特征的进化保守鲁兹锥体NatC NatA-N-Terminal乙酰转移酶复合物

文摘

蛋白质氨基乙酰化是一种合作和转译后的修改,保存在真核生物中。它决定了许多蛋白质的功能命运包括稳定性、复杂的形成,和亚细胞定位。氨基乙酰转移酶(NATs)转移一个乙酰基的N-termini蛋白质,主要NATs酵母和人类NatA NatB, NatC。在这项研究中,我们为特征鲁兹锥体(t . cruzi)NatC NatA蛋白复合物,每个组成一个催化亚基,并预测辅助单元。表达的蛋白质被发现在三个主要的生命周期阶段的寄生虫,形成稳定的复合物在活的有机体内,部分cosedimented核糖体同意cotranslational函数。一个在体外乙酰化作用分析清楚地表明,乙酰化的基质NatC催化亚基t . cruzi是酵母和人类NatC的类似,表明进化保护功能。的RNAi击倒锥虫属brucei(t . brucei)NatC催化亚基表示,减少NatC-mediated氨基乙酰化的目标蛋白质减少寄生虫的生长。

1。介绍

锥虫是原生动物寄生虫,可以导致严重的健康问题,主要是在发展中国家。鲁兹锥体恰加斯病的病原体,在拉丁美洲,普遍吗t . brucei,主要出现在非洲,导致人类和昏睡病那加那病在牲畜1,2]。没有疫苗trypanosome-related疾病和可用的药物引起严重副作用(3,4]。这项研究对氨基乙酰化作用可能成为化疗目标对抗寄生虫感染是有限的。蛋白质Nα乙酰化作用(Nt-acetylation)是一种不可逆的蛋白质改性的乙酰基转移的N次方α蛋白质或多肽的氨基酸组氨基乙酰转移酶(NATs)。NATs分组根据他们的底物特异性。在人类中,七个NATs已确定到目前为止(NatA-F和NatH) (5,6]。其中NatA, NatB, NatC最多的基质,广泛的特点。人类NatA蛋白质复合体由催化亚基(hNaa10)和一个辅助单元(hNaa15)和人类NatC由催化亚基(hNaa30)和两个辅助(hNaa35和hNaa38)子单元(7,8]。形成稳定的复合物的蛋白质在活的有机体内和cosediment核糖体(8,9]。近来,研究探索NATs已成为局部的生物学意义,特别是关于他们如何有助于细胞完整性和他们的角色在癌症10,11]。在底物蛋白质水平,Nt-acetylation可能作为退化信号(12],调节蛋白质复合体的形成[13),或抑制翻译后ER-translocation [14]。事实上,人类NatC和NatA有控制癌症被认为是可能的目标8,15]。

在氨基乙酰转移酶(NATs),合作和转译后的修改是很常见的在生活的所有王国。约为60%,90%,75%,和18%的酵母,人类,植物,和古生菌蛋白质,分别被认为是Nt-acetylated [5,16,17]。

NatA复杂的t . brucei被发现对细胞生存能力是必要的在哺乳动物和昆虫阶段(18]。我们以前描述的一种新型乙酰转移酶,催化亚基的NatC复杂t . cruzi(19),被认为属于NatC子群。在目前的研究中,我们的特点并开始调查预测NatC和NatA的生物学意义t . cruzi。

我们表明,催化亚基(TcNaa10和TcNaa30),和预测辅助亚基表达cosediment核糖体。我们发现TcNaa30催化乙酰化作用的N-termini类似乙酰化酵母(yNaa30)和hNaa30 NatC在体外我们的分析表明,蛋白质可能功能既是Nα——作为一个Nε乙酰转移酶。最后,有一个迹象表明击倒的t . brucei寄生虫NatC催化亚基是很重要的。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

t . cruziCL布雷纳指出epimastigotes是培养如前所述19]。组织文化派生trypomastigotes通过感染的维洛细胞单层,收集媒体通过在1640 g离心10分钟。无鞭毛体获得了收获5 x 10⁶trypomastigotes每毫升和孵化为48 h血清DMEM 37°C。Metacyclogenesis被分离5 x 10诱导⁶epimastigotes每毫升到格蕾丝的昆虫媒介辅以肠匀浆Rhodnius prolixus(20.pyruvate-glutamate-antibiotic)和0.5% (PGAB)。t . brucei菌株生长在HM-I9介质在37°C, 5%的公司₂。

2.2。标识、克隆和表达疑似TcNatC和TcNatA子单元

人类Mak3 (hNaa30),基因身份证122830,hNaa38 (NP_001317040.1 GI: 1052793474)序列对t . cruziCL布雷纳指出蛋白质组以识别t . cruzi同系物的NatC催化和一个辅助单元。类似的,第二个TcNatC辅助使用植物Mak10乙酰转移酶亚基被确认拟南芥NP_001118295.1, GI: 186500070鼠形NP_579858.1 GI: 19033372。辅助单元从巴西政治监督网站巴西政治咨询团体评价总基因组DNA从应变放大(TcI)使用以下引物TcNATC mak10转发:5′CGAATTCATGGCGTGTGACCTTGA 3′, TcNATC mak10逆转:5′GCGGCCGCTTACCTGGCTTCCTTCTTG 3′, EcoR1和Not1限制性位点(下划线),分别,TcLsmd1前进:5 G′GAATTCATGGGCCGCGAGAGCATGCTTCACAA 3′和TcLsmd1逆转:5′亚美大陆煤层气有限公司CTCGAGTTAGCGCTTCCGCTT 3′, EcoR1和XhoI限制性位点(下划线)。基因克隆到pGEX5-1向量表达GST(谷胱甘肽S-transferase)和重组蛋白的生产。颗粒状的细菌是溶解在PBS包含EDTA-free蛋白酶抑制剂平板电脑(罗氏),1毫米EDTA, 100μ在冰上g溶菌酶和孵化大约15分钟。Sarkosyl添加浓度的1.5%。细胞被暂时用近4倍,10年代,30年代暂停使用布兰森声波降解器B细胞粉碎机15。分析了颗粒和上层清液检测诱导蛋白的存在。

TcNatA子单元,人类或酵母NatA序列被用作在NCBI BLAST数据库查询以确定TcNatA同系物。t . cruzi基因TcCLB.506227.230(预测催化亚基,我们叫TcNaa10)和基因TcCLB.510301.80(预测辅助单元,名为TcNaa15)被确定。基因组DNA的基因放大使用以下引物:TcNAA10转发:5′AAGAATTCATGCAGATCCGTCGC 3′, TcNAA10相反:5′AAACTCGAGTCACTTTTTCGTCTTGCC 3′, TcNAA15转发:5′ATCGGAATTCCGGTAGTGCTTCCTCCGGCG 3′, TcNAA15逆转:5′ATCGCTCGAGGCGCTGGCCAACACCTCATCA 3′。大胆的和强调EcoRI(向前)和XhoI(反向)限制性位点。

随后基因克隆到pGEX5-1向量表达GST(谷胱甘肽S-transferase)收益率pGEX5-1-TcNaa10 pGEX5-1-TcNaa15。阅读框架被证实如前所述[19]。细菌全球细胞(表达载体)转换pGEX5-1-TcNaa10种植在37°C,直到大约OD_600年0.5和0.3毫米异丙基诱导β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)。细胞生长和加工所述前(19),除了蛋白酶抑制剂使用(从罗氏EDTA-free平板抑制剂)。细菌全球细胞(表达载体)转换与pGEX5-1-TcNaa15增长到大约OD_600年0.8和0.1毫米IPTG诱导24°C约24 h和进一步处理作为pGEX5-1-TcNaa10完成。

2.3。代Anti-TcNaa10 TcNaa15, Anti-TcNaa38抗体和免疫印迹分析

TcNaa10抗体生产和执行TcNaa38在一只兔子Innovagen(瑞典Lund),像以前一样(19]。G蛋白质被用来净化免疫球蛋白。anti-GST抗体通过GST-column被通过免疫球蛋白。损耗和效价评价免疫印迹销售税和GST-TcNaa38 GST-TcNaa10 electrotransferred带(没有显示)。产生的抗体对TcNaa15 Agrisera公司(Umea-Sweden)接种与合成肽1只兔子:Naa15-EL (700 - 712) (NH2) CDEVLASAWEKIKE(首席运营官)。肽序列来自保守地区的选择从CL布雷纳指出单(non-Esmeraldo Esmeraldo像)。西方墨点法进行了使用标准程序,像以前一样19]。anti-TcNaa15, anti-TcNaa10和anti-TcNaa38抗体的稀释1:4000,1:20 00,分别和1:20 00。比较生命周期阶段,包含10的分数⁶直接细胞细胞溶解样品加载缓冲区和15%的丙烯酰胺凝胶分离。使用半干的系统和膜蛋白被探索,例如,anti-TcNaa38过夜。

2.4。体外乙酰化作用分析

大肠杆菌细胞窝藏表达质粒pGEX5-TcNaa30种植在Luria-Bertani 37°C中含有适量的氨苄青霉素。在大约0.5 OD600诱导表达的0.3毫米IPTG和额外增长持续了18 h 17°C, 190 rpm。这些细胞被加工如前所述[19]。

纯化的酶活性GST-TcNaa30决心中描述(8]。总之,GST-TcNaa30混合与潜在的寡肽底物(300毫米)和乙酰辅酶a(300毫米)的总量60μl乙酰化缓冲区。样本孵化在37°C 30分钟。通过添加5酶活性就熄了μl 10%的组织。乙酰化寡肽的量确定基于吸光度与rp - 215海里后分析。合成肽序列使用所述其他地方(7,8]。

评估TcNaa10乙酰转移酶的活动,重组蛋白表达如上所述,除了增长持续了25在17°C, h 189 rpm。细胞被冷冻的冰和离心收获的5000 rpm 15分钟。细胞颗粒悬浮在5毫升的冰冷的PBS包含EDTA-free平板电脑抑制剂(罗氏)。细胞用近4倍,10 s每个使用布兰森声波降解器B细胞粉碎机15。5毫升的冷PBS +抑制剂,0.5毫升的20% Triton x - 100(最终浓缩的。增加了1%)和细胞培养30分钟之后在4°C和离心机在10000 rpm 15分钟。从50%的浆glutathione-Sepharose 4 b(通用电气医疗集团),约250人μl是添加到上层清液和混合培养2 - 3 h在4°C。珠子被洗了三次冷PBS含有1% Triton x - 100,紧随其后的是一个用PBS。蛋白质在珠子的数量估计从Coomassie sds - page凝胶的染色。

纯化的重组蛋白(GST-TcNaa10),筛选了珠子,孵化乙酰辅酶a和合成肽建议NatA的基质。酶的活性是30分钟后停止,由高效液相色谱分析的结果。

2.5。免疫荧光显微镜

寄生虫准备如果基本上如前所述21),在4%多聚甲醛固定细胞5分钟。然后封锁在10%山羊血清和初级抗体在1:50稀释1 h。Anti-rabbit AlexaFluor488被用来识别主要的抗体和细胞DAPI染色之前在Fluoromount安装。成像是通过使用蔡司Axioplan2显微镜和Axiovision 4.7软件。

2.6。免疫沉淀反应(IP)

大约10⁹寄生虫每毫升用于免疫沉淀反应。指数增长的细胞细胞溶解在裂解缓冲(0.75%的皮套裤洗涤剂,1毫米MgCl2, EGTA 1毫米,5毫米β-巯基乙醇,10毫米Tris-HCL (pH值7.6),10%的甘油,1毫米Pefabloc(罗氏)]。样品在冰和孵化后离心机。浮在表面的事先批准由孵化与蛋白质/ G-agarose(圣克鲁斯生物技术)在辊1 h在4°C。珠子被当作在1000 g离心3分钟。细胞溶解产物与2孵化μg anti-TcNaa10或anti-TcNaa30抗体。作为一个控制,与兔血清溶菌产物的一部分是孵化(preimmune)。两个样本孵化为2.5 h辊在4°C添加30μl的蛋白质/ G-agarose珠子和进一步孵化一夜之间在同一温度。上面的珠子,离心收集,清洗,与样品混合缓冲区,和煮10分钟。离心后,上清液由SDS /页面和免疫印迹分析。互惠IP anti-TcNaa15或anti-TcNaa38除了所述,在本例中,溶解产物没有事先批准。

2.7。多核糖体隔离

执行总核糖体隔离使用先前描述的修改方法(8]。大约10⁹细胞每实验使用。与100年收获之前,寄生虫治疗μg / ml放线菌酮(CHX)大约10分钟在冰上。细胞被细胞溶解与氯化钾核糖体裂解缓冲(8]和孵化冰上15分钟。细胞被重复吸量和均质匀浆与光学显微镜证实。溶菌产物离心机在18000 g在4°C 5分钟使用贝克曼转子25.50。一毫升的溶解产物覆盖在3毫升的25%蔗糖垫蔗糖和离心器135715。5 g 2 h使用Sorvall ah - 650转子(贝克曼)。颗粒的溶解在核糖体裂解缓冲。寄生虫总溶解产物,上层清液(post-polysome溶解产物),和核糖体颗粒通过sds - page和免疫印迹分析。

2.8。核和细胞质准备

大约10⁷指数增长的寄生虫在PBS和细胞溶解洗两次10 ul马上告诉缓冲区(50 M Tris-HCL pH值8,62.5毫米EDTA, 2.5氯化锂,0.4% Triton x - 100,和100毫克/毫升溶菌酶)。此后,NE-PER核和胞质提取试剂工具包使用热科学根据的建议,但双试剂。使用设备前,寄生虫被马上告诉细胞溶解,这个工具包提供的洗涤剂不溶解的寄生虫条件测试。Anticyclophilin(请提供Jacqueline Bua Instituto Nacionale de Parasitologia布宜诺斯艾利斯,阿根廷)和antihistone 3从北部(微孔)用作细胞质和核蛋白质,积极控制。

2.9。生物信息学

同源性搜索使用NCBI BLAST服务器进行。提取的蛋白质序列对齐使用Clustalω多重序列比对工具。ScanProsite InterPro蛋白质序列分析和分类工具被用来识别领域。

2.10。代的预测t brucei NatC催化亚基(TbNaa30) RNAi细胞系

假定的蛋白质编码区核苷酸组成(216 - 788)的预测TbNaa30 (Tb927.7.2360),也就是说,573个基点片段,扩增使用菌进行了底漆TbNatC - Naa30RNAi: 5′ATCGGGATCCCTACGGATGTCGCTCCTAGC 3′和反向引物TbNatC - Naa30RNAi: 5′ATCGAAGCTTGTAGCGCGGCAGAAATTTAG 3′。强调BamHI后三世限制性位点,分别。PCR产物subcloned进tetracycline-inducible RNAi向量p2t7使用限制性位点产生p2T7-TbNaa30 - 177。插入的存在被消化的质粒验证各自的酶。方便纳入染色体,质粒(约10μg)线性化NotI和转染t . brucei brucei427株电穿孔,使用约2 x 10⁷细胞。Nonlinearized质粒和模拟转染作为消极的控制。转化株的选择与腐草霉素(2.5μg),确认如果转染成功从幸存的寄生虫和提取的DNA进行PCR放大腐草霉素基因片段(350个基点)使用特定引物(Phleo向前5′ATG GCC亚美大陆煤层气有限公司TTG ACC AGT GCC 3′和Phleo逆转5′TGC ACG CAG TTG 20 GCC GGG 3′)。开始寄生虫密度2.5 x 10⁴使用/毫升,RNAi使用100 ng四环素诱导。相同的寄生虫密度用于转化株和野生型(t . b . brucei427)。noninduced /野生型和诱导细胞检查和清点每日使用光学显微镜。样本基因/蛋白表达分析每天收获了五天。

3所示。结果

3.1。识别和TcNat蛋白质的序列分析

TcNatC复杂的催化亚基是被爆炸分析,如前所述19)(表1)。按照推荐的术语(22),我们现在把这个基因称为TcNaa30。同样,我们发现公认的基因t . cruzi同系物的NatC辅助单元(TcNaa35和TcNaa38)(表1)。基因显示,19%,22%,49%,和62%的序列的身份在aa级的老鼠,植物,利什曼虫专业,和t . brucei分别对应。TcNaa38,基因Tc00.1047053507209.10 (Tc9.10)被确认为可能TcNatC亚基(表1)。在aa级,TcNaa38基因股份32%,38%,57%,和62%的序列的身份与其酵母,人类,利什曼虫专业,和t . brucei分别对应。

t . cruzi NatA同源染色体的识别是通过比较与人类Naa10(基因ID 728880)(表1)。的t . cruzi基因TcCLB.506227.230 (Tc7.230)被发现身份分享60%和42%的氨基酸(aa)水平与人类和酵母基因,分别。我们现在把这个基因称为TcNaa10根据最新的命名(22]。在搜索来确定的t . cruziNatA辅助单元,我们使用hNaa15 (NP_476516.1),作为一个爆炸查询序列。见表1,搜索确定CL布雷纳指出基因TcCLB.504163.110 (Tc3.110)和TcCLB.510301.80 (Tc01.80),与序列的身份在aa级,29%和28%。两个等位基因都标注为假定的N-acetyltransferase亚基Nat1和TcNaa15命名。序列比较预测TcNaa35、TcNaa38 TcNaa10, TcNaa15选定的物种(补充图中显示S1)。

3.2。表达和重组TcNatA和TcNatC蛋白质亚基的生产

我们之前表达了假定的TcNaa30和显示autoacetylation酶活性(19]。进一步描述TcNatC TcNatA蛋白质复杂,我们克隆TcNaa35 TcNaa38 orf和生产重组蛋白(补充数据S2A和开通显示重组蛋白(GST-TcNaa35和GST-TcNaa38)预期的大小约110和40 kDa,分别)。TcNaa10的带注释的蛋白质和TcNaa15预测分子量29.4和82.9 kDa的分别,我们再次生产重组蛋白。TcNaa10最初不溶性(补充数据S2C和S2D),并溶解在sarkosyl如前所述[23]。

3.3。表达TcNaa38 / TcNaa30和TcNaa10 / TcNaa15寄生虫

调查TcNatC的表达模式和TcNatA,我们用免疫印迹检测蛋白质在生命周期不同阶段的寄生虫。在这项研究中,在兔多克隆抗体都产生了对整个蛋白质。产生的抗体对TcNaa15兔子使用合成肽。的所有蛋白质进行评估,我们首先进行免疫印迹分析preimmune兔血清,,正如所料,没有乐队/信号检测(没有显示)。

分析表明,TcNaa38表达的三个主要阶段,即,在epimastigote trypomastigote,无鞭毛体阶段t . cruziCL布雷纳指出(图1(一))。然而,多个相似大小的乐队是公认的在所有的阶段,可能由于蛋白质转译后的处理。额外的乐队的身份尚未在本研究调查。Anti-TcNaa38和anti-TcNaa30也承认,例如,GVR35 [24]和UTRO [25菌株的t . brucei蛋白质(图1 (b))。TcNaa10 / TcNaa15也发现被表达在epimastigote trypomastigote,无鞭毛体阶段t . cruziCL布雷纳指出应变(图1 (c))。Anti-TcNaa15发现额外的乐队在所有发展阶段,除了无鞭毛体。这些乐队的身份都不知道。此外,结果表明一个upregulation TcNaa15 trypomastigote和TcNaa10一个相反的效果,无鞭毛体阶段,也就是说,在trypomastigotes表达下调,无鞭毛体(图1 (c))。(图中显示1 (d)),发现anti-TcNaa10交叉反应t . brucei虽然anti-TcNaa15,正如所料,没有。相比t·克鲁兹我,anti-TcNaa10公认的一个额外的17 kDa的乐队t . brucei,没有已知的身份。总的来说,结果表明,TcNatA和TcNatC持续表达的蛋白复合物t . cruzi。

3.4。本地化TcNaa30和TcNaa10 / TcNaa15分馏

所示(19),染色的假定的TcNaa30主要位于细胞质中,我们现在分离(图观察到相同的结果2(一个))。TcNaa15和TcNaa10蛋白质显示核和细胞质位置(图2 (b))。

3.5。亚细胞定位TcNaa30 / TcNaa38和TcNaa10 / TcNaa15免疫荧光

在评估的染色模式四种蛋白质,没有染色观察preimmune血清或二次抗体(数据未显示)。midlog和固定epimastigotes, TcNaa30展出一些细胞核周围的积累和点状的结构,尤其是在固定相(图3(一个))。metacyclic和组织文化派生trypomastigotes TcNaa30似乎相对隐藏在细胞核周围的分布,观察在[26]。当trypomastigotes分化成无鞭毛体在体外然而,更多的外围染色观察(图3(一个))。这些差异可能与微分调节的蛋白质贩运。

TcNaa38染色是点状的为主,胞质标签midlog阶段(补充图更加分散S3A)。组织培养派生trypomastigotes显示细胞质扩散本地化细胞核周围的积累。在无鞭毛体在体外,TcNaa38染色再次点状的细胞质(补充图S3A)。使用维洛细胞单层评估细胞内无鞭毛体,染色概要显示弥漫性TcNaa30定位在细胞质中,和一个更不时标签TcNaa38(补充图S4)。

TcNaa10和TcNaa15的定位模式在活的有机体内四个发展阶段的寄生虫进行评估。TcNaa10原子核周围主要是看到midlog和固定epimastigotes(图3 (b))。在trypomastigotes TcNaa10只出现在细胞核(图3 (b))。TcNaa10染色概要文件的无鞭毛体,与此同时,仅限于细胞的边缘(图3 (b))。在所有的生命周期阶段,TcNaa15似乎主要是本地化细胞外围(补充图S3B)。胞质标签消失在metacyclic阶段TcNaa15本地化动基体(补充图S3B)。组织培养trypomastigotes展出一个更为分散的细胞质定位和表达减少到一个结构类似于剩下的无鞭毛体短鞭毛(补充图S3B)。

3.6。TcNaa30 / TcNaa38和TcNaa10 / TcNaa15 Co-Sediment核糖体

我们检查了TcNaC共沉积作用与核糖体通过蔗糖垫,如(图所示4(一)),TcNaa30存在核糖体和nonribosomal分数。一个小数量的TcNaa38也可以观察到多核糖体分数。结果TcNatA(图4 (b)显示TcNaa10和TcNaa15核糖体和nonribosomal分数。Anti-TcNaa15发现一个额外的乐队约54 kDa核糖体的分数。相比之下,anti-TcNaa10发现一群nonpolysome分数差不多大。额外的乐队的身份尚不清楚。综上所述,核糖体共沉积作用结果表明,TcNatA和TcNatC蛋白质可能与核糖体。

3.7。t . cruzi NatC和TcNatA子单元体内和体外进行交互

人类直接同源TcNaa30、TcNaa35 TcNaa38形成一个稳定的复杂在活的有机体内(8]。调查是否TcNaa30 TcNaa38形成一个稳定的复杂t . cruzi免疫沉淀反应使用anti-TcNaa30 anti-TcNaa38执行。免疫沉淀反应与anti-TcNaa30成功,但使用anti-TcNaa38我们能够免疫沉淀反应TcNaa30(图5(一个))。虽然需要进一步的研究,这表明这些蛋白质物理交互t . cruzi直接或通过另一个蛋白质,例如,核糖体复杂。同样,免疫沉淀反应表明anti-TcNaa10能够免疫沉淀反应TcNaa15(图5 (b))上面板。通过互惠的免疫沉淀反应,anti-TcNaa15拆掉TcNaa10(图5 (b)),较低的面板。这种分析表明,TcNaa10和TcNaa15交互在活的有机体内在酵母和人类一样直接同源TcNaa10和TcNaa15形成一个稳定的复杂在体外和在活的有机体内(7,9,27]。

3.8。体外Nα乙酰转移酶测定

为了调查TcNatC的底物特异性和TcNatA,我们执行一个在体外Nt-acetylation化验,纯化重组蛋白(GST-TcNaa30)孵化与合成肽代表不同类型的基质NATs (NatA-NatE)。如(图所示6),TcNaa30优先乙醯化肽的疏水性氨基端MLGP序列,对应于一个典型NatC / E / F衬底。我们也试图评估TcNaa10酶活性和TcNaa10衬底的偏好是否相同的人类细胞以类似的方式。虽然有一个Naa10活动的迹象,优先乙酰化的合成肽序列STPD和EEEIA(未显示),代表人类NatA基质,没有发现可再生的活动。

3.9。击倒效果预测t brucei NatC RNAi催化亚基

RNAi的进行t . brucei相当于TcNaa30基因。RNAi被诱导锥虫属brucei brucei427年使用四环素。野生型,四环素没有影响他们的生存能力(补充图S5A)。

我们观察到的减少寄生虫生长诱导和noninduced后48 h和72 h(补充数据S5B和S5C)。这最有可能表明,RNAi向量是漏水的,或更可能向量本身造成影响的可能性。rt - pcr分析(补充图S5D)表示,在诱导后48小时,有一个诱导的内源性mRNA水平下降和noninduced转化株细胞比野生型。使用反西方墨点法t . cruziNatC (TcNaa30)表明,特别是在48 h, noninduced有较低的蛋白表达和诱导细胞比野生型(图7)。

4所示。讨论

我们在这里描述的分子克隆和表征预测t . cruziNatC和t . cruziNatA Nα乙酰转移酶蛋白复合物。我们发现蛋白质Nt-acetylationt . cruziNatC NatA是类似于在其他真核生物被描述。看来TcNatA的表达谱和TcNatC寄生虫不同生命周期并不统一。但是,如何转化为不同的寄生虫形态和生物学还不清楚。类似于表达,本地化的TcNatC免疫荧光和TcNatA蛋白质的不同生命周期形式分化。这些推测的功能意义。类似的染色模式观察(16,28,29日]人类Naa40 / NatD和其他NATs蛋白质。考虑到发散TcNatC和TcNatA蛋白质的表达和定位,人们很容易推测,给定的蛋白质位于一个特定的间隔在给定的时间携带生物任务。考虑的本地化t . brucei(Tb927.7.2360),类似的基因TcNaa30 GFP-tagged版本(30.),t . brucei基因的氨基端和c端标记版本的形式分布于整个细胞。本地化的TcNaa30手主要是分布在细胞质中,表明微分锥虫的生物功能。还需要进一步的分析来证实这个假说。

TcNatC身体和TcNatA蛋白相互作用,它是合理的,这种交互发生在细胞质中所显示可能的核糖体共沉积作用。可能,在某些情况下执行其功能的蛋白质彼此独立的建议在其他生物(16),他们可能有特定的功能根据寄生虫的生命周期阶段。TcNatC / TcNatA蛋白也可能有其他功能独立的NAT-activity建议在其他物种15]。

蛋白质的生物学意义的转译后的修改,特别是乙酰化作用,在锥虫是相对未知的31日]。我们预测TcNatC基质配置文件,发现许多parasite-specific蛋白质缺乏人类的同系物(表2)。对于TcNatA基质,预测包括假设的蛋白质,以及mucin-associated表面蛋白(圣保罗)博物馆和粘蛋白的蛋白质(没有显示)。中表达的圣保罗基因家族是优先博物馆trypomastigote [32]。此外,它是暴露于宿主的免疫系统和可能使用的寄生虫感染(32]。另一个明显的预测t . cruziNatC TcNatA衬底是transsialidase (TS)、寄生虫感染期间使用的多态表面酶(33]。综上所述,它可以推测Nt-acetylation,如果丢失,可以同时影响许多表面抗原包括TS,或者很多parasite-specific功能对病理学和细胞过程重要。

细胞外的寄生虫t . brucei所使用的,有些蛋白质寄生虫逃避宿主的免疫系统尽可能预测基质TbNatC(没有显示)。这些包括受体腺苷酸环化酶(34)、变异表面糖蛋白和网站相关的基因表达式(35]。通过蛋白质组学方法研究氨基acetylome锥虫(31日)证实了我们的预测,Nt-acetylation州这些生物是常见的。进一步的研究需要一个完整的理解哪些细胞机械调节这种方式以及这对寄生虫的生活是很重要的。

在酵母、人类和植物,NatC击倒(已被调查的生物学意义8,36,37]。这些研究指向损失的细胞生存能力如果NatC枯竭。NatA蛋白复合物被发现细胞生存所必需的t . brucei(18]。考虑到类似的预测序列的身份和配体绑定和活跃的网站,很可能NatA trypanosomatids是至关重要的。在这项研究中,沉默的t . bruceiRNAi表明NatC预测催化亚基的蛋白质可能是重要的寄生虫,尽管有轻微减少预测蛋白质带污点的转染细胞与控制。另一个系统条件等trypanosomatids淘汰赛CRISPR / Cas9可以测试,以确定我们的观察研究中或执行公司RNAi [38)通过沉默寄生虫NATs催化亚单位和表型评估。显然虽然这些是基本的,感兴趣的重要功能基因功能和调节以及可能的药物测试目标。

总的来说,所有的NATs的识别t . cruzi分析基质的偏好,蛋白质组学的研究Nt-acetylation在各发展阶段的差距将会缩小的寄生虫生物学知识。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包含在这篇文章,补充信息文件(s)。

的利益冲突

我们声明,没有利益冲突。

作者的贡献

斯蒂芬•Ochaya比约恩·安德森,莉娜Aslund构思研究。Stephen Ochaya提出研究计划,协调研究,进行实验和生物信息学,起草了手稿。奥斯卡弗兰岑的生物信息学分析,起草了手稿。多琳Asiimwe Buhwa和Enock Matovu协调和参与了RNAi研究。哈佛Foyn, Svein Isungset火炉,和托马斯·阿内森在体外进行乙酰化分析。克莱尔·e·巴特勒和凯文·m·泰勒准备寄生虫提取并进行免疫荧光分析。所有作者参与的分析结果和改进草案。

确认

我们感谢Florian a所罗门用共焦显微镜帮助我们。我们还欠Daniela f . Gradia Instituto de Biologia分子做巴拉巴西,为我们提供反t . cruzi核糖体蛋白S7和杰奎琳Bua西班牙de Parasitologia布宜诺斯艾利斯,阿根廷提供我们反t . cruzi还有这研究是由欧盟资助“Chagas-Epinet”和瑞典研究理事会249843年挪威研究委员会资助,挪威癌症协会,挪威西部的挪威卫生当局(912176项目)。金融家有无法控制的研究设计,数据分析,和手稿准备。

补充材料

补充图1:对齐的TcNaa35 / TcNaa38和TcNaa10 / TcNaa15与其他真核生物的同源序列。答:比较预测TcNaa35与其他蛋白质。蜱虫行表示预测Mak10域地区。最保守的aa由明星( )。注意,只有部分显示对齐。多肽使用利什曼虫主要(XP_001682355.1),t . cruzi(XP_814406.1),t . brucei(XP_844906.1),植物(NP_001118295.1),人类(SP∣Q5VZE5),和酵母(NP_579858.1)。B:TcNaa38与选定的蛋白质序列比对。表示最保守的aa。序列对齐的包括酵母(NP_010946.3),人类(NP_001317040.1),利什曼虫主要(XP_003722006.1),t . cruzi(xp - 808107.1)t . brucei(XP_951644.1)。C:TcNaa10序列的比较与选择的真核生物。上划线表示共识序列RXXGXA NatA,乙酰辅酶a结合的地方。两个箭头表示活跃的网站和一个符号♯是建立可能的赖氨酸autoacetylation网站。使用序列对齐的酵母(NP_011877.1),人类(NP_003482.1),利什曼虫主要(XP_001681770.1),t . cruzi(XP_817467.1),t . brucei(XP_828529.1)。D:从其他物种TcNaa15序列与假定的同系物。多肽用于对齐利什曼虫主要(XP_001686706.1),t . cruzi(XP_807954.1),t . brucei(XP_822811.1),人类(NP_476516.1)和酵母(END60314.1)。表明残留,这是高度保守的。补充图2:重组蛋白生产和10% sds - page分析。答:GST-TcNaa35重组。B:GST-TcNaa38。C:GST-TcNaa10和D:GST-TcNaa15。样本在不同加载通道如下:巷1,kDa的分子质量。2,noninduced (NI)。巷3,诱导(印第安纳州)。巷4,颗粒(P)。巷5,上层清液(少量)。semipurified巷6日(S /纯化)。补充图3:本地化TcNaa38 TcNaa15。数字1 - 5表示midlog epimastigotes,静止epimastigotes metacyclic trypomastigotes, trypomastigotes,分别和无鞭毛体。t . cruzi四个发展阶段immunolabelled一个,anti-TcNaa38和B,anti-TcNaa15。细胞核和动基体可视化用DAPI染色(N + K),规模酒吧= 5μm。补充图4:本地化的TcNaa30和TcNaa38内部无鞭毛体。寄生虫被允许侵入维洛细胞和分化。细胞与anti-TcNaa30 immunolabelled anti-TcNaa38(绿色)和柜台用DAPI标记(蓝色)可视化细胞核和动基体,酒吧= 10μM。补充图5:表现型击倒的假定的t . bruceiNaa30 RNAi显示增长曲线和mRNA水平;一个,野生型;B,转染;C,寄生虫的增长相比,转染子的野生型(蓝色)。细胞的密度2.5 x10⁴/毫升是生长在没有(-春节)或存在(+春节)四环素(100 ng / ml)的h。72的结果是一个代表的意思是寄生虫的增长t . b . brucei427年获得三个独立的实验。D,野生型基因表达分析(W), noninduced (- - - - - -)和诱导(+用逆转录酶PCR)细胞。2%琼脂糖凝胶上分离的产品与1 kb DNA梯和可视化使用溴化乙锭染色。是天0-48 h和72 h post-RNAi感应。肌动蛋白(700个基点)放大作为内部控制与NatC催化亚基(573个基点)。天使用的细胞密度0,24、48和72 h的RNA是孤立的1 x10⁵/毫升,2.73 x10⁵/毫升,3.75 x10⁵/毫升,4.7 x10⁵/毫升,分别。(补充材料)

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版权

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