中,肯尼亚

文摘

介绍。丝虫的寄生虫在人类和向量的准确检测是至关重要的全球和国家计划的执行和评估,消除淋巴丝虫病。免疫学方法检测感染可用;然而,大问题在他们中的大多数已报告。核酸分子检测提供高水平的特异性和敏感性,可用于检测感染。方法。在这项研究中,我们评估loop-mediated等温扩增放大(灯)测试班氏丝虫病人的血液中DNA。的扩增子由pH-sensitive染料测试增强视觉检测和琼脂糖凝胶电泳。封闭管灯试验也被评估。科恩Kappa统计数据用于统计分析化验。125名患者同意取血样的灯被用于临床分析化验用PCR方法用作“黄金标准”。结果。的敏感性评价班氏丝虫灯为92.3%,特异性为97.3%和kappa统计值为0.84,这是在一个强有力的协议。结论。在这项研究中,灯化验加上荧光染色检测被发现适合的诊断和监测班氏丝虫在肯尼亚人口感染。

1。介绍

1.1。背景信息和文献综述

淋巴丝虫病(低频)是一种慢性寄生虫病在热带和亚热带国家公共卫生和社会经济意义。它是由丝虫引起的班氏丝虫,与象皮病马来,或B。timori物种。这种衰弱蚊媒线虫感染已被2020年[用于消除1]。这种疾病是通过5个属的蚊子,库蚊,伊蚊,按蚊,Mansonia,Ochlerotatus(2),最常见的vector-transmitted寄生虫感染疟疾后(3,4]。它是永久和长期残疾的全球第二大原因后眼睛失明(5]。急性和慢性疾病造成淋巴丝虫病影响1.2亿人生活在81年流行国家13.4亿人发展的危险感染(6]。2000年,全球计划消除低频(GPELF)成立7),据估计,5 - 6轮大规模药物治疗(MDA)与伊维菌素或乙胺嗪和阿苯达唑被要求消灭这种疾病(5]。2018年,49个国家的8.93亿人生活的地区需要预防性化学疗法停止传播的感染(8]。

早期、准确的诊断班氏丝虫导致bancroftian丝虫病是一个关键因素在努力消除丝虫病9]。微丝蚴的诊断依赖于检测血液标本和蚊子向量(9]。淋巴丝虫病的即时诊断主要是基于显微镜检查的血液收集晚上(2200点- 2000点)10]。检测试纸测试(ICT)是一种快速格式检测特定循环丝虫的抗原bancroftian丝虫病(11,12]。检测试纸测试(ICT)是被世界卫生组织视为诊断淋巴丝虫病的“黄金标准”(11]。它有很多局限性也包括高成本和不一致的可用性和检测抗原后间隙的蠕虫治疗(11]。微丝蚴抗体检测brugian丝虫病可在临床设置(12,13]。然而,抗体测试表明接触而不是积极感染(14),不区分bancroftian和brugian丝虫病(15- - - - - -17]。控制程序的实现后,监测是必要的,以确定治疗的端点,继续监视被要求识别领域正在进行的传输或复发11,16]。这些活动和整体MDA项目管理可以有效地实现通过使用准确、敏感、具体,和相对廉价的诊断工具适合即时应用程序。

分子如聚合酶链反应(PCR)扩增方法被证明技术具有高敏感性和特异性(18- - - - - -20.微丝蚴的检测。这些方法并没有被广泛用于远程设置,因为高成本和复杂性的过程需要训练有素的人员和先进的设备21]。几个pcr方法被用来放大DNA的血液马来丝虫- - -b . timori- - - - - - (22),w .丝虫来华的患者(18,23,24]。分子病媒昆虫的监测PCR xenodiagnoses的首选方法,已被广泛使用w .丝虫(25,26),马来丝虫(27,28]。替代PCR扩增DNA的等温扩增技术在一个相对恒定的温度;因此,一个简单的浴缸或热块可以使用[29日- - - - - -33]。

Loop-mediated等温扩增(灯)是一个独特和新颖的放大方法具有高特异性和敏感性能够区分单核苷酸的差异(29日]。它的特点是使用六种不同的引物专门设计用于识别目标基因的八种不同地区,与放大只发生如果所有引物结合,形成一个产品(29日]。在过去,灯已成功申请的快速检测DNA和RNA病毒,如西尼罗河病毒(34)和SARS病毒(30.]。寄生虫学家已经适应灯一些寄生虫病的检测方法包括人类的寄生虫痢疾(35),锥虫属(36),绦虫(37),疟原虫(38),而隐孢子虫(39]。其他寄生虫检测化验包括动物寄生虫焦和巴贝西虫(40,41]。灯也一直为向量携带疟原虫的蚊子的识别和开发Dirofilaria巨细胞寄生虫(42]。大多数这些研究了该方法的许多优点超过普通PCR技术。此外,灯可以轻易地评估结果由大量的白色沉淀形成焦磷酸离子在反应副产物生成,而且,可以评估结果肉眼或通过添加荧光染料36,43]。灯实地调查的适用性,因此作为丝虫的感染的诊断和映射工具检测第一次证明了Dirofilaria在野生蚊子44]。后来,高木涉et al。32)发现灯的方法能够检测到w .丝虫人类血液和蚊子的DNA池和一个潜在的工具领域应用验证研究。

由于大部分的诊断方法的局限性突出,为精确的丝虫的感染的分布,揭示小说的诊断方法简单、快速、灵敏、可靠。考虑到这些点,本研究旨在评估和验证灯作为诊断分子等温扩增试验班氏丝虫帮助监测疾病的患病率在肯尼亚流行地区。

2。材料和方法

2.1。研究网站

本研究样本来自塔纳河县塔纳河三角洲肯尼亚(图1塔纳河三角洲,显示地图)。这个地区的一个流行地区被认为是高患病率(22.2%)(45),MDA项目始于2011年(46]。塔纳河三角洲是弯曲的从2007年塔纳河地区。它有3个部门Kipini、Garsen Tarasaa面积16013公里²。塔纳河县有250000人口和134000年塔纳河地区(根据2009年的人口普查47]。每年降雨范围220到900毫米,而平均温度是30°C。0和200之间的高度范围。主要民族是Pokomo,现存的农民和实践钓鱼,和Orma Wardey游牧为主。

2.2。道德的间隙

允许开展本研究寻求从肯尼亚医学研究所科学和伦理审查单位(塞鲁),协议SSC数量。2802年。参与者被要求同意(成年人)或同意(孩子)参与研究提供血液样本用于这项研究。

2.3。灯引物设计

引物用于执行目前化验是那些以前被高木涉et al。32]。目标是18 s rRNA特有的区域(Ssp1),一个高度重复的基因w .丝虫加入数量(AY297458)的完整序列,产生188个碱基对。套引物的图解表示目标班氏丝虫线粒体DNA是如表所示1。

2.4。灯引物特异性测试

在优化灯化验之前,外部引物的特异性(F3和B3)被常规PCR检测。这里的期望是特定的引物w .丝虫检测将显示只在积极控制和没有放大放大负面的控制。这里使用的积极控制w .丝虫商业控件和一个已知的阳性标本早些时候由常规PCR和NV1 NV2 Ssp1重复序列引物。积极的控制已经测序与早些时候加入数字MK471341基因库,可471347。消极的控制包括血液标本nonendemic地区空白主混合和PCR水最初PCR证实了。

2.5。样品处理和放大

从自愿的病人血液样本收集到已标示真空采血管。样品被酒精沉淀法进行DNA提取方法所描述的达塔et al。48与一些细微的修改。提取的DNA的数量和质量是决定通过测量A260和的比值A260 / A280 NanoDrop nd - 1000分光光度计(美国热科学)。灯和扩大了DNA聚合酶链反应检测比较。由琼脂糖凝胶电泳检测扩增子的,1:10 SYBR绿色1染料或荧光染料。

2.5.1。聚合酶链反应(PCR)

最初报道的PCR进行尼古拉斯和Plichart [18]。两个引物被钟和他的同事们(49]nv - 1和NV-2使用。PCR反应混合包含12μl 10 x Bioline缓冲Mgcl2和核苷酸5 pmol /μl NV1和NV2引物,5μl基因组DNA模板,和水反应体积25μl。PCR反应是运行在96 - GeneAmp®PCR系统9700有条件组成的单步95°C的5分钟,40个循环步骤94°C的30秒,54°C 45秒,30秒72°C, 72°C的最后一个扩展一步10分钟。PCR产品大小分数在2.0%琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色。琼脂糖凝胶电泳运行60分钟的80 V和乐队可视化紫外线照射下使用凝胶文档系统(Bio-Rad EZ成像仪,CA)。积极的控制和消极的控制被包含在每次运行,以确保结果的特异性和有效性。预期的w .丝虫大小乐队188个碱基对,这是衡量一个100碱基对分子量标记。

2.5.2。灯的优化

灯的优化分析是由不同的反应温度和时间,以及不同浓度的前后灯引物组外引物(F3和B3)和向前和向后国米引物(工厂检验计划和毕普)。最后assay-optimized条件如下:25的最终反应混合物μl包含引物(40 pmol工厂检验计划和毕普5 pmol F3和B3外引物),DNA聚合酶,8单位Bst我大片段(子午线生物科学®),1毫米核苷酸,0.8甜菜碱和1 x反应缓冲区(包含20 mmtris-hcl, pH值8.8,10毫米氯化钾,10毫米(NH4) 2 so4 8 mmmgs4,和1%渐变20)。反应在不同温度下从孵化60°C到65°C之间的一块热时间30分钟和60分钟。在优化过程中,DMSO 7.5%按化验王et al。50)是由于引物二聚体添加到减少假阳性结果。

使灯放大更适用于一个字段设置,商业等温扩增工具包使用从Eiken化工有限公司(日本枥木)。直接检测扩增子的反应管是由与肉眼直接观察的反应颜色变化后的1μl (1: 10 SYBR绿色染料(表达载体,卡尔斯巴德,CA)扩增子。DNA 320 nm产品也是可视化在紫外线照射下标准2%琼脂糖凝胶电泳后60分钟80 V,然后拍照记录。

2.5.3。封闭管检测:冻干灯反应缓冲区

进一步评估灯应用程序在一个字段的设置中,封闭管检测减少气溶胶污染物和cross-pollutant SYBR绿色1检测使用。反应kit-Loopamp DNA扩增reagent-contains基本反应所有组件(反应缓冲区和核苷酸)在干燥的形式每个反应管帽。的反应,只有特定的引物和DNA模板添加和在适当的环境条件。商业等温扩增工具包使用从Eiken化工有限公司(日本枥木)。直接检测扩增子的反应管是由与肉眼直接观察反应的浊度的放大班氏丝虫DNA和被紫外线照射下任何颜色变化除了1μl (1: 10 SYBR绿色染料(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。

2.6。分析灯特异性测试

灯的特异性进行了分析w .丝虫其他相关的特殊引物扩增DNA寄生虫等与象皮病马来(27),曼氏裂体吸虫,恶性疟原虫,鞭虫trichiura,棘球绦虫granulosus,蚊子向量冈比亚疟蚊(12,14,23,27- - - - - -29日,32,38]。这些寄生虫被使用特定引物PCR检测为每个寄生虫目标区域;它们的序列在基因库中找到。

2.7。分析灯灵敏度测试

确定灯的敏感性分析通过建立较低的检出限,基因组DNA的浓度决定使用NanoDrop 1000和10倍系列稀释的DNA。连续连续稀释的DNA被放大与灯引物来确定检测灵敏度。与PCR的灵敏度也比较敏感,同样的稀释是由PCR。

2.8。临床灯敏感性和特异性检测

临床试验的试验做了敏感性和特异性;125年临床标本参与者PCR和灯试验测试。灯检测灵敏度、特异性和Kappa统计值决定的 列联表。

3所示。研究结果

这里描述的结果显示的放大w .丝虫DNA使用针对Ssp灯引物1重复序列。灯引物用于这项研究持续放大Ssp 1重复序列在梯子有多个大小不同的乐队在等温扩增条件下63°C的60分钟。测试结果表明,开发的灯试验能成功地放大w .丝虫在病人的血液标本。放大产品被发现通过使用1:10 SYBR绿色1染料通过观察颜色变化或通过琼脂糖凝胶电泳。一个封闭的管与冻干反应缓冲区也用于访问他们的使用在减少污染和易于现场适用性。

3.1。灯扩增子荧光染料的检测

在孵化之前,反应混合物的颜色是橙色。在一个积极的灯DNA扩增子,反应管的颜色从橙色变成绿色,橙色没有扩增子(图2)。

3.2。灯的凝胶表示扩增子的结果

LAMP-positive结果表明流的阶梯状光乐队在不同长度,表示的存在w .丝虫DNA标本。没有观察到的乐队在缺乏一个扩增子如图3。

3.3。灯的反应在封闭管道:“随时可用的缓冲区”

使用封闭管包含现成的反应缓冲区显示颜色变化从原来的蓝色放大如图4(一)浅绿色的存在w .丝虫DNA在图4 (b)在放大。管3 & 4放大在63°C一小时把绿色而管1、2和5仍然蓝色指示的缺失w .丝虫DNA在紫外线。绿色表示阳性标本,而负样本仍然蓝色即使放大。

3.3.1。分析灯敏感性和特异性评估

我们的灯试验显示10的灵敏度极限⁻⁶这是相当于(1/1000000)的DNA拷贝寄生虫的稀释剂,虽然没有乐队在1/10000000(1/10吗⁷稀释如图)副本5。分析显示一个伟大的特异性,因为它只会放大w .丝虫当DNA测试与其他寄生虫。w .丝虫DNA显示一连串的乐队在不同大小和缺乏w .丝虫DNA没有乐队(图6)。

3.3.2。PCR检测敏感性和特异性检测

当同一稀释剂用于灯灵敏度测试被用来运行PCR,发现PCR检测10⁻⁷表明这是一个更敏感比灯(图7)。没有乐队从非DNAw .丝虫物种。

3.4。时间使用花期染料检测特异性检测

放大时间评估的时间来找出是否有任何影响放大;获得的结果在30到60分钟的孵化相对不变。没有颜色改变即使放大在同一温度的增加时间如表所示2。

3.5。灯的统计分析结果与PCR(金标准)的结果

灯是由临床敏感性和特异性检查125病人的血液。125样品检查,13是积极通过PCR和15个样本是积极的灯。共112个样本被证实与PCR -而灯确认共有110个标本为负。对敏感性,灯的敏感性为92.3%,特异性97.3%,95%置信区间和一个1的力量。当科恩Kappa系数确定,值为0.84,这表明有一个特殊的两种技术之间的协议。

4所示。讨论

准确、特异、灵敏、负担得起的和不那么复杂的诊断工具需要即时检测和及时开始治疗和预防班氏丝虫。控制程序大大加剧导致人类感染低和传输速率低的向量。这导致需要精确和特定工具识别流行地区治疗是必需的,当传输极限水平达到为了声明一个免费丝虫病流行地区。

灯是一种新型的DNA扩增方法,使反应发生在等温条件下与PCR由专门的设备(包括周期不同的温度36]。灯已经开发和优化了病毒和寄生虫的数量(30.,34- - - - - -42]。然而,研究领域的应用。灯反应的优点是使用四到六primers-FIP,毕普,F3, B3,和/或2循环底漆认出六到八个不同地区的兴趣序列使灯有更高的特异性反应与常规PCR方法(36]。使用灯的另一个优点是基于茎环结构的放大导致积累大量的可变长度的产品。最终,这使得检测放大DNA更容易通过视觉观察消除postamplification凝胶电泳的检测的必要性。

在这项研究中,我们评估了灯的性能检测化验班氏丝虫。优化是通过改变引物浓度,不同时间和温度。冻干试剂的使用在一个封闭的管也被评估。检测是由可视化通过使用荧光染料,颜色变化1:10 SYBR绿色1和凝胶电泳。颜色变化,橙色,绿色,在放大DNA检测扩增子(图显示一个简单的方法2)不需要postamplification凝胶电泳分析,使用溴化乙锭是致癌的性质,并减少它的使用是公共卫生安全的一个重要方面。的凝胶表示灯放大结果如图3。这些结果被Notomi按照报告et al。29日]。封闭的管图4(一)显示了混合反应放大之前是蓝色的颜色。在63°C放大后60分钟,结果如图4 (b)。的存在w .丝虫DNA,颜色由蓝色变为绿色,认为在紫外线照射下(260海里),蓝色的没有w .丝虫DNA。封闭的管有一个额外的好处,因为这是最小的处理反应试剂和减少交叉污染的可能性。本研究结果与研究的灯比色测试Poon et al。38),Goto et al。51],普尔et al。52]。连续稀释10倍做是为了测试灯敏感数据的显示5和7灯和PCR,分别。初始浓度为50.0 ng /μl相当于200 pg;大约1(一)DNA复制被用于制造连续稀释剂。发达灯的临床敏感性为92.3%,在95%置信区间和1、3相比更多的标本检测呈阳性,PCR的结果。特异性的评估w .丝虫灯化验是97.3%。只有标本包含班氏丝虫物种显示放大通过颜色变化或凝胶电泳图6。科恩Kappa统计数据显示一个伟大的协议的0.84,表明这两种方法具有可比性,灯化验可以用PCR在资源限制的地区。

的w .丝虫这里描述灯测试显示了一个更大的潜在使用的装备很差,实验室和在现场设置的地区被忽视的热带疾病的特征。我们灯的检测极限试验是1/10⁶相当于1微丝蚴/ 200μ我的血液(图5);这给了它一个优势用于低流行率和传播缓慢的区域。

在优化我们的面临的主要挑战w .丝虫灯化验是需要处理非特异性扩增的高速率会导致大量的假阳性。当使用opened-tube灯技术,有可能反应管的盖子被打开时,交叉污染的凝胶电泳和当添加染料的反应结果可视化。这些缺点是面临类似报道(36,53- - - - - -56]。减少假阳性和假阴性,DMSO溶液在7.5%被用于混合和反应这大大改进了灯特异性。它还指出,使用封闭管灯化验最小化污染问题,因为preprepared反应缓冲区的管。此外,凝胶电泳运行结束时灯反应需要在实验室进行这一步这是耗时的,因此不适合现场快速检测。

5。结论

我们已经优化灯化验检测的能力班氏丝虫在人类的血液。化验和物种特定高度敏感,可以用于各种各样的DNA模板(提取的基因组DNA, DNA,煮新鲜全血,或血液现货样本)。当封闭管(冻干试剂)应用于临床样本,灯化验很有前途的,代表了一个强大的PCR的替代品。灯的方法将有利于全球卫生项目旨在消除丝虫的感染。

6。建议

我们建议使用封闭管与预混料反应,以避免交叉污染是一个重大的挑战在我们的研究在开管分析。合适的引物设计和试验优化需要避免引物二聚体的假阳性结果。

数据可用性

所有的数据都是包含在文本。

的利益冲突

作者(年代)(s)宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

NMK构思研究开发建议,采购资金,协调和实施方面的研究,并开发了手稿。WD, IC,我们开发了这个方案,分析了数据,并起草了手稿。LJ和GR参与组织和开展现场和实验室活动,起草的手稿。兆瓦,西城路,MC帮助发展中建议,指导和监督实验室化验和检查的手稿。KJ参与提案开发,给研究的指导和监督,更重要的是,为本研究提供灯化验设备。

确认

这个项目由国家科学委员会,技术和创新(NACOSTI), (NRF)国家研究基金,肯尼亚,ref。NACOSTI /恢复/圣&我6^th博士/ 156。作者要感谢肯尼亚医学研究所和丝虫病研究单元进行了研究和授权的出版工作。特别感谢→Kimani弗朗西斯CBRD指导整个研究。

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