文摘

与发病率和死亡率相关的经济成本因疟疾和疟疾相关的并发症在许多撒哈拉以南的非洲国家和其他世界疟疾流行地区是巨大的。的报道出现当前疟疾寄生虫抵抗疟疾治疗药物复杂,需要开发新的治疗药物。药用植物的民间传说的使用管理疟疾是有据可查的。这项工作评估antiplasmodial活动和毒性的药用植物用于治疗疟疾和像症状在加纳。植物提取物在70%乙醇通过冷浸渍。Antiplasmodial药效评估在体外对3株恶性疟原虫菌株(FCM W2,和CAM06)在活的有机体内通过为期4天的抑制试验鼠体内受感染的老鼠。细胞毒性和急性毒性评估在哺乳动物细胞和小鼠,分别。所有提取物的至少一个活动恶性疟原虫菌株在在体外评估与集成电路₅₀4 - 116的范围内μ克/毫升,而拜登pilosa提取,chemosuppression率达到75%,是最活跃的植物在活的有机体内实验。所有植物提取物显示很弱,没有针对使用的哺乳动物细胞系的细胞毒性,表现出很好的选择性疟原虫寄生虫。气味清香guineense和Parinari congensis提取是最有毒的急性毒性测试。总之,结果表明,药用植物做拥有令人印象深刻的antiplasmodial属性和提供科学依据传统草药的使用。

1。介绍

疟疾是主要的公共卫生挑战之一在世界各地的许多国家。超过2亿个疟疾病例报告每年有超过420000人死亡的疟疾每年记录。疟疾病是在超过90个国家流行,这意味着大约40%的世界人口受到影响或风险。大多数来自撒哈拉以南非洲疟疾发病率和死亡率。百分之九十的病例和死亡报道来自该地区。在刚果民主共和国和安哥拉,大约34000年和16000年死亡,分别是由2016年疟疾。报道,加纳因疟疾死亡人数的估计在1300左右。疟疾在撒哈拉以南非洲,大多数受害者是孕妇和5岁以下儿童(1]。

联合国(UN),其年发展目标(MDGs)的一部分,包括一个特定目的地址疟疾带来的挑战。在别人,这导致了前所未有的下降在过去十年疟疾发病率和死亡率。疟疾病例和死亡人数下降了超过50%,挽救了成千上万人的生命与抗疟药和矢量控制计划(2]。然而,近年来,已经有一个缓慢的下降减少疟疾感染的几率。从世界卫生组织(世卫组织)最近的报告显示,抗击疟疾的可用工具和资金现在在十字路口,这让许多儿童和孕妇感染的风险(1,3]。

对抗疾病面临的一个关键挑战是耐药的现象。有效的疟疾控制和根除很大程度上取决于治疗有效的抗疟药。抗疟药奎宁等氯喹,青蒿素及其衍生物在过去的几年中一直治疗疟疾的黄金标准。然而,耐药性导致无效或减少这些药物的功效4,5]。尽管青蒿素及其衍生物的巨大成功,在联合疗法所描述的,最近的报道疟原虫电阻在东南亚眉毛一扬6,7]。迫切需要新的和改进的抗疟药治疗,最好是与小说的行动路线预防、控制或减少寄生电阻,需要在药物发现管道。这是必要的,如果出现青蒿素耐药性疟原虫寄生虫在全世界普及。

土著使用的植物健康恢复产品已经存在了几个世纪。验证,补救措施准备从植物有能力应对几种类型的疾病(8]。根据世界卫生组织,大约70%的世界人口依靠草药制剂治疗疾病(9,10]。在加纳,草药利用约60 - 70%的人口在农村11),越来越多的城市人口也使用它们(12]。使用传统的补救措施提供了一个更便宜、更容易,大多数合成和可持续的替代药物和药品。此外,他们被认为很少产生任何副作用和容忍,更少的意想不到的后果13]。据估计,超过1000的药用植物在加纳,40%用于治疗各种疾病,如疟疾、哮喘、黄疸、伤寒、糖尿病、高血压和贫血(14,15]。在加纳,6%的药用植物在国内市场上用于疟疾和热管理(15]。这些植物被制定为注册商业产品和向公众开放是疟疾治疗药物。一个关键挑战的使用药用植物在疟疾治疗缺乏科学证据的功效。此外,这些植物的毒理学资料缺失或缺乏。在这项研究中,11 ethnomedically使用的药用植物治疗疟疾和像症状在加纳antiplasmodial活动和毒性资料进行调查。原油ethanolic这些植物提取物进行了测试在体外对三种不同的种类的疟原虫寄生虫:恶性疟原虫chloroquine-sensitive(巴萨),恶性疟原虫仍然(W2)和字段隔离(编码为CAM06,从当地获得病人)。在活的有机体内antiplasmodial活动(为期4天抑制测试)的评价鼠体内感染BALB / C小鼠。细胞毒性ethanolic提取物也评估(对LLC-MK2猴肾上皮细胞)和急性毒性(老鼠)。

2。方法

2.1。收集的植物材料

十一个植物ethnomedically用于治疗疟疾和像症状在加纳被选为这个工作。加纳的植物样本收集各个部分之间8月和2017年12月,识别和身份验证的克利福德先生巨人植物植物学家的草药,药学和制药科学教师夸梅•恩克鲁玛科技大学(KNUST)。标本与凭证数据存入标本。收获植物材料在自来水洗了洗异物。植物材料在环境温度下脱水树荫下2周,根据植物的一部分,和粉碎成粉末。表1描述了各种植物的部分用于研究和当地的迹象。

2.2。提取

一百克的每个植物粉在70%乙醇浸渍至少5天。残留是通过过滤和集中与溶剂分离在真空内(科尔parm旋转蒸发器n - 1110,中国)。然后他们被转移到螺旋帽瓶和存储直到使用C。

2.3。植物化学的分析

植物提取物是检测各种植物化学物质的存在:单宁,类固醇,类黄酮、生物碱、香豆素类、苷类。测试完成后标准程序(18- - - - - -21]。

2.4。在体外Antiplasmodial活动

植物提取物是化验恶性疟原虫chloroquine-sensitive(巴萨),恶性疟原虫仍然(W2),和一个恶性疟原虫场隔离(编码CAM06,从当地获得病人)菌株使用乳酸脱氢酶(pLDH)先前所描述的方法22和修改23,24]。寄生虫是培养在体外据的方法25]。生长在感染寄生虫O⁺人类宿主细胞和红细胞中维护RPMI 1640包含2.5%比容、次黄嘌呤(0.5×100⁻²% w / v),玫瑰(59.4×100⁻²% w / v)、葡萄糖(0.25×100⁻²% w / v)和albuMAX II (50.0×100⁻²% w / v),并与NaHCO缓冲₃pH值为7.34。新鲜文化是保持至少96小时(2完整生命周期)之前被用于分析。所有的解决方案都是filter-sterilized 0.22μm syringe-adapted过滤器(美国纽约康宁®)。化验进行96年文化板块和集成电路₅₀价值观从剂量反应曲线。

2.5。在体外细胞毒性

细胞毒性评估在LLC-MK2猴肾上皮细胞。细胞在DMEM培养基补充粪便为10%牛血清(的边后卫,生活技术)和1%的青霉素和链霉素。Trypsinated细胞分布在96 - 100年在10000个细胞微量滴定板μL /好,培养48小时前让他们把添加提取物。48小时后,介质被完全从每个好,和100年μL新鲜培养基添加。此后,100年μL原油提取(400μg / mL)添加,然后连续稀释。细胞没有药物/提取(增长100%)作为控制。细胞有或没有提取被孵化C在5% ,5% ,和90% N₂孵化器72 h后确定其可行性。每个浓度测试一式三份。MTT比色细胞生存能力分析和描述的细胞毒性活动确定了其他地方24,26]。可行性和百分比死亡率百分比计算的OD值使用Microsoft Excel。平均死亡率百分比的结果绘制的对数浓度使用GraphPad棱镜。从图被用来获得回归方程计算细胞毒性浓度五十(CC₅₀),这是提取所需的浓度杀死百分之五十的细胞。选择性指数(SI)和CC的比例计算₅₀对集成电路₅₀价值。

2.6。在活的有机体内急性毒性

这是通过评估急性毒性的提取,使用雄性Balb / C小鼠,根据经济合作与发展组织(OECD)化学品急性口服毒性测试指南(27]。健康的年轻成年雄性小鼠年龄在8 - 10周(18 - 30 g体重)。简而言之,对于每个提取物,动物被随机分为5组动物。对照组保持没有任何治疗(只接收车辆)。各实验动物组保存在各自的笼子里5天的驯化实验开始之前。动物收到的11个测试组植物提取物的固定剂量5000毫克/公斤,而对照组的车辆管理(蒸馏水)。动物禁食4小时前剂量和给药后2小时提取或车辆,而水在整个实验过程中可用。除了这些异常,动物也收到了饲料随意在整个实验过程。定期观察小鼠4小时后提取/车辆管理,每天14天检测死亡率以及任何行为改变。饲料和水的消耗都是被监控的。体重也记录在天7和14 (28]。

2.7。在活的有机体内Antiplasmodial活动

的在活的有机体内antiplasmodial提取的重要活动在体外通过为期4天抑制antiplasmodial活动进行评估测试鼠体内感染的老鼠。提取被溶解准备5毫克干200年原油提取μL DMSO(σ,密苏里州,美国),然后用蒸馏水稀释到所需的浓度。

2.7.1。动物和寄生虫

BALB / C小鼠(男性和女性),年龄6 - 8周,体重新g是保持在一个温度C和12小时光明/ 12小时黑暗周期,提供食物和水随意动物屋的MRABL大学健康科学学院,大学的布埃亚,喀麦隆。按照国际公认的实验室所有实验动物使用。

2.7.2。寄生虫接种

捐赠之前白化小鼠感染鼠体内和寄生虫血症水平的20 - 30%。供体小鼠麻醉和开胸牺牲地区为了暴露心脏。血液通过心脏穿刺收集到肝素化包含0.5%柠檬酸三钠的真空采血管管。生理盐水(0.9%)被用来稀释血液寄生虫血症水平的基础上供体小鼠(28,29日]

2.7.3。抑制试验

为期4天的抑制测试是用来评估在活的有机体内schizonticidal活动三个植物(拜登pilosa,雀稗scrobiculatum,和Clappertonia ficifolia)对鼠体内感染BALB / C小鼠后报道方法(28,30.)做了一些调整。简单地说,感染小鼠随机分为四组,每组5重量。治疗开始后三个小时老鼠已经接种寄生在0天,持续了四天(天零包容)。对于每个提取物,动物收到每日口服剂量400毫克公斤⁻¹一天⁻¹100年μL汽车(2% DMSO在蒸馏水)。积极的控制组收到10毫克/公斤体重每天奎宁,而负控制集团动物管理100μ我的汽车。治疗后第四天,血液样本是来自每个老鼠的尾巴。薄膜制备和彩色染色确定寄生虫血症水平。每组平均寄生虫血症确定和计算每个样本的% chemosuppression [(一个- - - - - -B)/一个]x 100,是指在负对照组和寄生虫血症是指测试组寄生虫血症。

3所示。结果

在这项研究中,11个常用药用植物的antiplasmodial活动在加纳的疟疾治疗进行评估在体外和在活的有机体内化验。此外,植物提取物对哺乳动物细胞系的细胞毒性和小鼠急性毒性模型也被评估。11植物为本研究选择从非正式的讨论获得与当地传统治疗师,indigene和文献检索。11个工厂属于不同的家庭和用于治疗疾病,如发烧、疟疾、胃痛和感染。植物提取物在70%乙醇通过冷浸渍。的产量(表提取范围从5.0到15.0%1)。

植物化学的筛查的主要化学类显示单宁,类固醇,类黄酮、生物碱、香豆素类,和苷可能负责观察antiplasmodial活动,如表所示2。无处不在的植物化学的,丹宁酸,存在于所有的植物样本调查在这项研究中,而生物碱在所有植物除了缺席Faurea叶。类固醇,黄酮类、香豆素和苷中至少5植物样品。所有的植物研究包含所有六个植物化学物质检测。在雀稗scrobiculatum在场的,唯一的植物化学的单宁。

来确定在体外antiplasmodial活动,植物提取物对裂殖体筛选阶段的3种不同的菌株恶性疟原虫寄生虫:chloroquine-sensitive(巴萨)、(W2),仍然和CAM06隔离。表3显示的是集成电路₅₀对3的提取恶性疟原虫菌株。的指导方针Jonville et al。16高(IC)分类antiplasmodial活动₅₀< 5μg / mL),承诺(5 < IC₅₀< 15μ15 g / mL),中等(< IC₅₀< 50μg / mL),和不活跃(IC₅₀> 50μg / mL)采用的分类能力的各种提取物。在低浓度,抑制寄生虫表明选择性活动,而在高浓度可能由于非特异性毒性。当巴萨的应变测试对氯喹敏感问题,Clappertonia ficifolia(4.43±0.18μg / mL)是唯一提取高antiplasmodial展出活动。六其他提取显示承诺与另一个3显示中度活动活动。Acridocarpus alternifolius,集成电路₅₀175.89±0.37μg / mL,是不活跃的。反对仍然W2应变,拜登pilosa(4.60±0.91μg / mL)气味清香guineense(4.62±1.14μg / mL)是最活跃的提取。Clappertonia ficifolia表现出有前途的antiplasmodial活动对W2, IC₅₀7.94±1.36μ克/毫升。没有对CAM06提取物显示出高的活动。Clappertonia ficifolia Faurea叶,气味清香guineense,和巴豆penduliflorus,然而,有前途的活动。对所有压力测试,Clappertonia ficifolia是最有效的,集成电路吗₅₀小于10μ在所有情况下g / mL。Faurea叶和气味清香guineense有集成电路₅₀不到15μ克/毫升,也非常活跃。

后,在体外antiplasmodial测试,提取筛选对哺乳动物细胞系(LLC-MK2猴肾上皮细胞)对细胞毒性进行评估。提取液浓度的细胞毒性细胞的50% (CC₅₀)范围从77.9 > 1000μ克/毫升(表4)。大多数细胞毒素提取气味清香guineense与CC₅₀77.9±0.71μ克/毫升。提取的Acridocarpus alternifolius和曼佗罗对哺乳动物细胞的毒性最小,CC吗₅₀价值超过1000μ克/毫升。选择性指数(SI)雀稗scrobiculatum,拜登pilosa,和气味清香guineense提取对巴萨的应变恶性疟原虫都是< 10表示最小的选择性(表吗4)。曼佗罗提取有更高的选择性对巴萨的应变相对于所使用的哺乳动物细胞系。Parinari congensis和Monanthotaxis caffraSI值< 10 CAM06和W2一株。雀稗scrobiculatum和拜登pilosa也有< 10场应变CAM06 SI值。

在急性毒性测试中,5000毫克的提取每公斤体重的老鼠是管理。在政府,一个动物死亡记录(占20%)气味清香guineense和Parinari congensis分别在第一次16小时和24小时。此外,两组动物在一开始的时候观察期间和显著恢复后24小时。老鼠的增长模式控制或处理提取非常相似。几乎在所有的组,观察体重增加1天到第14天。图1说明了不同的治疗组的体重变化在两周。

三种提取显示明显的antiplasmodial活动在体外常用的(即在加纳。,have significant traditional importance) were evaluated for在活的有机体内antiplasmodial活动使用为期4天的抑制试验和结果总结在表5。有实质性的下降百分比寄生虫血症为所有提取物治疗组相比,消极的控制。最大抑制寄生虫血症中观察到拜登pilosa治疗组有百分之一chemosuppression 74.73。然而提取都不如奎宁,它记录chemosuppression 90.22%。

4所示。讨论

植物药物一直是小说的来源为各种疾病治疗药物。两个最重要的抗疟药青蒿素和奎宁,源于青蒿和金鸡纳树,分别为(31日]。植物药物也发挥了至关重要的作用在初级卫生保健中对于大多数的世界人口,特别是在疟疾治疗(10]。不幸的是,科学验证这些药物的使用是没有和业内代表着一个重大的挑战32]。本研究评估的antiplasmodial潜力11药用植物用于治疗疟疾和像症状在加纳。化学类的植物来源已被证明是潜在antiplasmodial代理。生物碱类、萜烯类黄酮、香豆素和柠檬苦素类似物是一些例子(31日,33]。植物化学物质可能单独行动或与其他植物成份协同作用引起观察到的生物活性。据报道,生物碱类、黄酮类和倍半萜烯,一般来说,强大的植物次生代谢产物显示广谱生物活性(34]。提取调查研究中拥有一些植物化学物质,可以观察到的原因antiplasmodial活动。

植物的选择在这项研究中,antiplasmodial活动3植物出现在文献中。的antiplasmodial活动拜登pilosa已报告的研究人员在非洲和巴西。一个研究小组在巴西35)报道,50μ克/毫升乙醇和氯仿提取物的叶和茎的部分拜登pilosa抑制恶性疟原虫增长了90%。同样的,(36报道一个抑制寄生虫增长45%乙酸乙酯提取相同的植物。2004年,克拉克森和同事报道一个集成电路₅₀5μ克/毫升和70年μ克/毫升的甲醇和水提取,分别为(37]。在我们的研究中,拜登pilosa提取显示很高的活动仍然W2应变,同意先前的报告。适度活动然而观察向chloroquine-sensitive(巴萨)和字段(CAM06)恶性疟原虫。的antiplasmodial活动根的部分拜登pilosa已被归因于聚乙炔和黄酮类化合物的存在38]。叶提取物用于这项研究类黄酮阳性,也负责高活动。Mitragyna ciliata提取显示中度antiplasmodial活动对所有3恶性疟原虫压力测试在这项研究中,同意在2007年进行的一项研究集成电路₅₀值介于10至44岁μg / mL为各种溶剂提取物(39]。相反,另一项研究报告与IC antiplasmodial活动₅₀价值超过100μ克/毫升(40]。活动之间的相似性和Adjetey和他的同事们研究[39]可能在于使用相似的溶剂系统提取的这两项研究。有趣的是,它也被报道说m . ciliata提取能够调节氯喹活动扭转电阻在应变(仍然39]。叶中提取的气味清香guineense显示高antiplasmodial活动在体外反对W2和CAM06。的antiplasmodial活动气味清香guineense也被报道,但只有在一个在活的有机体内模型,观察49% chemosuppression在政府中提取一种啮齿动物(400毫克/公斤41]。

8的antiplasmodial活动中使用的植物首次报告了这项研究。这些植物8雀稗scrobiculatum, Acridocarpus alternifolius, Clappertonia ficifolia, Parinari congensis, Monanthotaxis caffra,曼佗罗,Faurea叶,和巴豆penduliflorus。Acridocarpus alternifolius没有显示出antiplasmodial活动对巴萨和CAM06菌株恶性疟原虫测试与集成电路₅₀高于50的μg / mL,只显示中度活动向W2应变。曼佗罗时也不活跃W2但显示中度活动测试CAM06对氯喹敏感的巴萨的应变和承诺活动。尽管没有antiplasmodial活动的曼佗罗提取文献中存在,其他的antiplasmodial活动的报告曼陀罗属植物物种的存在。曼陀罗外型据报道活跃chloroquine-sensitive和氯喹耐药性菌株的吗疟原虫的寄生虫(42,43]。其他生物的活动曼佗罗抗氧化和细胞毒性等然而存在(44,45]。

Parinari congensis还显示承诺antiplasmodial活动对巴萨的应变chloroquine-sensitive,略微温和的活动对W2应变CAM06和不活动。提取的Parinari congensis已被证明具有抗氧化、抗炎和糖尿病调制特性(46- - - - - -48]。巴豆penduliflorus对所有显示承诺活动恶性疟原虫压力测试,而Monanthotaxis caffra显示中度活动向W2和CAM06菌株,但对巴萨的应变chloroquine-sensitive承诺活动。除了丹宁酸,这两种提取的植物化学的资料几乎没有共同之处。尽管没有antiplasmodial活动的记录Monanthotaxis caffra存在,据报道,提取和获得的化合物Monanthotaxis parvifolia表现出很好的antiplasmodial活动(49,50]。雀稗scrobiculatum和Faurea叶显示承诺温和antiplasmodial活动对所有3株。雀稗scrobiculatum对那是最活跃的,而Faurea叶对CAM06显示更大的活动。Clappertonia ficifolia被证明是一个最活跃的研究。在植物中提取的集成电路₅₀值与所有的寄生虫检测远低于10μ克/毫升。特别是高活动观察对巴萨的IC₅₀4.43μ克/毫升。

细胞毒性,提取CC₅₀值都超过30μ克/毫升。提取的气味清香guineense和Monanthotaxis caffra最有毒的LLC-MK2细胞,CC吗₅₀值低于100μ克/毫升。所有提取时non-cytotoxic浓度测试(17]。Clappertonia ficifolia表现出很好的antiplasmodial活动,也有高硅对3株(SI > 30),表明对寄生虫提取是有选择性的。雀稗scrobiculatum和拜登pilosa向仍然W2应变也表现出良好的选择性。

的急性毒性,即使一个死亡记录在第一天收到提取物治疗组气味清香guineense和Parinari congensis华夏基金₅₀对这些提取高于5000毫克/公斤,在经合组织指导方针表示。没有记录的所有其他治疗组死亡率超过14天的观察。体重的增加在所有测试组实验表明缺乏时间或低毒性。身体体重的变化是一个简单的和敏感的毒性指数在一个动物暴露在有毒成分(28]。

的在活的有机体内antiplasmodial结果表明,拜登pilosa在剂量为400毫克/公斤,拥有chemosuppression率为74.73%。这个同意早期的报告chemosuppression 36%的速度在250毫克/千克,这是大约一半的剂量用于这项研究[35]。Clappertonia ficifolia和雀稗scrobiculatum还显示好chemosuppression率。的结果在体外和在活的有机体内antiplasmodial测试Clappertonia ficifolia和雀稗scrobiculatum提取表明这些提取物可能含有一种物质,当孤立的疟疾药物发现可能是有用的。结果也验证中使用传统医学对疟疾的管理。

5。结论

这项研究的结果证实了传统使用这些药用植物治疗疟疾和像症状。毒理学结果显示需要一个常规评价药用植物在政府建立任何毒性。隔离的有效成分最活跃的植物在我们实验室正在进行。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

伦理批准

综述了项目建议书和程序和批准的机构伦理审查委员会对动物使用布埃亚大学,喀麦隆。

的利益冲突

所有作者声明没有金融竞争、专业或个人利益可能影响性能或演示本手稿中描述的工作。

作者的贡献

劳伦斯·谢林汉姆Borquaye和迈克尔Konney Laryea构思。所有的实验都是由劳伦斯·谢林汉姆Borquaye和迈克尔Konney Laryea。植物材料收集的迈克尔Konney Laryea。迈克尔Konney Laryea进行实验。数据分析是由迈克尔Konney Laryea和劳伦斯·谢林汉姆Borquaye。手稿是由劳伦斯·谢林汉姆Borquaye和迈克尔Konney Laryea。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

作者感谢化学系,恩克鲁玛科技大学库马西,加纳,和医学研究与应用生物化学实验室,布埃亚大学,喀麦隆,在这项研究中使用的设施。他们也感激丹尼斯Zofou博士医学研究和应用生物化学实验室,布埃亚大学喀麦隆、有益的讨论。克利福德先生巨人的草药,恩克鲁玛科技大学库马西,加纳,也承认他的帮助获得植物样本和验证。赞助提供的工作是一个国际科学基金会(IFS)合作研究(J / 5748 - 1)授予劳伦斯谢林汉姆Borquaye。