巢式PCR-异源双链流动性分析法测定中华鳖2区遗传多样性的研究恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1基因

摘要

遗传多样性疟原虫寄生虫有显著相关疟疾控制和疫苗开发。这个P、 恶性肿瘤裂殖子表面蛋白1(Pfmsp1)基因是区分遗传多样性的常用分子标记。本研究旨在建立巢式PCR异源双链流动性分析（nPCR-HMA）以测定Pfmsp1基因。MAD20家族等位基因P、 恶性肿瘤用作退火和聚丙烯酰胺凝胶电泳条件的优化的控制。为了评估开发巢式PCR-HMA，8个临床P、 恶性肿瘤对分离株进行等位基因变异检测。结果显示有9个等位基因变异。我们的研究表明，与核苷酸测序相比，成功的nPCR-HMA具有良好的精密度和准确性，为大规模的分子流行病学研究提供了一种更快速、有效和廉价的方法。

一。背景

疟疾是一种严重的传染病，由属于疟原虫由雌性按蚊媒介传播给人类。它是一个全球性的重大公共卫生问题，特别是在热带和亚热带地区。尽管为根除或控制疟疾作出了广泛的努力，但这种疾病仍然是发病率和死亡率的主要原因[1个]. 2017年，约有2.19亿人面临疟疾风险，疟疾死亡人数估计为43.5万[1个]。

人类疟疾是由五个物种引起的，包括P、 恶性肿瘤,间日疟原虫,疟原虫,P、 卵形,和诺氏疟原虫. 其中，P、 恶性肿瘤是最普遍和最危险的。P、 恶性肿瘤在世卫组织非洲区域以及世卫组织东南亚区域（62.8%）、东地中海（69%）和西太平洋（71.9%）的大多数疟疾病例中，99.7%的疟疾估计病例是由疟疾引起的[1个]。

疟疾感染的传播和死亡率与几个特征有关。外国工人从流行地区移民到各国的人数增加，可能导致疟疾在各地区之间的传播[2个–5个]。此外，该遗传变异已经被报道为机制的一个原因来自宿主的免疫反应，和增加的阻力的抗疟药[逃逸6个–9个]也就是疟疾传播的原因。

利用疟原虫种群的基因分型研究疟疾感染的遗传多样性，综合考虑传播强度、抗药性、精确治疗、宿主免疫和流行病学研究等因素。因此，简单、准确的遗传多样性检测技术应运而生。已有多种分子技术用于遗传多样性检测，包括巢式PCR、限制性片段长度多态性（RFLP）、单链构象多态性（SSCP）、异源双链追踪分析（HTA）、异源双链迁移率分析（HMA）和DNA测序。人类免疫缺陷病毒（HIV）和其他病毒的亚型、鉴定和分类已使用HMA[10个–14个]. 与DNA测序相比，HMA是一种简单、快速、灵敏、经济的技术[10个]。

HMA的原理是以参考DNA和样品DNA为基础，分别扩增、混合、变性和缓慢冷却，使参考DNA和样品DNA之间的不完全碱基匹配形成异源双链。然后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对其进行了测定。异源双链型同源双链迁移的差异表明参考DNA和样本DNA的核苷酸序列存在差异。这是由于不匹配的区域呈现单链结构，迁移速度慢于完全匹配的dsDNA。在这个系统中，如果样本DNA与参考DNA不完全匹配，将观察到多条带。迁移最快的带是同双工参考DNA和/或同双工DNA样本。具有不匹配的异双工带的迁移速度比同双工带慢。HMA易于应用于大量样品，特别适合于PCR产物的分析，因为样品DNA和参考DNA必须具有相同的大小。在PCR中，这与使用相同的扩增引物相对应。

从原理上讲，HMA具有3条带的特征：第一条带是由完全序列匹配的自DNA或样本DNA中的完全序列匹配引起的以同双工带形式快速移动的DNA。第二条带是两个DNA序列不完全匹配引起的最慢移动带。最后一条带是在退火步骤中出现的单链DNA，退火步骤中有一个与参考DNA相匹配的DNA，与样品无关；降低温度以最小化单链部分DNA的匹配，从而形成单链DNA带。

这个P、 恶性肿瘤裂殖子表面蛋白1(Pfmsp1)基因是一种典型的遗传标记，可以用来确定感染的遗传多样性和多样性P、 恶性肿瘤[15个–17岁]。PfMSP1型位于9号染色体上的17个基因座，其中2号基因座在世界范围内具有普遍的等位基因多态性[16个,17岁]。块2等位基因主要由三个家族，即，K1，MAD20和RO33在野外分离表示。这些家庭的等位基因序列表现出高度多样化和具体地域分布[18岁]. 此外，block 2等位基因的模式和片段大小多态性可作为分子指标、宿主免疫和疟疾传播动力学[19个]。

然而，关于HMA的数据调查了Pfmsp1基因尚未评估。在这项研究中，我们发展并评估了巢式PCR异源双链流动性分析（nPCR-HMA），以确定Pfmsp1基因在块2的区域。该技术可用于筛选P、 恶性肿瘤疟疾流行区的遗传多样性、再感染、复发和分子流行病学研究。

2。材料和方法

2.1。样品采集

这项研究是由兰实大学的伦理委员会，泰国（RSUERB2019-061）审查。合格的样品由8P、 恶性肿瘤-镜检发现感染血液。血样采集自泰国疟疾流行地区，包括Mae Hong Son和Kanchanaburi省。P、 恶性肿瘤-在EDTA管中采集阳性血液样本，约100 μ将1份血样滴在一张Whatman 3M滤纸上并干燥（干血点；DBS）。每个DBS在运输到实验室之前，在室温下单独储存在小塑料袋中，直到下一步调查。

P、 恶性肿瘤MAD20、RO33和K1家族参考DNA，它们是重组质粒，含有Pfmsp1由Ngrenngarmlert等人描述[二十]。已知序列参照DNA（重组克隆）被显示在图1个.这个P、 恶性肿瘤K1泰国国家科学技术发展办公室Sumali Kamchonwphaisan博士提供的文化被用作单克隆P、 恶性肿瘤控制。

2.2。DNA提取

寄生虫DNA是使用的Chelex方法具有一些修改[从DBS提取21岁]. 将DBS片放入微型离心管中，300 μ加入无菌蒸馏水升。After 10 min room temperature incubation, 300 μ将l上清液移入微量离心管，然后加入1 ml无菌蒸馏水，在室温下孵育30 min。在12000 rpm下离心3 min后，取出上清液，加入6%Chelex-100树脂（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA），然后，将试管在56℃下孵育30 min，然后在100℃下孵育8 min。在12000 rpm下离心3 min后，将提取的DNA上清液保持在-20℃下长期保存。

2.3条。区块2Pfmsp1巢式PCR扩增基因

巢式PCR扩增P、 恶性肿瘤DNA是使用Techne TC-3000热循环仪（化学科学，美国）进行的。根据Snounou等人的研究结果进行初步PCR。[22个]；对应于Pfmsp1前向引物M1-of:5组成的基因 -ctagagagcttagaagatgcagtattg-3型和反向底漆M1-或：5 -CTTAAATAGTATTCTAATTCAAGTGGATCA-3 .PCR反应在20 的最终体积内建立μl含1 μDNA提取l，每个引物250 nM，含有1.5 mM MgCl2的10x PCR缓冲液（美国Invitrogen），125 nM dNTPs，和1单位Taq DNA聚合酶（韩国内含子）。PCR扩增条件为：95°C初始变性15 min，94°C 25次循环变性1 min，50°C持续变性2 min，72°C持续变性2 min，最终延伸至72°C，2分钟。第二次PCR是用之前由Ngrenngarmlert等人设计的特异性引物对block 2区域进行的[二十]，正向和反向引物为C1F:5 -GAAGATGCAGTATTGACAGG-3和C3R:5 -TGATGGTTAATCAAGAG-3型 ,分别是。第二次扩增所用的条件和PCR反应与第一次PCR相同，只进行了24个周期的扩增。用1.8%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分光光度法检测PCR产物。

2.4条。异源双相迁移率测定（HMA）的研究进展Pfmsp1等位基因多样性

2.4.1条。选择参考DNA进行异源双链迁移率分析（HMA）

在本研究中，MSP-1块的参考克隆2（K1，MAD20，和RO33）的核苷酸序列是在重组质粒中克隆的DNA序列。控制DNA从扩增P、 恶性肿瘤K1文化。

随机抽取三个样本（S1、S2和S3）来寻找HMA的参考DNA。每个样品的nPCR产物与来自三个参考DNA（S1+MAD20、S2+MAD20、S3+MAD20、S2+RO33、S2+RO33、S2+RO33、S3+K1、S3+K1和S3+K1）的nPCR产物反应。

HMA分析包括5 μ含的块2的PCR扩增子L的Pfmsp1从通过巢式PCR，1第二反应 μl个10x退火缓冲液（1 M NaCl，100 mM Tris HCl，pH 7.5，20 mM EDTA），1 μ6x DNA加载缓冲液l，5 μ一份参考DNA。HMA条件为：98℃变性3min，变性后4℃杂交15min。用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳在10 mA下进行1.30 h的异双工产物分析，用溴化乙锭染色，在紫外线透照仪下观察。选择一个参考DNA是通过观察三个样本中每个样本的参考DNA最清晰的杂双工带来完成的。

2.4.2。在最佳条件下进行异源双链泳动分析法（HMA）

该HMA条件与从上述步骤中选择的参照DNA进行测试。所选择的参照DNA和DNA K1与比例分别为2 μ升/ 2 μl和5 μ升/ 5 μl在98℃下变性3分钟；变性后，在4℃下将DNA片段杂交15分钟。采用6%、8%、12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，在10 mA下进行1.30 h的电泳分析，观察到杂双链产物。选择最清晰的杂双工带条件进行下一步分析。

2.4.3。遗传多样性Pfmsp1由HMA分析

如通过前述的研究中选择的最佳条件被用来研究对Pfmsp公司8个临床样本中的1个多样性。

2.4.4。HMA的解读

异质双工迁移率的测量以迁移率指数（MI）表示，如下式所示。在这项研究中，我们使用P、 恶性肿瘤以K1菌株为对照，测定参考DNA间的异源双链模式。

2.4.5条。已建立HMA的验证

在本实验中，我们利用HMA的最佳条件来验证HMA的遗传多样性和可靠性。此外，通过运行内和运行间重复测试样品，以评估测试的精度。（一）用HMA计算10个重复检测的Ref-DNA/K1杂双工的MI值的标准差（SD）（二）在选定的4个样本中进行了三次重复实验，以计算MI值和变量，但没有解释

2.5条。数据分析

数据由MI（％）为每个频带双工显示。带方差的类别是通过使用的参照DNA + K1 HMA MI异源条带的SD值用于设定间隔值设置。感染复数（MOI）的多重性是由呈现异源双链或同源双链体频带的多于一个的频带所决定的。所建立的HMA的精度是由变异系数（CV％）呈现。

三。结果

3.1条。区块2Pfmsp1巢式PCR扩增基因

DNA样本Pfmsp1基因扩增为PCR阳性，产生约350 bp的PCR产物，如图所示2个.

3.2条。HMA的优化

HMA的最佳条件通过使用进行Pfmsp1恶性疟原虫MAD20，RO33，和K1参照DNA退火与随机选择的三个样品每（S1，S2，和S3）。在数字中三我们发现，在所有被测样品中，在与MAD20 DNA退火的通道中都有明显的杂双工带。因此我们选择MAD20作为HMA下一步的参考DNA。

并对聚丙烯酰胺凝胶百分率和DNA体积进行了验证。用12%的聚丙烯酰胺凝胶和5 的聚丙烯酰胺凝胶作为HMA的最佳条件，可以得到一个很好的杂双峰带μ用10 mA静电作用1 h和30 min，用K1培养对照DNA检测MAD20参考DNA。在数字中4个结果表明，K1+K1和MAD20+MAD20双链DNA均为同双工1条带，每条带均为单链DNA。只有lane-MAD20+K1基因呈现一条异质双工带。

在数字中5个，结果显示在样品H18和H24同源双链和异源双链的频带使用MAD20参照DNA的代表性凝胶图像。

3.3条。遗传多样性Pfmsp1基因座2通过套式PCR-异源双链移动性分析（nPCR的-HMA）使用MAD20作为参考DNA

利用上述最佳的HMA条件，验证了小麦品种的遗传多样性Pfmsp18例临床血样感染的block 2基因P、 恶性肿瘤. 实验是通过混合Pfmsp1在变性和退火之前，用MAD20参考DNA从每个样品中阻断2个DNA。如图所示6个，我们在样品H14和H18中发现了2条异双工带，它们被称为MOI。样品H21、H24、G3和G11获得1条异源双链带（单菌株感染）。有两个样品没有异质双工带（H22，G6）。这显示了在同一页的不同运动带上观察到的8个等位基因变体的等位基因多样性。包括2个没有杂双工带的样本，我们在8个样本中共发现9个等位基因变异。

3.4条。应用MI进行nPCR-HMA遗传多样性分析

接下来，我们用MI值验证了异质双工带。测量每个频带的运动来计算MI。结果如表所示1个. 结果表明，心肌梗死的差异在5.32%～17.39%之间。

通过MI值的变化分析等位变异。8个样本的MI值结果显示，8个变体的MI值不同，如表所示1个.

用HMA计算10个重复试验的MAD20+K1培养对照杂双工的MI值的标准差（SD），如表所示2个. 然后，使用这个SD值（0.8）作为间隔值，从MI 5（最低MI的圆值）开始设置间隔刻度，如表所示三. 结果表明，5号等位基因型最为普遍( )( )其次是没有。1（ ).

3.5条。效率验证

3.5.1。再生性

套式PCR为产品Pfmsp1用K1和MAD20的block2基因对HMA进行10次重复验证。计算异源双链DNA的MI。结果发现MI的变异系数（CV%）小于10%( )如表4个. 抽样选择了4个样本，H14、H18、G3和G11，这些样本通过各三倍MI对基因变异进行分类。结果表明，5/6等位基因变异数相同（83.33%）。但所有样本在每个重复中都呈现相同数量的异源双工带（100%）。这表明所建立的nPCR-MHA具有良好的重现性，如表所示4个.

3.5.2条。准确度验证

进行这一实验，通过使用来验证HMA的精度P、 恶性肿瘤（K1），其具有通过核苷酸测序用DNA MAD20 77％的相似性和它们之间执行的HMA。结果发现只有一个异带和一个同源双链带。在MAD20 DNA中发现的单一同源双链体带匹配MAD20 DNA或DNA K1匹配K1 DNA。这表明，HMA性能理论礼物的MHA的准确性。

4。讨论

广泛的遗传多样性P、 恶性肿瘤随着抗药性和MOI检测水平的提高，现场分离株被认为是研制有效疫苗的主要并发症P、 恶性肿瘤疟疾。因此，需要在临床分离株来自不同流行地区疟疾寄生虫的遗传多态性调查，以控制疾病和疫苗的开发。其中最常用的标记的基因分型P、 恶性肿瘤是PfMSP-1型[二十,22个,23个]。

在这项研究中，我们开发的巢式PCR-HMA使用P、 恶性肿瘤MAD20作为参考DNA并进行验证筛选Pfmsp公司1等位基因变异，因为HMA已经被证明在遗传变异检测方面有很高的效率，正如先前报道的那样[10个,24个,25个]。此外，它是简单的和更具成本效益的对核苷酸测序。

用于放大Pfmsp公司1个基因的产物大小为300-400 bp，在8个样本中全部成功（100%）。这表明该方法具有高灵敏度（100%）来放大Pfmsp公司1个靶基因。

我们已经建立了使用MAD20的最佳条件P、 恶性肿瘤DNA作为参考DNA和P、 恶性肿瘤培养的K1菌株作为对照DNA的应用μ在98℃变性3 min，退火15 min的条件下，用10 mA、1 h和30 min的恒电流源进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，每种nPCR产物均能呈现出明显的异双工和同双工带。这表明该技术可用于分离P、 恶性肿瘤感染的方便和快速的用于大量样品的同时进行。

此外，已建立的套式PCR-HMA可以区分P、 恶性肿瘤等位基因变异体为8个临床分离株中的9个等位基因变异体。这清楚地证实了这一点，因为每个被测样品都在同一条聚丙烯酰胺凝胶电泳线上。结果表明Pfmsp1具有良好的效率检测的遗传多样性P、 恶性肿瘤。

Compared to previous researches, this study showed more rapid than the report by Kuroiwa (Kuroiwa et al., 2004), which can be excluded species of respiratory syncytial virus A for 31 alleles by using 150 V at 3 hours. In addition, Wang & Hiruki (Wang & Hiruki, 2001) differentiated the aster yellows phytoplasma group and the clover proliferation which uses voltage of 200 to 250 V, 3 to 4 hours. Nevertheless, there is a report that presented that HMA are less time-consuming than this study, such as the study of species differentiation of enteric adenoviruses by using 110 V, 75 minutes (Soares, et al., 2004). However, these depend on different DNA sizes, concentration of polyacrylamide gel, and the voltage of polyacrylamide gel electrophoresis.

这项研究表明，已建立的nPCR-HMA从8个临床样本（25%）中发现了2个MOI，这证明了该方法在基因分型方面的潜力，并且在P、 恶性肿瘤在泰国。

对所开发的nPCR-HMA质量的验证表明，该方法具有较高的精密度，CV为5.59%。此外，试验还显示相同数量的带出现（100%），也显示相同的等位基因数（83.33%）。MAD20参考DNA与K1之间的HMA试验是一个单系育种，只发现1个异源双链。此外，实验表明MAD20/MAD20或K1/K1 HMA的测试没有杂双工带，但它们只呈现同双工带。我们的结果表明，一个开发的nPCR-HMAPfmsp1基因的等位基因有检测的一个很好的准确度和精密度。

5个。结论

我们发现，建立的巢式PCR-HMA是能够检测从巢式PCR扩增子衍生的异源的快速和可重复的方法PfMSP1型块2目标站点。它可以区分P、 恶性肿瘤等位基因变异体为8个临床分离株中的9个等位基因变异体。这一点得到了明确的证实，因为每个被测样品都在同一条聚丙烯酰胺凝胶电泳线上。此外，我们可以用MI对等位基因变异进行分类，具有很高的重复性和准确性。结果表明，所建立的套式PCR-HMA方法是一种有效的筛选方法Pfmsp公司1等位变异，表明P、 恶性肿瘤从临床分离株具有较高的遗传多样性。这些结果还显示，混合感染等位的高发病率。

数据可用性

本文包含了支持本研究结果的数据。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

Warune Ngrenngarmlert监督实验室处理和修订最终手稿。Sakone Sunantaraporn参与了分子分析并起草了手稿。安娜·杰玛参与了样品采集和分子分析。Kanyanan Kritsiriwuthinan设计了研究，进行了分子分析，总结了数据，并编辑了最终的手稿。所有作者都批准了手稿的最终版本。

致谢

作者要感谢Thippayarat Pipathanabawonkul和Suchada Wongkhampoo在准备用于测试的样品方面提供的帮助。这项工作得到了泰国朗斯特大学的资助.

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