在体外gydF4y2Ba分析揭示合成细胞分裂素的影响“膨大增甜剂”(自由现金流量)Septin-Like蛋白质Taeniid CysticercigydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

细胞分裂素“膨大增甜剂”(自由现金流量),一个合成的细胞分裂素,使用专门为septins的表征。尽管基因组存在的证据,但没有什么是知道septin细丝在taeniid绦虫。这项工作的目的是确定的cysticerci septin-like蛋白的存在gydF4y2Ba绦虫crassicepsgydF4y2Ba和gydF4y2Ba有钩绦虫gydF4y2Ba利用推导出的氨基酸序列gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2Baseptin 4 (SEPT4_Tsm),设计并合成一个派生的免疫原性肽(残留88年至103年),准备一个特定的兔多克隆抗体,研究自由现金流量的影响在不同浓度和暴露时间gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba的文化gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2Bacysticerci。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba,自由现金流量改变的形态学和能动性gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2Bacysticerci及其影响是可逆的,在特定浓度。此外,我们观察到超微结构的观察,自由现金流量改变的细胞单元protonephridial绦虫的制度,在火焰基因丝模式的破坏细胞观察。兔多克隆抗体制备与合成肽公认的主要乐队41 kDa的寄生虫。我们的结果建立的重要性SEPT4_Tsm动力学和生存的taeniid cysticerci,以及他们对自由现金流量的易感性。这也是第一个报告,septin taeniids存在于细胞骨架。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

与肌动蛋白中间丝、微管septins被认为是细胞骨架的第四个分量。他们已经被证明在胞质分裂发挥重要的生物作用,招聘的蛋白质和组织/细胞骨架蛋白的重组。他们拥有一个分子的质量通常30 - 65 kDa, GTPase活性域。基于序列同源性和卷曲螺旋域的数量,哺乳动物septins分为四组:septin 2 (septins 3、9和12),septin 6 (septins 6、8、10、11和14),和septin 7 (septins 7和13)(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。实验,发现septins只有两个寄生虫,gydF4y2Ba曼氏裂体吸虫gydF4y2Ba(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),gydF4y2Ba秀丽隐杆线虫gydF4y2Ba(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。(合成细胞分裂素“膨大增甜剂”(N) - 2-chloro-4-pyridyl -N9-phenylurea或CgydF4y2Ba_12gydF4y2BaHgydF4y2Ba_10gydF4y2BaClNgydF4y2Ba_3gydF4y2BaO),称为自由现金流量,已被证明改变septin细丝的稳定性和功能在酵母和哺乳动物gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。在寄生虫,自由现金流量被发现影响septins只在吸虫的功能gydF4y2Ba美国曼gydF4y2Ba(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

绦虫crassicepsgydF4y2Ba绦虫是很好的实验模型研究绦虫病和囊虫病所致gydF4y2Ba有钩绦虫gydF4y2Ba寄生虫(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2Bacysticerci ORF应变可以恢复的实验感染小鼠的腹腔,导致有用的实验室模型相比其他绦虫的幼虫发育阶段,等gydF4y2Ba棘球绦虫granulosusgydF4y2Ba,gydF4y2Ba膜壳绦虫属娜娜gydF4y2Ba,gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2Ba。此外,gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2Bacysticerci ORF应变不感染人类,很容易学习gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。这一特点促进了寻找分子与潜在药理,诊断或免疫治疗对寄生虫病(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。由于其形态和细胞相似gydF4y2Bat .绦虫,t . crassicepsgydF4y2Ba使成功的细胞骨架蛋白的特性和变化表达式模式以应对antihelminthic药物(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)或其他潜在的抗化学物质(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

的形态gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2BaORF应变cysticerci很简单:囊肿是动态的囊泡满是水泡液,受限于一个连续的组织。在显微镜下,他们似乎构成的合胞体tegumental层的关键营养物质和废物的交换,以及开始关系的维护(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。作为他们的大小允许简单的显微镜检查,cysticerci可以方便地检查任何变更他们的连续运动。因此,绦虫的古典形态变化可能来自改变subtegumental的外观和火焰细胞,以及复杂的和复杂的protonephridial导管通过电子显微镜可见。肌球蛋白与肌动蛋白、微管蛋白,paramyosin [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba),任何化合物的影响细胞骨架蛋白的表达也可以评估的cysticercigydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2BaORF的压力。gydF4y2Ba

绦虫的生物学重要性或septin蛋白质的表达仍然是未知的。这是相反的报道存在septin基因的基因组绦虫,因此他们的产品在这些生物的作用。这个难题是加剧了一些septin基因似乎拥有规范的区域,而其他人似乎不完整。假设这些基因确实表示,由此产生的蛋白质可能会容易自由现金流量。因此,本工作的目的是执行gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba描述可能septin的幼虫阶段gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2BaORF应变和gydF4y2Ba绦虫。gydF4y2Ba本研究收益率的初步描述taeniid septins和建立在这些绦虫的生物学重要性,特别是针对可能的靶向药物。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。生物信息学分析gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2BaSeptin 4gydF4y2Ba

的SEPT4_Tsm序列gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2Ba是来自GeneDB (http://www.genedb.org)在加入TsM_000487200数量。一种蛋白质爆炸序列的搜索UniProt使用NCBI数据库中进行。使用Clustalω多重序列比对数据库,SEPT4_Tsm序列,SEPT7_Tsm, SEPT_Tsm, SEPT10_Tsm一致并与同源序列gydF4y2Ba美国曼gydF4y2Ba和人类。然后我们确定了septin图案(G1 (GXXXXGKS / T)、G3 (DXXG)和G4 (XKXD)],苏域,每个序列的卷曲螺旋结构。gydF4y2Ba

2.2。设计和生产的SEPT4_Tsm合成多肽和多克隆抗体的制备gydF4y2Ba

使用的氨基酸序列gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2Ba使用Emini SEPT4_Tsm,我们设计了一种免疫原性肽表面和Kolaskar Tongaonkar算法IEDB网站(gydF4y2Bahttp://www.iedb.orggydF4y2Ba)。预测的可访问性和免疫原性肽存在于SEPT4_Tsm序列,肽EPYYAEYANVGGVGEK,位于SEPT4_Tsm头寸88年和103年之间,由GenScript合成生物有限公司(美国新泽西州皮斯卡塔韦)脱盐纯度和四个c端修改的地图。多克隆抗体anti-taeniid生产与250年计划免疫新西兰兔gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL完整的肽resuspended Freund佐剂,紧随其后的是另外三个免疫与相同数量的抗原溶解在不完整Freund佐剂和磷酸盐(PBS)应用于密集的间隔。每次免疫后抗体识别评估1:50-1:10,000对抗寄生虫蛋白质提取的比率。gydF4y2Ba

2.3。寄生虫gydF4y2Ba

幼虫阶段寄生taeniids形式被用于目前的研究。Cysticerci的gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2BaORF菌株感染恢复三个月后,从实验的腹膜感染的雌性BALB / c小鼠5 - 7周的年龄,而gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2Bacysticerci解剖从自然感染猪。复苏后,寄生虫洗了PBS (pH值7.2),均质(PRO200;美国职业科学Inc .,牛津,CT)的冰,和细胞骨架resuspended缓冲区(磷酸6.7毫米、0.04 M氯化钾,1毫米MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,pH值7.4)(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba辅以商业鸡尾酒的蛋白酶抑制剂(完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板电脑;罗氏公司,德国曼海姆)。后,寄生虫被冻结在-70°C,直到需要。这项研究是Facultad伦理和研究委员会批准的药物,大学根据墨西哥(# IN216213)。gydF4y2Ba

2.4。在整个Cysticerci自由现金流量的影响gydF4y2Ba

恢复cysticerci后腹膜腔的老鼠,他们洗详尽与无菌PBS (1 M, pH值7.4),最后用之前的混合物antibiotic-antimycotic试剂(100×;GIBCO®,表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国)在PBS。然后,每口井的十个寄生虫被添加到24-well板。每个包含2毫升的RPMI 1640介质(美国Merck-Millipore,贝德福德,MA)补充消息灵通的3.4毫米,11.9毫米的碳酸氢钠和antibiotic-antimycotic解决方案。评估的影响自由现金流量(sc - 204759 a;圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX,美国),500年,50岁和5所示gydF4y2BaμgydF4y2BaM原液稀释工作准备的自由现金流量(500毫米在DMSO溶液溶解)。对照组的寄生虫是维护在RPMI 1640中只有0.1% DMSO补充。Cysticerci孵化了不同时期(0.25,0.5,1、5、24 h)在37°C和95%的相对湿度。观测进行一个奥林巴斯SZx7显微镜(奥林巴斯、东京、日本)在7:1缩放比例,耦合到佳能EOS叛军T31相机(佳能、日本东京)。视频编辑软件使用FinalCutPro X。图片和视频拍摄在不同时期种植。cysticerci的代谢活动是评估生物转化Alamar蓝色®试剂(表达载体)。恢复上层清液的光谱光度测量的读数记录在500 nm ELx808™吸光度标仪(美国BioTek Winooski, VT)和微密度值进行了处理和分析利用克鲁斯卡尔-沃利斯和Dunnett方法。所有样品都是评价一式三份。可逆的影响自由现金流量评估后消除FCF-free自由现金流量通过改变培养基中,观察的能动性cysticerci紧随其后。 For establishing the visual and quantitative effects of FCF on the viability of the cysticerci, we used 5μgydF4y2Ba米的商业死细胞荧光染色,SYTOX绿色核酸染色(S7020;美国马热费希尔科学、沃尔瑟姆),根据制造商的建议。在这种策略下,测量的相对荧光单位(RFUs)阅读使用协同™HTX多模标(BioTek)与两个光学过滤器:一个激励过滤器的485/20 nm和发射滤波器528/20 nm。用作死控制细胞,cysticerci被加热到65°C。然后,cysticerci与4%多聚甲醛固定,在显微镜下观察到20×放大(Diaphot;尼康,Chiyoda-ku,日本东京)配备一个数字化的配件和适当的过滤器。自由现金流量对肌动蛋白和的间接影响gydF4y2BaαgydF4y2Ba微管蛋白的gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2Bacysticerci进行评估与phalloidin-rhodamine cryosections和商业DM1A抗体中描述的其他研究由我们(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.5。由透射电子显微镜观察自由现金流量的影响gydF4y2Ba

1 h孵化后,gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2Bacysticerci恢复控制RPMI 1640包含两种不同的介质和介质浓度(50和500gydF4y2BaμgydF4y2Ba米),用PBS洗净,与2.5%戊二醛固定,与PBS 5分钟洗了三次,并与OsO后缀gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba在室温下1 h。然后,寄生虫和增加浓度的乙醇脱水,preembedded propylene-resin氧化物(2:1),和对待propylene-resin(1:1)和再次与propylene-resin氧化物(1:3)。期间整个过程在室温下进行1 h。之后,囊肿是嵌入在环氧树脂60°C一段24 h。罚款70海里的寄生虫是获得一个超微切片机,然后安装在200目铜网格。分段优化的对比和嵌入铜网格的寄生虫,他们接受4%雷诺兹醋酸双氧铀及柠檬酸铅(电子显微镜科学,墨西哥城,墨西哥)。观测进行JEOL JEM 1010 (JEOL有限公司、东京、日本)透射电子显微镜在60千伏。数字图像是使用先进的显微镜技术集团图像捕获引擎7.0(美国马沃本),然后处理ImageJ 1.46 r (NIH,贝塞斯达,医学博士,美国)。gydF4y2Ba

2.6。蛋白质的提取gydF4y2Ba

Cysticerci均质细胞骨架缓冲区的存在,用近三次50 U的振幅,每次30年代和1分钟的间隔,使用冰浴(Vibra-cell 75185;超音速和材料公司,新城、CT、美国)。然后,合成悬挂脱盐,沉淀在-20°C包含丙酮溶液,10%三羧酸,20毫米二硫苏糖醇。暂停在28000×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟在4°C和细胞骨架的合成颗粒恢复和resuspended缓冲区在4°C之前报道(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。与直流蛋白质测定蛋白质浓度测定试剂(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。gydF4y2Ba

2.7。电泳分析gydF4y2Ba

蛋白质的寄生虫提取获得了十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)在减少的条件下(2.5% 2-mercaptoethanol) 10%聚丙烯酰胺凝胶。标准精度+蛋白质分子量标记(# 161 - 0373;Bio-Rad)被用于参考。蛋白质分离使用PowerPac 3000在80 V供电(Bio-Rad) 30分钟(叠加凝胶)和120 V 1.5 h(分离胶)。凝胶被沾Coomassie蓝色(PhastGel™蓝色;通用电气医疗集团,小都,英国白金汉郡),使退色的乙酸/甲醇。分析了蛋白质乐队使用数量一个4.6软件(Bio-Rad)。gydF4y2Ba

2.8。检测SEPT4_Tsm ImmunorecognitiongydF4y2Ba

凝胶电泳分离的蛋白质,后被electrotransferred聚偏二氟乙烯膜(微孔)使用Trans-Blot SD半干转移细胞(Bio-Rad) 15 V 35分钟。在转移之前,膜加工的制造商。将蛋白质后,膜被封锁在室温下1 h的2%牛血清白蛋白在PBS Tween20混有0.15%。多克隆抗体SEPT4_Tsm(1:5,000)对总蛋白提取的反应gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2BaORF应变和gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2Bacysticerci。商业二级山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)抗体结合辣根过氧化物酶(合)(下,81 - 6520;酶、南旧金山,美国CA)和山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L)抗体结合合(1:1,000,81 - 6520;酶)是用于检测绑定。抗原抗体相互作用是通过添加化学发光显示发展装备解决方案(SuperSignal西Pico化学发光底物,热费希尔科学)。膜使用ChemiDoc XRS成像系统(Bio-Rad)。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。生物信息学分析gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2BaSeptinsgydF4y2Ba

寻找septin基因的基因组gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2Ba产生了三个完整的序列(TsM_000487200、TsM_000458600 TsM_000256200)。这些septins似乎包含守恒septin图案,包括GTPase图案(G1、G3、G4)和苏地区。以下这些序列的生物信息学分析,推导出蛋白质分为SEPT2, SEPT6和SEPT7组根据序列相似性与其他septins从这些团体(补充图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。寻找septins还发现了两个短序列(TsM_000748600和TsM_000242900),结合时,产生一个完整的septin序列包括SEPT7组(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。完成所有序列gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2Baseptins补充图所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

3.2。自由现金流量的影响gydF4y2Ba绦虫crassicepsgydF4y2BaORF应变CysticercigydF4y2Ba

图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba显示了自由现金流量的影响治疗在形态(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba),生存能力(图gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba),和运动性(图gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Bacysticerci)gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2Ba。组成的对照组治疗寄生虫所示为每个条件。形态学观察结果揭示了未经处理的寄生虫保存他们的粗糙表面(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba第一列)。1 h后的5gydF4y2BaμgydF4y2Ba自由现金流量,寄生虫的形态和能动性是类似于对照组(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba,第二列;补充的电影gydF4y2Ba2gydF4y2Ba;图gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。相比之下,在50岁gydF4y2BaμgydF4y2Ba米自由现金流量,根据治疗的持续时间,寄生虫更加细长和他们的表面是光滑的(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba第三列)。重要的是,在这个剂量,蠕动减少文化和15分钟后完全没有其他时间(补充图gydF4y2BaS4gydF4y2Ba;图gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。此外,在这一集中,自由现金流量对活性的影响是可逆的1 h和5 h(治疗后(补充gydF4y2BaS4gydF4y2Ba);然而,24小时后,无法恢复运动性(补充gydF4y2BaS5gydF4y2Ba)。在500gydF4y2BaμgydF4y2Ba自由现金流量,cysticerci完全改变的形态;cysticerci成了椭圆形,表面光滑,和多个小内陷出现两极(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba第四列)。值得注意的是,更少的内陷在其他情况下被发现。此外,能动性完全缺席(补充图gydF4y2BaS3gydF4y2Ba;图gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。500年经过24小时的治疗gydF4y2BaμgydF4y2Ba自由现金流量,寄生虫看起来类似于气球(补充图gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

代谢的生物转化Alamar蓝色®如图gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba。所有组似乎拥有类似的代谢活动,随着时间的推移而减少;然而,cysticerci处理500gydF4y2BaμgydF4y2Ba米自由现金流量持续较低的值显示在所有测试的时候,经统计分析(克鲁斯卡尔-沃利斯和Dunnet测试)。gydF4y2Ba

可行性评估了SYTOX绿色在生活(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)和固定(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)cysticerci接受50和500gydF4y2BaμgydF4y2Ba自由现金流量。住cysticerci值(测量RFU)表现出显著低于加热cysticerci用作死控制细胞(p = 0.01)。固定后的寄生虫,这些处理自由现金流量也显示低强度的荧光相比,那些被热(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba);寄生虫对DMSO作为控制显示类似的低强度的荧光。在亮场显微镜下观察cysticerci(补充图gydF4y2BaS6gydF4y2Ba)表明,寄生虫没有经验尺寸或形状的变化。gydF4y2Ba

超微结构的影响自由现金流量的分析在Cysticerci组织。gydF4y2Ba表面和内部组织的超微结构观察cysticerci在不同使用透射电子显微镜的放大,如图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。最大的变化,寄生虫的形态观察浓度最高的自由现金流量(500gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)。gydF4y2Ba

超微结构分析的内外皮图所示gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。在控制囊肿(上一行),古典形态的外皮和生发层。治疗50gydF4y2BaμgydF4y2Ba(中间行)和500gydF4y2BaμgydF4y2Ba自由现金流量(低行)产生了皮的厚度变化,增加了囊泡形成和线粒体的数量,改变生发层细胞形态学和细胞间连接。此外,肌糖原细胞的形态学变化,而不是微绒毛的形态,观察。治疗500gydF4y2BaμgydF4y2BaM的自由现金流量造成破坏的外皮,非常大的内陷从基底膜向表面突出。这些内陷横扫整个皮或观察沿着它的长度。进一步下面(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba500年),治疗gydF4y2BaμgydF4y2BaM自由现金流量使protonephridial导管显得更加细长比控制的动物。尽管外表,导管更electrodense比控制。最后,对治疗(50gydF4y2BaμgydF4y2Ba米,中间行和500年gydF4y2BaμgydF4y2Ba米,底部行图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba火焰)产生重要的形态学改变细胞和纤毛簇的组件(左列在图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。在控制囊肿(上层行图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),纤毛的纤毛簇了9 + 2构象(见右列的放大图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),自由现金流量使纤毛变得更加紧凑和无序。因此,与500年治疗gydF4y2BaμgydF4y2Ba米自由现金流量造成的损失9 + 2构象(低行右侧图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.3。Taeniid Septin ImmunorecognitiongydF4y2Ba

在解决减少条件下蛋白质在细胞骨架提取使用sds - page(图gydF4y2Ba6(一)gydF4y2Ba),他们被转移到膜和单一乐队taeniid被anti-SEPT4_Tsm(图gydF4y2Ba6 (b)gydF4y2Ba)抗体。anti-SEPT4_Tsm抗体检测到一个乐队的表观分子量(MW) 41 kDa的两个taeniid物种,表明它可能对应于SEPT4_Tsm。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

如前所述,septins参与寄生虫是重要的细胞生物学这些生物的适应和生存在他们的主机;因此,它的关键是理解他们的表情。在吸虫gydF4y2Ba美国曼gydF4y2Ba利用重组蛋白和共焦显微镜显示,四septins的存在gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。然而,没有此类信息用于绦虫。在目前的研究中,gydF4y2Ba在网上gydF4y2Ba的分析gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2Ba基因组显示似乎septins编码基因的存在。经典septin域从假定推导出septin序列和生物信息学分析表明他们同源septins从其它物种,包括人类(补充图gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)。推断蛋白质序列的比较gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2Baseptins与gydF4y2Ba美国曼gydF4y2Ba和人类建议taeniid septins属于三大septin组:2、6、7。gydF4y2Ba

自由现金流量行为通过抑制septin细丝的聚合;它提出了结合G领域,这是重要的网站三磷酸鸟苷水解的GDP和septin-septin互动(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。当绑定到自由现金流量,septin细丝失去功能,因此阻止正常细胞迁移和胞质分裂gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。此外,它已经表明,有一个内在关系肌动蛋白细胞骨架的重排septin 2 NRK细胞,这意味着任何改变诱导这些细胞骨架蛋白之一是充分的其他改变的稳定性和功能(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在这项研究中,我们关注的影响自由现金流量的cysticerci后生动物gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2Ba在形态和功能水平。我们假设这种化合物可能会扰乱septins由于自由现金流量与三磷酸鸟苷竞争之间的相互作用,导致形成灯丝septins不足(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。减少寄生虫的动力学和能动性在浓度增加自由现金流量(补充数据gydF4y2BaS2gydF4y2Ba和gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)可能是一个互动的效果。最终,经过长时间的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba治疗对浓度最高,寄生虫被报道死。这种影响自由现金流量的taeniid寄生虫是有趣的,直到现在,septins没有报道这些生物。gydF4y2Ba

共焦显微镜观察吸虫gydF4y2Ba美国曼gydF4y2Ba(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]显示表面septins和最邻近的肌肉层皮。,提出了septins与肌肉纤维表达肌动蛋白丝。此外,在相同的研究中,发现了septins protonephridial导管的渗透调节的地点。在后生动物gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),septins被认为是对纤毛的形成和维护很重要,也就是说它们所需的规定ciliogenesis和纤毛运输通过微管动力学和囊泡运输。septins之间的相互作用与其他细胞骨架蛋白在哺乳动物细胞(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。在目前的研究中,自由现金流量在形态(图的影响gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)和减少cysticerci的能动性gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2Ba(补充数据gydF4y2BaS2gydF4y2Ba和gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)表明,septins可能与肌动蛋白和肌凝蛋白位于这些组织。肌动蛋白和肌凝蛋白高表达绦虫的组织,因为他们需要这些生物体的能动性和肌肉收缩特点(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。因此,如果这些细胞骨架元素与septins交互,任何改变后者可能会影响微生物的活性,已经提出了gydF4y2Ba美国曼gydF4y2Ba(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。在目前的研究中,荧光的变化聚合肌动蛋白和微管蛋白观察治疗后cysticerci组织自由现金流量(补充图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。这些观察结果可能表明总值FCF-induced改变SEPT4_Tsm破坏肌动蛋白和微管蛋白的聚合gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2Bacysticerci,正如我们之前所示(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。未来研究septins和这些细胞骨架蛋白之间的相互作用应该证明这种关系的确切性质及其cysticerci生存的重要性。gydF4y2Ba

绦虫的外皮对这些寄生虫的生存至关重要,因为它允许运输、交换的分子,和消除浪费gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。因此,任何变更,影响其稳定性和动力学为这些后生动物的生物有可能是致命的,已经观察到在cysticerci和成人的绦虫gydF4y2Ba绦虫gydF4y2Ba物种与antihelminthic药物治疗(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。在这里,孵化与自由现金流量在50 - 500的浓度gydF4y2BaμgydF4y2BaM 1 h沿着皮产生明显变化,形式的形态改变或明确的中断,妥协的完整性合胞体皮(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。我们推测,此时,寄生虫可能已经受损,失去了保持监管的物质交换的能力。反过来,这将会导致观察到的完全丧失活性(补充数据gydF4y2BaS2gydF4y2Ba和gydF4y2BaS3gydF4y2Ba(图)和代谢功能gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)。如果gydF4y2Ba绦虫gydF4y2Baseptins是自由现金流量的目标,这些蛋白是参与维持体内平衡和活力的寄生虫,然后自由现金流量的影响可能来自改变septins和随之而来的后果寄生虫。gydF4y2Ba

除了tegumental地区自由现金流量的影响,其他cysticerci组织区域,如protonephridial系统,也影响自由现金流量。实际上,自由现金流量影响protonephridial导管和火焰细胞,两者都很重要,因为它们涉及到重要的渗透调节的功能。这些函数允许寄生虫维持内部水和盐平衡的循环流体protonephridial导管内,火焰被正常的纤毛运动细胞。根据电子显微镜的观察,protonephridial导管(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)成为融合和失去他们的能力来维持液体循环。这些变化是伴随着火焰细胞形态学改变(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),类似于这些报道后antihelminthic药物治疗(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。在一起,这些变化可能大幅改变流体的动力学运动,导致中毒和死亡的寄生虫。支持这一假设观察囊肿的总体形态(图的变更gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba),生存能力降低(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),以及运动性(补充数据的损失gydF4y2BaS2gydF4y2Ba和gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)。有趣的是,自由现金流量影响纤毛塔内纤毛的构成(图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),失去规范9 + 2纤毛分布。这一发现表明,这些细胞不再能够执行正常的纤毛运动和驱逐protonephridial管道的液体。因此,cysticerci可能无法维持其组织的渗透压,条件是影响寄生虫的可行性,与雄激素治疗后gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。为建立gydF4y2Ba美国曼gydF4y2Ba(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),septins protonephridial导管和火焰中高度表达的细胞;因此,任何结构形态的改变这些地区cysticerci后对治疗将表明行动的自由现金流量的网站。gydF4y2Ba

在目前的研究中,寻找taeniid septins产生了一个基因的序列对应septin 4;这群septin属于人类SEPT2 [gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。推导出的氨基酸残基的比较septin (SEPT4_Tsm)与人类septin 2(值得注意的是,没有发表的基因组gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2Ba)显示平均的57%。爆炸序列的分析人类septin 2对整个基因组gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2Ba表明蛋白质百分比最高的身份与SEPT4_Tsm(数据没有显示)。gydF4y2Ba

anti-SEPT4_Tsm抗体识别具体一个乐队的兆瓦(41 kDa) taeniids(图所示gydF4y2Ba6 (b)gydF4y2Ba)。鉴于MW推导出的基因组gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2Ba是65 kDa,这种差异的存在可以解释其他septin基因的基因组gydF4y2Bat .绦虫gydF4y2Ba,表达一个未知septin SEPT4_Tsm同种型的蛋白质或认可。同样重要的是,寻找最使用免疫原性肽抗体生产面向最高的特异性识别gydF4y2Ba绦虫gydF4y2Baseptins。因此未来实验应该考虑使用其他方法,如质谱确认这种蛋白质的身份。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

自由现金流量的影响,有助于建立中存在septins taeniid绦虫。对治疗改变了形态、生存能力和能动性gydF4y2Bat . crassicepsgydF4y2Bacysticerci,由于其行动septin-like蛋白质。分子身份的证实了septin-like蛋白多克隆抗体的使用专门针对taeniid septins。作为细胞骨架组织taeniids septins很重要,自由现金流量的作用表明,septins履行绦虫的重要功能。因此,自由现金流量或其衍生物可以作为潜在antihelminthic药物。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突有关的出版。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们要感谢Rocio Tirado博士对她的批评后阅读手稿和感谢Editage (www.editage.com)的英语编辑。这项工作是支持部分通过格兰特- 224316从Direccion一般Apoyo al de个人Academico和自治的医学院。戴安娜·g·Rios-Valencia是项目的博士生Doctorado en Ciencias escuela Quimicobiologicas Nacional de Ciencias BIologicas (ENCB) / IPN, CONACyT奖学金没有。280280年。我们要感谢博士生塞萨尔·迪亚兹Godinez博士和塞萨尔Carrero桑切斯的援助在可行性研究和利乐创造性本文编辑视频。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

补充图S1。gydF4y2Ba对齐的t .绦虫septinsgydF4y2Ba。SEPT4_TsM, B: SEPT7_Tsm, C: SEPT_Tsm,和D: SEPT10_Tsm符合gydF4y2Ba美国曼gydF4y2Baseptins和人类septins。守恒septin图案(G1, G3、G4和苏)由黑匣子封闭。相似性百分比底部的图所示。补充图S2。gydF4y2Ba运动性的cysticerci处理5、50和500gydF4y2BaμgydF4y2Ba米1 h(治疗后相比,自由现金流量控制gydF4y2Ba。运动性cysticerci在减少暴露于浓度最高的自由现金流量(50和500gydF4y2BaμgydF4y2Ba相比M)与控制寄生虫(DMSO溶液处理),这表现出正常的能动性。补充图S3。gydF4y2Ba运动性的cysticerci处理5、50和500gydF4y2BaμgydF4y2Ba米高自由现金流量相比,控制治疗24小时后。gydF4y2Ba在暴露于浓度最高的自由现金流量(50和500gydF4y2BaμgydF4y2Ba米),运动性相比减少与控制寄生虫(DMSO溶液处理),这表现出正常的能动性。补充图S4。gydF4y2Ba可逆的影响治疗50gydF4y2BaμgydF4y2Ba米高自由现金流量相比,控制5 h后治疗。gydF4y2BaCysticerci改变介质后慢慢恢复了运动性FCF-free媒介。补充图S5。gydF4y2Ba可逆效应治疗50gydF4y2BaμgydF4y2Ba米高自由现金流量相比,控制治疗24小时后。gydF4y2Ba经过24小时的暴露在自由现金流量,cysticerci改变介质后没有恢复他们的能动性FCF-free媒介。补充图S6。gydF4y2Ba的可行性cysticerci接受50和500gydF4y2BaμgydF4y2Ba自由现金流量。gydF4y2Ba亮场观测。分析了可行性SYTOX绿色。(A)量化的RFUs cysticerci对待DMSO(控制)或自由现金流量(50或500年gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)而死亡的控制细胞的。(B)的微观分析寄生虫SYTOX绿色孵化后自由现金流量风险。酒吧代表500gydF4y2BaµgydF4y2Ba图S7 m。补充。gydF4y2Ba间接影响自由现金流量的肌动蛋白和微管蛋白cysticerci crassiceps。gydF4y2Ba与500年Cysticerci治疗gydF4y2BaμgydF4y2Ba米自由现金流量,然后评估使用phalloidin肌动蛋白的表达(红色)和使用anti-DM1A微管蛋白的抗体(绿色)。我们观察到这些蛋白质的表达变化与在DMSO-treated对照组相比。箭头表示外皮(T)和VS(水泡液)。比例尺代表500gydF4y2BaµgydF4y2Bam。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)gydF4y2Ba

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