核糖体蛋白L5基因存在的研究利什曼虫tropica基因组：测序并评估其免疫应答作为DNA疫苗

摘要

叙利亚皮肤利什曼病主要由利什曼虫tropica．这是一个严重的健康问题，在该国内战之后进一步恶化。到目前为止，还没有有效的保护策略、安全的疗法或有效的疫苗来防止这种感染。DNA疫苗是预防利什曼病的一种有前途的方法。L5核糖体蛋白在核糖体亚基组装过程中起着基础性作用，因此本研究选择了核糖体蛋白L5基因来设计针对该基因的DNA疫苗利什曼虫tropica感染。在叙利亚菌株中证明核糖体蛋白L5基因的存在后利什曼虫tropica(LCED Syrian 01)，测序并克隆到pCI质粒中，将设计的DNA疫苗接种BALB/c小鼠。通过测量免疫BALB/c小鼠在用寄生虫攻击小鼠6周后病变的发展来评估保护反应。RT-qPCR检测IL-12、IFN-γ， IL-4在免疫小鼠引流淋巴结(DLNs)中的表达。在最后一周，检测脚垫病变和局部引流淋巴结(DLNs)的寄生虫负担。本研究证实了核糖体蛋白L5基因在叙利亚菌株中存在并表达利什曼虫tropicapromastigotes。确定了核糖体蛋白cDNA L5基因的序列，并在Genbank上发表。基因大小为918 bp。在cDNA水平上表达。本研究还证实了用核糖体蛋白L5基因接种免疫小鼠后可诱导TH1反应。这种反应阻止皮肤损害的部分发展利什曼虫．

1.介绍

Leishmaniaisis是一种被忽视的热带病（NTD），由迫使原生动物寄生虫引起利什曼虫由受感染的雌沙蝇叮咬传播。正如Sunyoto等人所讨论的，利什曼病的三种主要临床形式是皮肤、内脏和粘膜皮肤[1］.皮肤利什曼病CL是最常见和流行的利什曼病形式，所有病例的90%发生在7个国家(如赫本[2阿富汗、阿尔及利亚、巴西、伊朗、秘鲁、沙特阿拉伯和叙利亚。在叙利亚，90%报告的CL病例是由利什曼虫tropica正如Haddad等人所讨论的[3.］.

目前，皮肤利什曼病的治疗主要依靠治疗性化学药品，但存在成本高、毒性大、疗效差、耐药等严重局限性，因此，疫苗接种仍是控制各种形式利什曼病的最大希望。正如Seyed等人所讨论的，全球公共卫生最关键的优先事项之一是开发一种安全、有效和负担得起的抗利什曼病疫苗。[4］.

DNA疫苗是一种很有前景的疫苗接种方法，用于需要TH1反应和细胞介导免疫的疾病，如利什曼病。正如Tahereh和Rafati所讨论的那样，这种免疫方法引起针对编码抗原的体液和细胞免疫反应[5］.

在利什曼病中，耐药与抗原呈递细胞(APC)、巨噬细胞和树突状细胞产生IL-12有关，这些细胞导致产生IFN-的th1亚群(CD4+ T细胞)的分化和增殖γ．这将最终导致被寄生虫感染的巨噬细胞的激活，这些巨噬细胞将通过一氧化氮(NO)杀死细胞内寄生虫，正如Stenger等人所讨论的[6］.产生抗炎细胞因子如IL-4, IL-10, IL-13和TGF-β导致了Alexander和Bryson所讨论的控制感染的失败[7］.

在本研究中，我们决定评估编码核糖体蛋白L5基因的DNA疫苗的免疫应答利什曼虫tropica由于……的普遍发生利什曼虫tropica在乡下。我们选择核糖体蛋白L5基因来设计所需的预防利什曼病感染的疫苗，因为核糖体蛋白L5在寄生虫的生活中具有基本的作用。最保守的蛋白质家族是核糖体蛋白(如核糖体蛋白L5)。核糖体蛋白具有特异性和强的免疫原性，通常被称为pan抗原。如Requena等人所讨论的，这些pan抗原可以提供疫苗设计所需的免疫调节特性[8Santarém等[9］.

核糖体蛋白作为DNA疫苗在许多细菌和寄生虫中引起了保护性反应，如核糖体蛋白L9流产布鲁氏菌，正如Jain等人所讨论的那样。[10.];核糖体蛋白L7/L12流产布鲁氏菌，正如库拉尔和斯普利特所讨论的[11.];和核糖体蛋白S4日本血吸虫如Ping等人所讨论的[12.］.重组核糖体蛋白L3或L5与th1诱导佐剂结合后，对由th1诱导的CL产生了保护反应l .主要正如Ramírez等人所讨论的那样。[13.］.

正如Biyani等人所讨论的，核糖体蛋白L5基因具有无鞭毛和催鞭毛的表达[14.];这种蛋白质确保了核糖体亚基组装过程的成功，因此在Matthew和Dreyfuss讨论的蛋白质合成过程中具有基本作用[15.］.

本研究旨在检测LCED Syrian 01基因组中核糖体蛋白L5基因的存在利什曼虫将该基因克隆到表达质粒中，并评价设计的抗LCED Syrian 01感染DNA疫苗(pCI-L5)的有效性利什曼虫压力。BALB/c小鼠左大腿后肌注射免疫3次，间隔2周。BALB/c小鼠右足垫10⁶春季的l . tropica最后一次免疫后2周。

我们的研究结果表明，pCI-L5疫苗诱导了对感染的部分保护，降低了脚垫病变和局部淋巴结中的寄生虫负担，诱导了更高的IL-12和IFN-基因表达γ与对照组相比，在接种疫苗小鼠的引流淋巴结中诱导IL-4基因表达较低，这表明设计的疫苗能够诱导TH1反应，防止皮肤损伤的部分发展利什曼虫．

2.材料和方法

2．1．聚合酶链反应PCR引物设计

其他核糖体蛋白L5基因序列的比对利什曼虫物种是因为基因的序列不知道l . tropica．使用CLC Free Workbench 7程序、Vector NTI Express程序和EMBOSS_needle工具进行对齐。设计了引物http://www.idtdna.com/calc/analyzer．该位点用于测定熔点温度和确认自二聚体、发夹和异质二聚体的可能性。http://www.geneinfinity.org/sms/sms_primanalysis.html工具被用来确定限制性内切酶是否可以切断基因。如Orabi等人所讨论的，高纯度引物从加拿大蒙特利尔的Alpha DNA中订购[16.］.引物最终序列如下:（一种）前进：5 -AGA ATT C在GCC GTT CGT caa GGT CGT g-3（b）反向:5 -很好，很好T tac TTG CCG agg CGC tc-3

如Orabi等人所讨论的，pCI哺乳动物表达载体中直接克隆的EcoR1和XbaI限制性位点促进了克隆DNA插入物在哺乳动物细胞中的组成性表达[16.］.

2．2．寄生虫培养和基因组DNA提取

叙利亚的压力利什曼虫tropica前鞭毛体(LCEBS，大马士革，叙利亚)在RPMI-1640培养基(Lonza，瑞士)中培养，并添加5% FCS(胎牛血清;Cytogen GmbH,德国)。基因组DNA由DNA提取试剂盒(Thermo Fisher Scientific，立陶宛)根据制造商的说明从这些原毛虫中提取。

2．3.总RNA的分离和cDNA的合成

采用GeneJET RNA纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific, USA)从收获的RNA中提取总RNA利什曼虫tropicapromastigotes。将mRNA逆转录成单链cDNA，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific，立陶宛)，使用oligo dT引物，按照制造商的说明。

２.４.核糖体蛋白L5的PCR扩增

利用热循环仪(Bio-Rad，美国)，利用PCR主混合(Thermo Fisher Scientific，立陶宛)和上述引物扩增核糖体蛋白L5基因的DNA和cDNA。采用梯度退火温度优化PCR方案。在25分钟内进行反应μL混合物含1μL，最终浓度为0.4μ在25卷的最后一卷中μl和2.5μl模板DNA (250 ng)或2.5 ngμl cDNA (240 ng)， 12.5μl PCR主混合物和8 μl PCR水。热循环条件为95°C 5 min，然后是95°C 1 min, 59°C 45秒，72°C 1 min，最后72°C 5 min的35个循环。

2．5．质粒的构建与纯化

使用GeneJET PCR纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific，立陶宛)，按照制造商说明，纯化含有核糖体蛋白L5编码序列的PCR产物。用EcoR1 + XbaI对纯化的L5-cDNA和pCI哺乳动物表达载体(Promega，美国)进行双消化。用T4 DNA连接酶(Thermo Fisher Scientific，立陶宛)将酶切的L5-cDNA与pCI哺乳动物表达载体连接。pCI-L5克隆体被转化成大肠杆菌前10名。从转化的转化中萃取重组质粒大肠杆菌TOP10经碱性十二烷基硫酸钠(SDS)裂解和内毒素柱纯化(GeneJET Plasmid Maxiprep Kit;Thermo Fisher Scientific，立陶宛)根据制造商的说明。

2.6。小鼠接种疫苗

老鼠购自叙利亚大马士革的科学研究中心。小鼠分为实验组和对照组，每组25只雌性BALB/c小鼠(4-6月龄)。研究组小鼠免疫3次，每隔2周给药100次μ100 . g pCI-L5疫苗悬浮μL纯盐水缓冲液（PBS）肌肉内左后肌肉。对照组的小鼠以2周的间隔接种三次，用空质粒（PCI）。

2.7。寄生虫的挑战

末次免疫后2周，对照组和研究组皮下接种10⁶静止相突出利什曼虫tropica(LCED叙利亚01)在右脚垫。使用公制卡尺(Mitutoyo, Kawasaki Kanagawa, Japan)测量脚垫厚度，计算为左侧脚垫厚度减去右侧脚垫厚度。将接种疫苗的小鼠与对照组进行比较。

2.8。寄生虫负荷估算

如Fatemeh等人所讨论的，用极限稀释法估算攻毒后6周的寄生虫载量[17.］.之前，每组处死3只老鼠。用70%乙醇消毒足部，取病灶附近引流淋巴结。制作引流淋巴结的单细胞悬液，在10 ml双相培养基中重悬(C-M199;Thermo Fisher Scientific，立陶宛)。将感染脚垫表面消毒，取出组织，置于含有0.3 ml双相培养基(C-M199;Thermo Fisher Scientific，立陶宛)。然后，人工破坏组织。淋巴结细胞和病变细胞悬液在RPMI-1640培养基中连续稀释10倍;加入96孔板(CELLSTAR®细胞培养微板，德国)。 The plates were coated with paraffin papers and placed in an incubator at 25°C for 7 days. The highest dilution, at which parasites can be seen by microscopic inspection, was recorded as parasite load in the site of inoculation and in draining lymph nodes (DLNs) of BALB/c mice.

2.9。实时荧光定量pcr检测细胞因子

采用qPCR检测IL-12、IFN-含量γ在挑战后的第2,4,4和6周内，伊尼仑4，以监测排水淋巴结（DLN）中的细胞因子基因表达;在每个时间点处死三只小鼠。使用手术刀用于去除淋巴结以避免污染，并且淋巴结用陶瓷研磨机散列，在1.5ml微管中均匀化，然后过滤。Genejet RNA纯化提取试剂盒用于从每只小鼠组中从排出淋巴结（DLNS）中提取RNA。使用RNase的DNase组用于去除任何基因组DNA的痕迹。逆转录酶（200 u）用于逆转RNA（2 μg)。采用采用SYBR Green (SYBR Green Master Mix)的StepOne Real-time PCR系统(Applied Biosystems)进行实时PCR，以200 ng的cDNA为模板(cDNA Omniscript RT kit;试剂盒)。Overbergh等人讨论的细胞因子基因的正向和反向引物[18.[Liu等人所讨论的HPRT基因。[19.]的内容如下:（一种）IL-4-RV 5 -GAAGCCCTACAGACGAGCAGCTCA-3（b）IL-4-FW 5 -ACAGGAGAAGGGACGCCAT-3（C）干扰素-γ房车5 -TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3（d）干扰素-γ弗兰克-威廉姆斯5 -TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGA a - 3(e)白介素房车5 -AACTTGAGGGAGAAGTAGGAATGG-3(f)IL-12-FW 5 -GGAAGCACGGCAGCAGAATA-3(g)HPRT-RV 5 -CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACC a - 3(h)HPRT-FW 5 -GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3

用次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因对该基因的mRNA表达量进行归一化处理，计算其表达量的差异 -在激活的细胞中，Fold的表达与naïve平行。25例进行反应μ含有1的混合物的LμL，最终浓度为0.4μ在25卷的最后一卷中μ2.5 l,μcDNA (200 ng)， 12.5μSYBR绿色反应主混合剂(应用生物系统公司，美国)μl的PCR水。PCR条件为:95℃初始变性2 min, 95℃变性1 min, 61℃退火/延伸1 min，共35个循环。采用Mx3005P(美国安捷伦技术公司)进行反应处理和分析。相对定量计算基因表达，采用比较Ct法( ），如前所述，0.02被确定为阈值。褶皱变化( ）用于表达基因表达，与来自对照组的样品作为校准器。

2.10。统计分析

用平均值表示的值和SD采用混合方差分析进行比较。结果被认为具有统计学意义 ．

3.结果

3．1.基因组DNA和总RNA提取质量和纯度的评价

在1%琼脂糖凝胶上提取的DNA电泳显示只有一条条带(图)1(a)证明所提取的DNA没有发生降解。DNA纯度为1.78，表明提取的DNA纯度较高。提取的RNA纯度为2.3，说明提取的RNA纯度较好。提取的RNA在1.5%琼脂糖凝胶上的电泳(图1(b)显示标准剖面，没有基因组DNA污染。

3．2.聚合酶链反应

采用梯度退火温度对PCR方案进行优化，最适宜退火温度为59℃。PCR产物在DNA和cDNA水平上的凝胶电泳(图2)只显示一个条带，其大小约为918个碱基对。

3．3.核糖体蛋白L5 cDNA的克隆与测序

5个菌落的PCR结果显示，其中3个菌落呈阳性，并显示核糖体蛋白L5基因带。从阳性菌落中提取质粒，纯化后双酶切，酶切质粒电泳显示两条条带，一条为酶切质粒，另一条为核糖体蛋白L5基因条带(图)3.）.鉴定并测序核糖体蛋白L5 cDNA cDNA克隆。在登录号MN495877.1下将序列提交给Genbank（图4）.根据推导的氨基酸序列预测了含有305个氨基酸的核糖体蛋白L5。补充材料(可用)在这里)显示918 bp cDNA插入片段的完整核苷酸序列，并与其他物种的氨基酸序列进行比较。利用geneiprime程序将预测序列与其他种属核糖体蛋白L5 cDNA编码的蛋白质序列进行比较利什曼虫如l .主要,加入不。XM_003722531.1;l .墨西哥,加入不。XM_003879135;l . donovani,加入不。XM_003864722.1;和l . infantum,加入不。XM_003392749.1。有趣的是,l . tropica核糖体蛋白L5基因与核糖体蛋白L5基因具有显著的相似性l . infantum(99.46%),l .主要(98.58%),l . donovani(99.46%)和l .墨西哥(99.67%)使用CLC主工作台。

3．4．小鼠疫苗接种对感染发展和寄生虫载量的影响

将接种pCI-L5疫苗的小鼠脚垫肿胀情况与对照组进行比较。与对照组相比，接种疫苗组在最后一次接种6周后观察到下降了62.72%(图)5）.这一减少在统计学上是显著的 ．

寄生虫载量为 在接种点和 在接种组pCI-L5的引流淋巴结(图6）.与对照组相比，接种组病灶和淋巴结的寄生虫负担分别降低了3.8 log和3.1 log。病变和淋巴结中寄生虫负担的减少具有统计学意义 ．

3．5．干扰素-γRT-qPCR分析IL-12、IL-4基因表达

白细胞介素-12 (IL-12)、干扰素- γ (IFN-)的基因表达γ)，并在接种组的引流淋巴结(dln)中检测白细胞介素-4 (IL-4)，以确定接种诱导的细胞免疫反应是否与细胞因子表达有关。在免疫过程中，IFN-的基因表达γIL-4、IL-12在免疫组小鼠引流淋巴结(dln)中的基因表达与对照组相比无显著差异 ．这些研究结果显示IFN-的基因表达增加γ在第2、4和6周接种pCI-L5疫苗的小鼠的引流淋巴结(DLNs)中(4.29倍( ），8.1倍( ），和19.6倍( ），分别)，与IFN-的基因表达比较γ在对照组的引流淋巴结(DLNs)中(图)7（a））.此外，这些研究结果显示，在接种pCI-L5疫苗的小鼠的引流淋巴结(DLNs)中IL-12的基因表达增加(10倍于( ），13.75倍( ），和21-fold ( ），分别)，比较同周对照组引流淋巴结(DLNs)中IL-12基因表达(图)7 (b)）.最后，这些研究结果显示，在接种pCI-L5疫苗的小鼠的引流淋巴结(DLNs)中IL-4的基因表达在第2、4和6周下降了0.52倍( ），0.57倍( ），和0.54倍（ ），分别)，与对照组同周引流淋巴结(DLNs)中IL-4基因表达情况进行比较(图)7 (c)）.

计算IFN-的基因表达比例γIL-4 (IFN-γ(IL-4 /IL-4比值)作为攻毒前和攻毒后2、4、6周研究组和对照组引流淋巴结(dln)中IL-4 /IL-4比值的指标。

在挑战之前，IFN-γ/IL-4比值与对照组相比无显著差异 ．干扰素-γ/IL-4比值高于IFN-γ/IL-4比值(IL-4 /IL-4比值) (图8）.

4.讨论

人类形式的皮肤利什曼病(CL)在叙利亚历史上很久以前就存在了。利什曼虫tropica是这种形式的致病因素。Muhjazi等人讨论，在叙利亚因战争健康状况恶化后，全国范围内CL病例的数量和分布显著增加。[20.］.治疗皮肤利什曼虫目前是基于有毒性和严重副作用的药物。此外，对这些药物的耐药性已经出现，因此新的抗利什曼原虫药物或疫苗更为重要，正如Ghaffarifar等人所讨论的[21.］.

搜索有效的疫苗是研究人员通常和叙利亚人的重要目标。DNA疫苗接种是一种重要的选择，作为针对皮肤LeishManiaisis的有效疫苗，因为它激活了面对皮肤嗜利什曼病的理想和特异性Th1细胞反应，如Carrión等人所讨论的那样。[22.］.

用基因作为DNA疫苗来对抗利什曼虫tropica我们需要知道这些基因是否存在于利什曼虫tropica基因组及其在寄生虫生命中的重要作用及其潜在的免疫原性。核糖体蛋白L5附着在5s rRNA上，保证5s rRNA的胞内运输。这一事件在核糖体组装中起着至关重要的作用;因此，正如Matthew和Dreyfuss所讨论的，核糖体蛋白L5在蛋白质合成过程中具有基础性的作用[15.］.此外，作为核糖体蛋白家族成员的核糖体蛋白L5被认为是一种泛抗原，Requena等人讨论过它提供疫苗设计所需的免疫调节特性[8Santarém等[9］.

本研究选择了核糖体蛋白L5基因，设计了一种抗感染的DNA疫苗l . tropica它是叙利亚主要皮肤病例的病原体。未发现核糖体蛋白L5基因的存在l . tropica，故本系统研究首次探讨核糖体蛋白L5基因是否存在于利什曼虫叙利亚菌株基因组，以证明这些寄生虫是否有L5基因的表达，并对该基因进行测序。然后将核糖体蛋白L5基因插入pCI质粒，制成pCI-L5 DNA疫苗。

用设计的疫苗免疫BALB/c小鼠。研究了DNA疫苗对BALB/c小鼠的细胞免疫反应，并与空白质粒(pCI)接种的对照组进行了比较。在挑战后6周内测定并测量病变的发展情况。在挑战后的最后一周，脚垫病变和局部引流淋巴结的寄生虫负担已被确定。采用RT-qPCR定量测定细胞因子(IFN-)的基因表达γIL-12和IL-4)在BALB/c小鼠引流淋巴结(DLNs)中的表达。

在研究组中，T辅助1 (TH1)细胞因子如IFN-γ和IL-12是启动保护性免疫的关键因素利什曼虫而像IL-4这样的T辅助2细胞因子(TH2)通过下调TH1免疫反应促进寄生虫的持续存在，正如Maspi等人所讨论的[23.］.利什曼病的细胞免疫反应已经在小鼠模型中进行了广泛的研究。易感小鼠(BALB/c)发生进行性病变，TH2反应占优势，导致抗炎细胞因子的产生，如IL-4。耐药小鼠的病灶小，寄生虫少，IFN-占优势γ和IL-2细胞因子，是TH1反应的特征。这些细胞因子在被感染的巨噬细胞中激活利什曼机制，产生高ROS和NO，导致杀死寄生虫，正如Santos和Brodskyn所讨论的[24.］.

寄生虫的存在的最后挑战拦路贼损伤和局部引流淋巴结可能是由于细胞因子il - 10的存在,这是一个重要的监管参与寄生虫持久性在老鼠身上,和他们的主要来源是CD4 + CD25 +调节性T细胞所讨论的长铁楔et al。25.］.

在对照组中，如Sacks和Trauth所述，利什曼病后IL-4浓度增加，导致感染加重[26.］.IL-4在TH0细胞向TH2细胞分化过程中发挥重要作用。IL-4主要由TH2产生，其产生可抑制巨噬细胞的利什摩杀活性，延长寄生虫的存活时间。IL-4通过下调IL-12的产生来限制TH1细胞因子的产生。此外，正如Maspi等人所讨论的，IL-4下调了招募th1型细胞到感染部位的趋化因子的产生[23.］.

偏振免疫应答和感染结果之间的相关性导致了TH1或TH2响应的主要态度决定了Teshager和Mohammed讨论的结果[27.］.因此，所研究的疫苗的功效需要测定Tripathi等人所讨论的免疫应答类型，即，即，是否是TH1或TH2反应[28.］.

一些研究表明，某些菌株l . tropica在BALB/c小鼠中导致轻度发病，其特征是注射部位有微小或无明显肿胀，因此，正如Fatemeh等人讨论的那样，测量病变大小并不被认为是评估疫苗效率的有前景的工具[17.和Rostamian等人[29.］.事实上，在某些情况下，皮肤损伤是由于l . tropica如Masoudzadeh等人所讨论的，可能发展为溃疡性可检测病变[30.]，就像我们的研究案例一样，因此监测病变的大小可以有力地反映所使用疫苗获得的免疫反应。

pCI-L5疫苗能对感染产生部分保护作用利什曼虫tropica， IFN-的比值γ/IL-4在攻毒后第2周和第4周分别为2.83和3.62，在第6周(大于1)稳定在5.07。因此，两周后疫苗引起的细胞介导免疫反应为TH1型，因为IFN-的比例γ/IL-4的比值大于1，该比值足以引起对IL-4的部分免疫利什曼虫tropica（如Masoudzadeh等人所讨论的那样，与病变尺寸的减小有关。[30.在六周的挑战后，病变和引流淋巴结中的寄生虫数量减少。

这表明了核糖体蛋白L5基因的重要性，以及在后续实验中使用由相同基因编码的佐剂或蛋白质的可能性，从而提高免疫效力，如Todolí等[31.，或使用核糖体蛋白L5基因作为联合疫苗的一部分，如Rafati等人所讨论的，使用重组质粒混合物比单独接种每个重组质粒具有更高的预防免疫强度[32.］.

研究还表明，增加剂量是必要获得更好的结果，表明在我们研究中增加剂量以获得更好的结果可能性。我们无法比较我们的结果，因为没有类似的研究，该研究可以使用核糖体蛋白L5基因作为对Leishmaniaisis引起的DNA疫苗利什曼虫tropica。

在本研究中，DNA疫苗的免疫应答仅仅是由于含有核糖体蛋白L5基因的重组质粒的作用，因为pCI质粒本身不含CPG基元，不能诱导对利什曼病的免疫应答，而pTCAE质粒单独能诱导小鼠部分免疫应答l .主要因为如Vakili等人所讨论的，pTCAE质粒包含CPG基元[33.］.

根据这些数据，核糖体蛋白L5基因是l . tropica和核糖体蛋白L5在l . tropica寄生虫。提示pCI-L5疫苗免疫小鼠的免疫应答为TH1应答;然而，这种反应是不够的，需要添加由相同基因编码的佐剂或蛋白或增加剂量来提高这种反应。这种激活导致被激活的T细胞产生IFN-γ，进而诱导巨噬细胞分泌IL-12，杀死寄生虫，控制感染。

5.结论

本研究证实了核糖体蛋白L5基因是该基因的一部分l . tropica和核糖体蛋白L5在l . tropica寄生虫。我们首次证明了核糖体蛋白L5基因的存在l . tropica，确定核糖体蛋白L5基因的cDNA序列，并将该基因提交Genbank，登录号为MF495877.1。本研究报道的数据表明，用核蛋白L5作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，皮肤病变的大小有所减少，但寄生虫仍在接种部位和引流淋巴结(DLNs)存活，IFN-的比例也有所下降γpCI-L5疫苗对IL-4的抑制率为5.07。根据这些数据，接种该疫苗的小鼠的免疫反应类型是TH1，但仍然不足，需要添加由相同基因编码的佐剂或蛋白质，或增加剂量，以提高这种反应，并提高疫苗的性能，以防止可能发生在流行地区的进一步感染。

数据可用性

在这项研究中创建或使用的所有数据都可以从大马士革大学利什曼尼亚流行病学和生物学研究中心公开获得。

的利益冲突

不存在利益冲突。

致谢

我们要感谢利什曼尼亚流行病学和生物学研究中心主任shaden Haddad博士和Hassan Khoury博士，感谢他们支持和鼓励我们开展这项工作。这项工作得到了大马士革大学利什曼尼亚流行病学和生物学研究中心(3,000,000 SYP)的支持。

补充材料

L5 cDNA的核苷酸序列l . donovani，l . infantum，l .主要，l .墨西哥,l . tropica．推导出的氨基酸序列显示在cDNA序列下面。（补充材料）

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