的在体外水提取物的Antiplasmodial活动选择加纳草本植物

文摘

背景。无性和有性阶段(配子体)恶性疟原虫的寄生虫抗疟药的反应不同。草药产品扩展的治疗方案和剂量不足信息被广泛用来治疗疟疾在加纳。本研究确定在体外活动选择草药提取物对疟原虫无性和性的发展阶段。方法。基于72小时SYBR绿色在体外药物分析是用来确定无性寄生虫生长抑制效应表现出的水提取物Alchornea等,Polyalthia叶,辣木属鉴定,Mangifera籼NF54, CamWT_C580Y, IPC 4912株恶性疟原虫。无性接触的影响和早期NF54配子体在不同浓度的水溶液草药提取物被显微镜评估后7天连续培养的草本提取物的存在。定性和定量植物化学的筛选也表现在草药提取物。结果。SYBR绿色1分析,水提取的Alchornea等表现出温和(集成电路₅₀5.8、17.4和15.8μg / ml)Mangifera籼表现出低(集成电路₅₀65.4、96.7和81.7μ对NF54 g / ml)活动,凸轮WT_C580Y, IPC 4912寄生虫,分别,而Polyalthia叶和辣木属鉴定是不活跃的。长期治疗的NF54寄生虫1毫克/毫升Polyalthia叶产生配子体的最高密度和无性的最小(56%)抑制寄生虫在7天。长期治疗与10 NF54寄生虫μ克/毫升Alchornea等导致完成寄生虫在7天(无性和配子体)间隙。结论。Alchornea等表现出“温和”活动对三个寄生虫测试72小时SYBR绿色1化验,还有效地清除了无性寄生虫和配子体。长期治疗疟疾寄生虫的草药提取物模仿一个治疗方案,应当用于确定草药提取物的抗疟属性。

1。介绍

最近的报道出现青蒿素耐药性及耐青蒿素恶性疟原虫(P。恶性疟原虫)寄生虫呼吁更多的创新方法来控制和最终消灭疟疾1]。配子体,性传播形式的疟疾寄生虫已经提出在每一轮的无性复制生产主机(2]。配子体发展经历了五个发展阶段:早期(阶段I, II, III)也称为年轻的配子体和晚期(阶段IV和V) /成熟的配子体。体内配子体发育是已知的最后10天(3];然而,在体外,可以区别于早期配子体无性寄生虫连续培养7天后(4]。

简单的一线抗疟治疗恶性疟原虫疟疾全球包括青蒿素,这是一个快速的抗疟药(5合伙人)结合抗疟药物如lumefantrine和称为青蒿素联合疗法(ACT) (6]。治疗剂量的抗疟药的配方,以确保完整的间隙感染疟疾寄生虫;然而,耐药寄生虫或drug-tolerant寄生虫已经进化,在药物压力下茁壮成长7]。恶性疟原虫寄生虫对青蒿素类抗疟药最初报道在柬埔寨的8和也被确定在非洲9]。这些出现青蒿素耐药性的寄生虫产生更多的配子体在活的有机体内(10因此加强疟疾传播。

食用含有提取一个或多个的草药草药等Alchornea等(一个。等),Polyalthia叶(P。叶),辣木属鉴定(米。识别鉴定),Mangifera籼(米。籼稻在加纳)治疗疟疾的高(4,11]。在加纳,草药抗疟治疗过程中产品范围1 - 2周(4]。暴露的P。恶性疟原虫寄生虫药物浓度以及不佳与抗疟药物治疗方案会导致寄生虫抗药性发展(12,13]。

许多研究已经确定的抗疟活性草本提取物对无性致病寄生虫药物使用标准的72小时试验(14- - - - - -18),他们的活动分为“好”( μg / ml),“温和的”(IC₅₀10μ50 g / mlμg / ml),“低”(IC₅₀50μ克/毫升到100μg / ml),“不活跃”( μg / ml)基于产品的浓度,导致寄生虫患病率降低50% (IC₅₀)值19]。再治疗方案的影响在两个无性寄生虫更频繁地和配子体待定。在这项研究中,水提取物的短期和长期影响的四个选择草本植物来自加纳的西部地区疟原虫体外测定使用增长出现青蒿素耐药性的IPC_4912,青蒿素敏感CamWT_C580Y和chloroquine-sensitive NF54P。恶性疟原虫寄生虫。

2。材料和方法

2.1。识别和处理的草本植物

新鲜的叶子Alchornea等(一个。等),Polyalthia叶(P。叶),辣木属鉴定(米。识别鉴定),Mangifera籼(米。籼稻)从西部地区获得加纳和发送到加纳大学的植物学家标本以及研究官(农作物科学家)植物医学研究中心(CPMR)标本,Mampong,加纳,识别虽然没有凭证标本。树叶在搅拌机风干和地面成粗粉。整个数量的粉末一个。等(21.5克),米。籼稻(32.0克),P。叶(17.1克),米。识别鉴定(6.7 g)树叶单独煮在475毫升100°C H₂一个小时。解决方案被留给18个小时在室温下之后,他们三次过滤使用绘画纸™54滤纸,随后冷冻乾(冻干)使用Labconco™冷冻干燥机。股票浓度(50毫克/毫升)的每个草药产品是由重组250毫克的每个冻干产品为5毫升无菌水。股票的解决方案是通过0.2过滤消毒μm Acodisc™过滤和储存在-20°C,以供将来使用。

2.2。培养的疟原虫

无性的文化NF54 (mra - 1000:氯喹敏感),CamWT_C580Y (mra - 1250:青蒿素敏感),和IPC 4912 (mra - 1241:青蒿素耐药)在体外使用修改后的方法Zirihi et al。17和类似于Amoah et al。4]。简而言之,这些寄生虫是单独培养4%比容(O +红细胞(红血球))完全寄生虫媒体(CPM: RPMI 1640和消息灵通的补充,谷酰胺,NaHCO₃、葡萄糖、庆大霉素和AlbuMAX II)在T75培养瓶血压得到较好的控制。文化是保持在一个孵化器为37°C与日常媒介变化与CPM和气体交换(92.5%的氮,5.5%的二氧化碳,和2%氧气)。

同步ring-stage寄生虫被治疗获得一种文化包含超过5% ring-stage寄生虫的溶液5%山梨糖醇。同步后两天(48小时),主要的文化,ring-stage寄生虫SYBR绿色1测定镀在2%或1% parasitaemia长期寄生虫暴露试验。

2.3。72小时SYBR绿色我无性寄生虫药物试验

类似的协议描述Quashie et al。20.)和Smilkstein et al。21)与一些修改是用来确定水提取物的抑制效果不同P。恶性疟原虫寄生虫。简单地说,一个96孔细胞培养板充满了五个复制50μl 20毫克/毫升的两个草药提取连续6额外的浓度稀释10倍至0.02μ克/毫升。第一个2五倍的井都补充了50μl未感染的红细胞(红血球)设定在2%比容CPM;过去3井补充了50μl感染红细胞(iRBCs)设置在CPM寄生虫血症2%和2%比容。最后一组重复井满是50μl受感染的红细胞parasitaemia红细胞容积(iRBCs)设定在2%和2% (ring-stage寄生虫)CPM和补充50μ青蒿琥酯(20 lμ克/μl)连续稀释10倍6浓度与CPM直到0.2 ng / ml(板设置在补充文件的示意图1)。盘子被存入一个模块化的孵化室,加油72小时6分钟,然后孵化。盘子被包裹在铝箔和存储在一夜之间在-80°C,该板后在室温下解冻。两个技术复制板块设置为每个草药提取物。每一个物质的,100μl缓冲SYBR绿色(2 x SYBR绿色1染料在20毫米Tris-HCl, pH值7.5补充5毫米EDTA, Triton x - 100, 0.08%和0.008%的皂苷在PBS)添加和混合。盘子被包裹在铝箔和存储在一个孵化器37°C 1小时。荧光当时读标在490 nm励磁和530海里排放。

2.4。长期寄生虫暴露试验

这个试验是复制从Amoah et al。4)和一些小的修改。短暂,每一股草药产品是稀释在200年CPM获得工作的解决方案μ20 g / ml,μg / ml,和2μ克/毫升。未经处理的CPM(不添加补充)作为一种消极的控制,和5 ng / ml青蒿琥酯用作积极控制。一百毫升的每个草药产品的工作浓度和控制被添加到个人用24孔板井。一百毫升的寄生虫文化寄生虫血症1%和4%分血器添加到medium-filled板和放置在一个模块化®孵化室。室被毒气毒死了6分钟,混合气体(92.5%的氮,5.5%的二氧化碳,和2%氧气)和放置在一个孵化器在37°C。文化在板上的媒体改变了最初的开始每日媒介(CPM补充了100μ10 g / ml,μ克/毫升,1μ克/毫升的草本提取物)在整个试验。薄膜涂片准备在7天的每日媒体每天都在变化。涂片固定在无水甲醇和沾10%染色15分钟。每日涂片是加工和复合使用100 x光显微镜下观察油浸物镜;然而,只有天7涂片红细胞表面数1000 5000年无性寄生虫和红血球的配子体。每个试验是在重复,重复进行至少两次。

2.5。定性的植物化学成分分析

植物化学的筛选个人水草药提取物进行使用以前公布的协议(22- - - - - -28]。起泡的考验皂苷(29日];费林的还原糖(测试29日];聚糖醛酸,氯化铁检测酚类化合物和生氰苷;迈耶的检测生物碱;信田的测试类黄酮;Salkoski测试三萜和植物甾醇进行(29日]。anthracenosides的存在也决定使用协议中描述Benmehdi等的研究(25]。所有化验进行没有修改出版协议和建立至少一式三份,重复两次。

2.6。定量的植物化学成分分析

水提取物的总酚含量一个。等和米。籼稻确定使用Folin-Ciocalteau方法(30.- - - - - -32]。总类黄酮含量测定使用的过程类似于Madaan et al。(32),和总皂苷含量是决定使用方法类似于报道Karimi et al。33]。

所有分析都是一式三份,至少重复两次。

2.7。统计分析

SYBR绿色1药物化验,数据从草药extract-treated获得未受感染的红细胞被用作背景和减去从相应的数据集被感染的红细胞。数据转换、规范化和nonfit线性回归测试(日志(抑制剂)和归一化响应测试),使估计的50%抑制浓度(IC₅₀为每个草药产品)。

50%抑制浓度(IC₅₀)代表所需的产品杀死寄生虫内容样本总数的50%。

NF54寄生响应的差异与草药产品7天治疗被双向方差分析估计使用GraphPad棱镜®5.0软件包(GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。无性寄生虫血症和gametocytaemia(早期配子体)连续文化的分析计算后得到5000每薄涂片红细胞。

无性的%抑制寄生虫生长7天在Excel中使用公式计算: 。

7天的影响暴露于配子体发展草药产品是根据公式计算: 。

统计学意义的值设置为0.05,除非另有说明。

3所示。结果

3.1。草本提取物准备药物化验

冻干产品的收益率从地面留下9%不等米。籼稻年的15%米。识别鉴定(表1)。

3.2。无性寄生虫生长抑制

50%抑制浓度(IC₅₀)估计一个。等和米。籼稻针对NF54 5.81μ和65.36克/毫升μg / ml,分别比要低得多米。识别鉴定和P。叶,都是在100年μ克/毫升(表2补充文件2)。Alchornea等和米。籼稻随后测试artemisinin-sensitive (CamWT_C580Y)和出现青蒿素耐药性的寄生虫(IPC 4912)隔离使用相同的浓度范围,和两个提取物吗Alchornia等和米。籼稻表现出“温和”和“低”集成电路₅₀值出现青蒿素耐药性和artemisinin-sensitive寄生虫隔离(表2和补充文件3)。辣木属鉴定和P。叶的抗疟活性对NF54寄生虫“不活跃”范畴,并没有进一步评估活动对artemisinin-sensitive和出现青蒿素耐药性的寄生虫。

3.3。长期治疗的无性寄生虫(如)草药提取物

文化的P。恶性疟原虫NF54寄生虫治疗1、10或100μg / ml的所有四个草药提取物表现出显著减少( ,图基的事后考验,补充文件4)寄生虫密度连续培养7天后在对待媒体相比,寄生虫密度在未经处理的媒体。在1μg / ml,四个草本提取物表现出类似的( ,图基事后测试)活动的无性繁殖的寄生虫。文化处理10μ克/毫升一个。等表现出近100%的寄生虫抑制,明显不同于其他三种提取物的抑制表现出( ,图基的事后测试)。100年文化对待μ克/毫升米。籼稻疟原虫抑制,导致100%,但100年文化接受μ克/毫升P。叶和米。识别鉴定分别达到75和80%(图1)。在积极控制文化抑制了100%,没有寄生虫(无性或配子体)连续7天治疗后存活在媒体补充5 ng / ml的青蒿琥酯。

3.4。配子体在不断发展与草药提取物治疗

七天的连续培养NF54寄生虫在体外日常媒介变化没有红细胞补充导致微分配子母细胞密度的处理和未经处理的文化(图2)。在1μg / ml,一个。等是唯一的产品,展示gametocytocidal活动;其他三个产品都增强配子体生产。10点μg / ml,一个。等配子体表现出99%抑制,显著提高( ,图基的事后考验;补充文件4)的抑制作用表现出类似的其他三种提取物的浓度。Mangifera籼配子体的数量产生显著高于未经处理的文化甚至在10μ克/毫升( ,图基的事后测试)。一般的剂量反应效果,提取物浓度的增加收益率更高gametocytocidal活动和所有提取除外P。叶表现出近100% gametocytocidal活动在100年μ克/毫升。没有显著减少在配子体之间观察到的流行文化中对待10μ克/毫升和100年μ克/毫升P。叶。

3.5。植物化学的分析

定性和定量的植物化学成分进行了分析一个。等和米。籼稻活动,既表现出对无性繁殖的寄生虫。水提取物含有还原糖,酚类化合物和黄酮类化合物。米。籼稻含有皂甙,缺席一个。等(表3)。一个。等有较高含量的总酚醛树脂和总类黄酮比吗米。籼稻(表4)。

4所示。讨论

Alchornea等,米。籼稻,P。叶,米。识别鉴定组件的一些著名的草药抗疟产品在加纳的阿散蒂地区34]虽然不是知名的草药抗疟产品特马大阿克拉的大都市地区的加纳(补充文件5)。许多研究有一些草药提取物的抗疟属性特征;然而,只有少数研究报道的影响,长期管理草药产品的浓度变化对疟原虫(4]。本研究确定了集成电路₅₀值以及评估暴露的长期影响疟疾寄生虫在不同剂量的选择草药提取物artemisinin-sensitive和出现青蒿素耐药性疟疾为了决定是否延长草本提取物能提高配子体生产以及访问它们的有效性对出现青蒿素耐药性的寄生虫。

在这项研究中,米。识别鉴定被发现对无性NF54活动吗P。恶性疟原虫寄生虫。这类似于先前的发现methanolic提取的米。识别鉴定表现出对战俘和Dd2低,没有活动P。恶性疟原虫菌株,分别35]。不活动的P。叶对NF54寄生虫是一个水与最近的一份报告中P。叶叶子提取物表现出适度的活动3 d7疟原虫(36但是支持先前的研究P。叶展出活动接近“不活跃”范围(92.6至100μ针对K1 g / ml)P。恶性疟原虫疟原虫(37]。然而,总methanolic提取P。longifera被发现具有“温和”活动(集成电路吗₅₀22.04μ对K1应变(g / ml)38]。

50%有效浓度(EC₅₀)提取的一个。等对3 d7水果P。恶性疟原虫使用这种寄生虫疟原虫乳酸脱氢酶测定4.9被发现μ克/毫升(39类似于5.81μg / ml的NF54应变这一研究获得的(表2补充文件2)。另一项研究在加纳IC的估计数字₅₀50% ethanolic提取的一个。等叶3 d7寄生虫是14μg / ml使用类似SYBR绿色1试验[40]。集成电路的主要区别₅₀值可以归因于溶剂(41),的活性剂一个。等鞣花酸(42),这是比乙醇更溶于水。的水提物一个。等表现出“温和”活动对出现青蒿素耐药性的寄生虫(表2补充文件3),这是一个很好的迹象表明它具有强力的抗疟活性,可以有效地用于治疗出现青蒿素耐药性的寄生虫。的水提物米。籼稻表现出一个“低”活动对出现青蒿素耐药性的寄生虫(表2补充文件2),这意味着它不会是一个很好的候选人有效治疗出现青蒿素耐药性的感染,包括寄生虫。这两个一个。等和米。籼稻然而表现出类似的活动对artemisinin-sensitive和出现青蒿素耐药性的寄生虫隔离,这表明他们可能对疟疾寄生虫的行为模式从青蒿琥酯的作用方式不同,表现出10倍的差异50%抑制浓度对artermisinin-sensitive和出现青蒿素耐药性的寄生虫(表2)。

经过7天的连续的寄生虫的草药提取物,文化的浓度P。叶或米。识别鉴定测试能够明确感染寄生虫(图的100%1)。加上他们表现出一个活动对疟原虫的“不活跃”范围表明,水提取这两种草药不独立工作有效的抗疟药物。

配子母细胞数量的增加(提高配子体生产)在所有文化中对待1μg / ml的草药提取物(图2)可能是由于药物治疗不佳一直建议间接提高配子体患病率(12]。Polyalthia叶表现出至少gametocytocidal活动所有的测试浓度并没有表现出任何剂量响应,表明治疗疟疾P。叶在100年的浓度μg / ml下面可能维持疟疾传播的传播由于配子体治疗后的持久性。Alchornea等表现出最高的gametocydal活动(图2),即使在低浓度显示其潜在用途gametocytocydal代理。

一个。等和米。籼稻,表现出“好”和“低”抗疟活动,分别根据巴蒂斯塔的分类等。19),被选为定性植物化学的筛查,后跟一个定量的植物化学成分筛选阳性化合物定性屏幕(表中确认3和4)。尽管一些先前的研究已经报道这两种植物的植物化学的成分,它是重要的重复这项研究中使用的分析提取因为不同物种相同的植物43),以及某些生长条件,指出影响药用植物的植物化学的内容。草本植物化学的分析提取获得的植物生长在不同地理环境在植物化学的内容揭示了巨大差异(44),与热带雨林的土壤建议可以增加一些植物中的酚含量(45]。

在草本植物类黄酮和酚类化合物与抗疟活性(46),可能是更高的活动表现出的原因一个。等,其中包含着更高水平的酚类和类黄酮含量相对米。籼稻(表4)。的酚类内容一个。等被认为是主要由鞣花酸、水溶性多酚,建议负责antiplasmodial活动的一个。等(47]。

这项研究没有使用环生存的青蒿素敏感性分析来评估或验证在这项研究中使用的不同的寄生虫。还需要进一步的研究来确定一个。等和米。籼稻提取物表现出成熟gametocytocidal活动配子体。的抗疟活动组件的分数一个。等和米。籼稻还需要调查。

5。结论

Alchornea等表现出“温和”活动对三个寄生虫测试72小时SYBR绿色1化验,还有效地清除了无性寄生虫和配子体。长期治疗疟疾寄生虫的草药提取物模仿一个治疗方案,应当用于确定草药提取物的抗疟属性。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

信息披露

资助者没有影响项目的实施。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

琳达·e·Amoah构思和设计研究以及执行统计分析。伊丽莎白·Cudjoe Dickson Donu,露丝e . Okonu和琼斯Amponsah进行实验。

确认

作者感谢弗雷德里克Tei-Maya和便雅悯Ayensu系的生物化学、细胞和分子生物学,加纳大学以及员工系的植物和环境生物学,加纳大学的帮助执行定量植物化学的分析。我们也感谢BEIR / MR4所有的条款P。恶性疟原虫寄生虫(NF54 IPC 4912年和CamWT_C580Y)用于本研究。这个项目的部分支持由这本书和研究从加纳政府LEA津贴。

补充材料

补充文件1:插图SYBR绿色1试验板设置。补充文件2:NF54无性寄生虫生长抑制的图形表示形式。补充文件3:图形表示的IPC 4912和CamWT_C580Y无性寄生虫生长抑制。补充文件4:D7处理样本的统计分析。补充文件5:使用频率草药提取物在19个许可草药产品。(补充材料)

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