慢性弓形虫病BALB/c小鼠血清酪氨酸和多巴胺水平的评价

摘要

背景．弓形虫寄生虫改变神经递质信号的转导，导致包括酪氨酸和多巴胺在内的脑神经递质水平的变化，因此感染宿主的行为可能发生变化。基于这一概念，本研究对慢性弓形虫病感染小鼠血清酪氨酸和多巴胺水平进行评价。材料和方法．刚地弓形虫BALB/c小鼠腹腔注射Prugniaud II株诱导慢性弓形虫病。采用改良凝集试验(MAT)、聚合酶链反应(PCR)和镜检方法证实慢性弓形虫病的诱导。分别于第40、50、60、70、80天分离感染小鼠血清，测定血清中酪氨酸和多巴胺水平高效液相色谱法．结果．显微方法证实了弓形虫小鼠组织中的囊肿。诱发慢性弓形虫病也可通过MAT、PCR和组织学方法证实。HPLC结果显示，与对照组相比，感染小鼠的血清酪氨酸水平在第40天下降，且水平太低，无法在其他时间测量。然而，血清多巴胺水平显著升高，并在寄生虫接种后逐渐升高。结论．大多数样本组未检测到酪氨酸水平可能与血清中酪氨酸浓度过低有关。然而，在第40天低浓度的酪氨酸和多巴胺的增加，大多数样本组表明，由于酪氨酸的存在，多巴胺的生产弓形虫在被感染的老鼠。

1.介绍

弓形虫病是一种由刚地弓形虫，一种胞内原生动物，属于顶端复合体门。弓形虫病在人类和温血动物中非常普遍。先天性弓形虫病是弓形虫病的重要类型，其通过胎盘传播可导致胎儿出现严重的并发症。眼科和神经系统疾病被认为是先天性疾病的显著结果[1，2］．

获得性弓形体病分为症状型和无症状型。症状型通常发生在患有艾滋病毒和其他免疫系统疾病的人身上[3.- - - - - -5］．弓形虫脑炎被认为是hiv阳性个体神经系统疾病的可预测结果[6］．最近的几项研究揭示了弓形虫病和神经退行性疾病(包括帕金森、多发性硬化症和阿尔茨海默病)之间的联系[7- - - - - -10］．

具体的研究指出了寄主行为变化与病毒、寄生虫等不同微生物的关系弓形虫［11- - - - - -13］．虽然这些行为变化的主要原因至今尚未明确指出，但形成弓形虫中枢神经系统囊肿可能与这些变化有关。包囊期为休眠形式弓形虫寄生虫主要寄生于肌肉组织和中枢神经系统。自发组织囊肿破裂释放缓殖子，导致宿主血清抗体持续高滴度[14，15］．

一些调查证实了这一点弓形虫寄生虫改变了神经递质信号的传导。他们认为，这种寄生虫过度表达酪氨酸羟化酶的编码基因。酪氨酸羟化酶被认为是产生多巴胺的限速酶[16］．此外，另一项研究结果显示，在感染弓形虫病的精神病患者中使用多巴胺拮抗剂可以减少这些患者的行为变化[17］．

在此基础上，本研究采用免疫荧光法测定慢性弓形体病小鼠血清酪氨酸和多巴胺水平高效液相色谱法．

2.材料和方法

2．1．伦理批准

所有小鼠实验均遵循动物护理机构和动物实验伦理委员会的指导方针，并得到设拉子医科大学伦理委员会的批准(IR.SUMS.REC.1397.S653)。

2．2.老鼠

本研究由伊朗德黑兰巴斯德研究所提供76只6 - 8周雌性近交系BALB/c小鼠(体重30-35 g)。本研究中所有使用的动物都被安置在温控的住所( °C, 40-60%湿度)，供水，喂食标准的鼠干食品。这些动物被保存在伊朗设拉子市设拉子医科大学的实验动物中心。

2．3.寄生虫的准备

弓形虫寄生虫(Prugniaud strain II (PRU-II))从受感染BALB/c小鼠的大脑中获得，这些小鼠由马扎达兰医学科学大学寄生虫学和真菌学系提供。简单地，用苯酚麻醉处死4只感染小鼠。受感染动物的大脑在无菌条件下被无菌地摘除。大脑在含有1%青霉素/链霉素(Gibco公司)的均质器溶液中均质。匀浆在4℃下100× g离心3 min，以减少大碎片。取上清液，4℃，2000× g离心6 min。将获得的颗粒重悬并在生理盐水中稀释后，计数囊肿。

2.4。诱导小鼠实验慢性毒素（试点组）

作为初步研究，选取5只雌性小鼠诱导实验性慢性弓形虫病。为了做到这一点，每只老鼠腹腔内都感染了200只μ.L生理盐水，含10弓形虫囊肿。2个月后处死小鼠。小鼠血清改良凝集试验(MAT)阳性和小鼠脑内寄生虫检测证实了实验性慢性弓形虫病和囊肿形成和眼睛的病理和分子(PCR)方法。

2．5．垫

MAT被认为是一种敏感而特异的血清学检测方法弓形虫在不同的宿主中[18］．提取的弓形虫来自感染小鼠腹膜的Tachyzoites（RH菌株）用作垫子中的抗原。将提取的Tachyzoites保持并在2％福尔马林中在4℃下固定在一夜。在延续中，使用PBS洗涤福尔马林，然后将所得颗粒重悬于含有0.4％牛血清白蛋白（BSA），0.2％叠氮化钠和evans蓝染料（40）中的碱硼酸盐缓冲液（pH8.7）中的 μ.G /ml)至终浓度，包括 4°C保存。

用碱性硼酸盐缓冲液稀释血清(1:20 ~ 1:2560)，置于u形96孔微孔板中。使用阳性和阴性血清，并像对样品所做的那样进行稀释。之后,20μ.每孔加入1/1000 v/v的2-巯基乙醇，静置10分钟。

40μ.将上一步制备的含速殖子的抗原L加到每孔中。室温孵育24 h，读取结果。在MAT中，在井底产生蓝色地毯形状，包括血清滴度超过1:20被认为是阳性结果。

2．6．直接和病理涂片的制备

在初步研究中，用苯酚麻醉处死小鼠。小鼠大脑和眼睛无菌采集并固定在10%缓冲福尔马林中。所得的碎片用分级醇脱水，然后包埋在石蜡块中。部分5μ.M的厚度在玻片上制备，苏木精和伊红染色，光镜观察[19］．

对吉姆萨染色的脑组织标本进行印迹涂片。

2.7。聚合酶链反应

使用商业试剂盒(QIAGEN 28106，美国)从大脑中提取DNA。根据B1基因的基因组片段设计了特异性引物，其中约有35个重复序列弓形虫基因组。使用的底漆(正向:5 -Gga act gca TCC GTT cat gag-3和反向:5 -TCT tta aag CGT TCG TGG tc-3 ）具有较高的准确性，能够在样品中检测速殖子[20.］．

扩增程序将开始在94°C predenaturation 5分钟,然后在94°C 40周期的变性30年代,退火在57为45°C年代,在72°C和扩展了1分钟,紧随其后的是最后一个在72°C扩展阶段10分钟(20.］．

在PCR产物电泳阶段，5μ.L加到10μ.L, 1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶紫外可见。

2.8。小鼠慢性弓形虫病的诱导实验(样本组)

选取与试验组年龄、体重相同的雌性BALB/c小鼠50只，分为两组(40只作为样本，10只作为对照组)。样本组的所有小鼠均与试验组相同感染。此外,200年μ.对照组每只小鼠腹腔注射L的生理盐水作为安慰剂。在本研究中，BALB/c小鼠维持在设拉子医科大学比较实验医学研究所。

在接下来的步骤中，在诱发慢性弓形虫病后的第40、50、60和70天从小鼠心脏采集血液样本。血清分离，-70℃保存，采用高效液相色谱系统测定血清酪氨酸和多巴胺水平。

2.9。用高效液相色谱法评价血清酪氨酸和多巴胺水平

国际协调委员会(ICH)指南用于HPLC系统分析方法的评估和验证。分析了影响系统性能的重要因素:分辨率、喷射精度、尾砂系数和理论板数。为检测血清中酪氨酸和多巴胺水平与流动相等其他产品如安慰剂溶液(除血清外所有成分的混合物)、稀释剂、标准溶液和样品溶液分别注射到HPLC体系中。

本研究采用德国Knauer高效液相色谱系统，包括自动进样器、四元泵、脱气器和检测器。使用EZchrom软件(德国Knauer/Germany)对获得的信号进行分析。所用的色谱柱是硅基的，C18（ mm)的基础4μm粒子技术。流动相为0.05%甲酸和乙腈(90:10,v/v)，流速为1 ml/min。所有样品均等量进样(50μ.L)在225 nm和236 nm波长处分别检测酪氨酸和多巴胺。酪氨酸的保留时间为3.6 min，多巴胺为3.4 min。

2.10。标准溶液的制备

将0.01 g酪氨酸和多巴胺与0.5% HClO分别混合，用于标准溶液的制备和HPLC的设置₄(v/v)的不同浓度的成就，包括1,0.5,0.125,0.0625，和0.03125μ.克/毫升。将标准溶液分别注入HPLC体系3次，得到相关曲线。

2.11。样品溶液的制备

50μ.l与0.5% HClO4 (v/v)等量混合。然后,50μ.l注入高效液相色谱。所有样品均在12分钟内获得相关曲线。

2.12。统计分析

SPSS统计软件（ver。24，芝加哥，IL，USA）和Mann-Whitney非参数测试用于分析所获得的数据。值≤0.05有统计学意义。

3.结果

3.1。垫

MAT结果显示，所有小鼠血清阳性滴度均在1:20以上。由于1:20的比例被认为是解释MAT结果的阳性临界值，因此在试点组中证实了慢性弓形虫病的诱导。

３．２．直接和病理涂片的制备

病理涂片结果显示，50天后，弓形虫飞行员组小鼠脑和眼内均有囊肿形成。直接涂片Giemsa染色可见囊肿。我们的研究还表明，在样本组中，囊肿是在小鼠大脑和眼睛中组成的(图)1)．

3．3．聚合酶链反应

采用PCR方法确定了在试点组中诱导的慢性弓形虫病的存在弓形虫小鼠大脑中的囊肿，以及显微镜下的结果。利用B1-F和B1-R引物，检测阳性样品弓形虫显示194 bp的条带(图2)．

3．4．用高效液相色谱法评价血清酪氨酸和多巴胺水平

制备不同浓度的酪氨酸和多巴胺标准品，注射入高效液相色谱，得到标准曲线。对所得标准曲线下的面积进行计算，绘制标准曲线，得到酪氨酸和多巴胺的标准方程。最后，通过计算得到的样本曲线下的现面积，使用标准方程测量样本中酪氨酸和多巴胺的浓度(图)3.和4)．

3．5.注射寄生虫后不同天血清酪氨酸水平

获得的关于酪氨酸的结果表明，酪氨酸血清水平仅在40天可测量(表)1)．在第50、60和70天，血清酪氨酸水平未检测到1)．

3.6。寄生虫注射后不同天血清多巴胺水平

获得的有关多巴胺的结果显示，第40、50、60和70天的多巴胺血清水平在第40天后大致呈上升趋势(表)2)．

4。讨论

研究结果显示，多巴胺水平在40天后大致呈上升趋势。先前的一项研究结果显示，在感染了急性弓形虫病的动物模型中，多巴胺的浓度没有增加(未发表);然而，在感染了慢性弓形虫病的动物模型中，这种激素的水平可提高到14%。虽然我们测量了大脑中的多巴胺水平，但在我们的研究结果中，报告的多巴胺血清水平在一定程度上呈上升趋势，这与Stibbs的这项研究结果一致[21］．近年来的另一项研究表明，多巴胺水平高与弓形虫病有关[22］．

根据我们得到的结果，大多数样本组在第40天酪氨酸浓度较低，多巴胺增加，可能证实了之前获得的关于酪氨酸羟化酶编码基因表达的结果弓形虫寄生虫。2009年一项研究的作者认为，弓形虫感染动物模型注射寄生虫后2天酪氨酸水平下降，原因是酪氨酸羟化酶(AaaH1和AaaH2)编码基因在弓形虫体内的存在和表达弓形虫寄生虫(16］．然而，Alfonso等人沉默了AaaH2基因，并表明在弓形虫病感染动物模型中，酪氨酸的减少和多巴胺水平的升高可能涉及其他机制[23］．因此，由酪氨酸羟化酶产生多巴胺仍然存在争议。

由于在我们的研究中，我们无法检测第40天后的酪氨酸水平，因此我们无法将我们的酪氨酸数据与之前研究报告的结果进行比较。大多数样本组未检测到酪氨酸水平，可能是由于血清中酪氨酸水平浓度过低或HPLC系统灵敏度较低。

如前所述，弓形虫病与帕金森、多发性硬化、阿尔茨海默等神经退行性疾病的关系近年来一直是一个值得讨论的问题[7- - - - - -10］．的存在弓形虫寄生在中枢神经系统特别是宿主大脑中的寄生虫可以影响神经递质信号的转导。这一概念可以认为是弓形虫病感染宿主行为改变的主要原因。血清和脑内酪氨酸和多巴胺水平的变化与不同的行为障碍有关。在以往的调查中，很少有研究试图改善对神经递质激素与弓形虫病关系的认识[16，24］．

为了解弓形虫病动物模型中脑神经递质水平的变化，本研究首先在BALB/c小鼠中建立PRU-II株慢性弓形虫病模型。弓形虫I型毒株可诱发急性弓形虫病，表现为流产和严重的弓形虫病，最终导致小鼠死亡。因此，为了保持小鼠存活和组织中囊肿的形成，根据本研究的结果，我们使用了PRU-II菌株[25］．应用MAT检测了中试小鼠血清中的抗体，并用显微镜和分子方法证实了囊肿的形成弓形虫PRU-II菌株在诱导慢性弓形虫病在活的有机体内也

似乎这项研究的结果更能证实弓形虫病感染宿主的神经递质信号可能发生的变化。这一机制可用于神经退行性疾病的治疗。

5.结论

本初步研究可能证实前人关于弓形虫病与神经退行性疾病关系的研究结果，也为进一步开展弓形虫病与神经退行性疾病关系的研究开辟了新的途径。在未来的研究中，使用更多的样本和不同的技术来评估血清酪氨酸和多巴胺水平可能会改善我们所获得的数据。慢性弓形虫病动物模型的血清酪氨酸和多巴胺水平可与脑酪氨酸和多巴胺水平进行比较。

数据可用性

这些数据可以从Shiraz Medical Sciences大学研究事件的副校长获得。

信息披露

以下链接提供了手稿的预印本:https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.12.17.423217v1．

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了设拉子医学科学大学的支持，批准号16519。

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