文摘
在墨西哥阿米巴病仍然是一个主要的健康问题。因此,寻找更好的文化媒体和低成本的诊断和治疗是至关重要的工具。我们提出一个新的培养基痢疾阿米巴这种微生物可以保护其毒性因素和诱发肝脓肿在动物模型的能力。这部小说俱乐部PEHPS媒介的媒介是一个改进的版本,以前在我们实验室设计。主要区别是替换PEHPS的生牛肝肺生牛肉在俱乐部中。比较的性能three-culture媒体(传统TYI-S-33 PEHPS和俱乐部),大肠阿米巴营养体是培养一式五份,其次是磷脂酶活动的评价和金仓鼠肝脓肿的感应。大肠阿米巴营养体生长更好比TYI-S-33俱乐部中。同样,CLUPS-cultured营养体产磷脂酶显著高于TYI-S-33-cultured营养体。最后,营养体生长在任何测试的三个媒体诱导肝脓肿也有类似的潜力。
1。介绍
阿米巴病是传染性疾病的主要原因之一,在墨西哥和非洲国家。世界卫生组织报道,在1997年,全世界每年大约有4000万例疾病病例和无症状地估计,超过4亿人被感染1,2]。不幸的是,没有最近的世界报告。
另一方面,自本世纪开始以来,小说不致病的痢疾物种已经认可(3,4]。持续改进的分子诊断工具可以促进更好的物种分化和识别(5]。新诊断技术的公司证实了原生动物病原体痢疾阿米巴仍然是胃肠道疾病的主要原因在墨西哥和世界的其他地方6,7]。pcr研究表明,大肠阿米巴存在于16 - 20%的患有胃肠道疾病(6,7]。更好的培养基可以促进在体外研究微生物等大肠阿米巴。理想情况下,培养寄生虫应该提供相同的增长和毒性特征在自然栖息地(同行8]。无菌培养大肠阿米巴在1961年首次通过钻石(9),使用双相的介质组成的serum-enriched琼脂基地由汤鸡精和补充维生素。1968年,钻石描述了一种新的单相介质称为TPS-1 [10)接受伟大的接受研究人员培育阿米巴虫。1978年,一个新媒体介绍了含有酵母提取物代替Panmede(牛肝的木瓜蛋白酶消化)11]。这种新的媒介,TYI-S-33,成为最受欢迎的11]。casein-free替代,YI-S,从未被广泛使用12,13]。1988年,我们小组报告一个内部开发的无菌培养基,PEHPS [14]。PHEPS基于TPS-1但取代Panmede胰腺消化生牛肝中描述(14]。的主要组件大肠阿米巴无菌培养媒体肽,氨基酸(trypticase或酪蛋白消化蛋白胨)、核酸(酵母提取物),碳水化合物(葡萄糖),脂质(血清),和维生素。肠道原生动物的新培养基的发展允许学习生物学的寄生虫,他们的增长率,毒力因素(如磷脂酶活性),对新药,和耐药菌株的出现,以及其他方面(15]。
PEHPS介质设计的需要一个经济中没有interlot可变性生产培养基中。商业媒体TYI-S-33和TPS的补充剂,Panmede,酵母提取物当前批次变化(16),而我们的内部PEHPS生产作为一个单独的很多,每年需要消耗(14]。PEHPS的主要成分是酪蛋白胨、肝脏和胰腺提取、和牛血清14]。牛血清是至关重要的,不能代替;营养体死在第三天在无血清培养17]。然而,现在不便牛肉提取物是残留的抗生素和抗寄生虫药物可能存在,作为牛的肝脏(已被证明18,19]。我们之前证明伊维菌素和类似的抗寄生虫药物抑制在体外的增长大肠阿米巴(20.]。
本研究的主要目的是证明新俱乐部促进适当的媒介大肠阿米巴增长而不影响毒力因素也引起肝脓肿在动物模型的能力。
2。材料和方法
2.1。生物材料
牛肝、肺、胰腺,胰腺和猪肉是在当地获得从最近牺牲动物屠宰场。所有的器官都在冰和操纵如前所述14]。提取被冻结在-20°C到使用。
2.2。介质制备
俱乐部培养基的组成和制备的相同PEHPS介质(14),除了替换牛肝肺(PEHPS)牛肉(俱乐部)。俱乐部的主要成分是酪蛋白、肺和胰腺提取、和牛血清。表1比较这三个媒体的构成、PEHPS TYI-S-33和俱乐部。一旦准备好,基础培养基被过滤在0.22 -消毒μm过滤器(微孔,微孔公司Billerica,妈,美国)并存储在5.5毫升整除在-20°C。在使用之前,俱乐部补充8.3% v / v牛血清。牛血清也产生内部如下:大约15 L新鲜血液从牛供人类消费的无菌的方式收集在当地屠宰场。血清凝血后,恢复,补充是heat-inactivated (56°C, 1 h)。接下来,血清预滤器通过绘画纸1号纸之前sterile-filtered通过一系列无菌微孔HAWP过滤器(微孔,微孔公司,Billerica,妈,美国)从5到0.22μm。血清冻结在-70°C到使用。
2.3。文化压力
营养体的大肠阿米巴HM1:应变IMSS TYI-S-33介质在无菌条件下培养。参考压力维持在13×100毫米硼硅酸盐螺旋帽管包含5.5毫升TYI-S-33培养基+ 0.5毫升牛血清。每个管接种1×104营养体/毫升和孵化为36.5°C 72 h直到[描述的阿米巴虫是收获21]。变形虫密度决定了血细胞计数器根据Lopez-Revilla和Rodriguez-Baez [22在受移植者之前)。
化验,寄生虫在无菌条件下保持在36.5°C 30天通过串行subcultivation TYI-S-33 PEHPS或俱乐部的媒介。
增长曲线大肠阿米巴在TYI-S-33、PEHPS或俱乐部中测定每24小时5天一式五份。血细胞计数器是用于确定营养体的数量/毫升,倍增时间是计算线性回归(23]。收益率在每种文化决定结束时对数生长期(72 h(孵化)。
2.4。收集Phospholipase-Containing亚细胞的比例
磷脂酶活动可以恢复一部分e使用先前描述的细胞分离方法(24]。培养原生动物是收获和洗两次磷酸盐,pH值7.0离心(1500x g,10分钟)。原生动物是resuspended和稀释2卷的汉克的平衡盐溶液。接下来,营养体是均质使用电动Elvehjem-Potter聚四氟乙烯/玻璃均质器(100中风)获得“总提取”。“总提取”是离心机,享年30000岁x g10分钟。上层清液(S30)和沉淀(e)存储在200年μ在-70°C l整除,直到使用。
2.5。检测磷脂酶的活动
磷脂酶活动的类型1和一个2确定根据Vargas-Villarreal et al。24]。分析色谱分析放射性水解产物,要么游离脂肪酸(FFA)或lysophosphatidylcholine (LPC) 2-palmitoyl——(2-palmitoyl -14C)磷脂酰胆碱(14C-PC)。放射性物质的色谱斑点对应14C-LPC,但不是的14C-FFA,表明A型1活动;在相反的情况下,会有一个类型2磷脂酶的活动。购买来自新英格兰的核放射性基质,波士顿,质量。每一个(4以上μCi /试验)和1.0毫升0.1钠Tris-base缓冲区(pH值8.0),CaCl 2毫米2、0.2% Triton x - 100和0.27毫米磷脂酰胆碱。的混合物是用Ultratrip Labsonic系统(Lab-Line仪器有限公司,梅尔罗斯公园,IIinois),这对60年代在40 W。合成乳胶分布在0.5毫升整除,储存在-70°C,直到使用。
e分数(10μL包含200μ10 g总蛋白质)混合μL衬底和孵化36.5°C(水浴)为2.5 h。通过添加25反应停止μL 5%三氯乙酸/正丁醇停止解决方案包含以下内部控制:大鼠肝脏游离脂肪酸(FFA);最终浓度1毫克/毫升),蛋黄lysophosphatidylcholine (LPC的;1毫克/毫升),蛋黄磷脂酰胆碱(PC);0.75毫克/毫升)。
水解混合物是坐落在一滴一滴地10×10厘米的起源硅胶薄层色谱板(60网;默克公司,达姆施塔特,德国)。盘子被置于一个发展与溶剂罐系统组成的氯仿:甲醇:乙酸:水(140:40:16:8卷)。脂质点是由接触碘蒸气(25]。属于电脑的斑点、LPC的和FFA,恢复了挠,混合着5毫升液体闪烁混合物(2 6%,5-diphenyloxazole /甲苯)在20毫升瓶的点睛之笔,和量化液体闪烁计数器(1600帕卡德Tri-Carb tr、贝克曼仪器)24]。所有的决定进行了三次,一式三份,平均数±标准差。总蛋白的特定磷脂酶活性(PLAU /毫克/ h)计算了任意定义1单位磷脂酶的水解(PLAU) 1 pmol (2 -14C-PA) - pc。
2.6。量化的蛋白质
蛋白质浓度被洛瑞量化方法(26]。
2.7。毒性测试,肝脓肿形成
所有动物意识到这项研究工作实现了根据国际伦理准则。所有程序都是由一名兽医动物专家处理。刚断奶,男黄金仓鼠(Mesocricetus auratus),重达40 - g (27),和63毫克/公斤戊巴比妥钠麻醉腹腔Anestesal®(Smithkline诺顿、墨西哥)使用一个注射器G25针,所以仓鼠仍将麻醉一小时包括下半场深麻醉。这样,痛苦的动物,是最小化。在无菌条件下剖腹手术实现了在每一个仓鼠。肝脏的腹侧叶接种一个包含10个0.1毫升悬架的基础培养基6营养体生长在PEHPS、俱乐部或TYI-S-33介质(n = 4)。负对照组与寄生虫培养基接种。接种后,切口缝合使用连续挂锁[28]。手术后,仓鼠都在标准实验室条件下与水和食物随意了三天,直到他们被安乐死牺牲与麻醉剂过量戊巴比妥钠(130毫克/公斤)。确保动物死亡后(没有呼吸或心跳),一个开腹探查术进行评估肝脓肿形成损伤的直接观察和测量。这里,削减在解放所有动物的肝脏无菌手术刀叶片直到肝脏损伤被发现和测量。
2.8。统计分析
学生的t以及被用来比较组和正态分布;一个p值< 0.05被认为是显著的。所有数据用SPSS v18进行。
3所示。结果
经过一个适应滞后,营养体的大肠阿米巴嗯1:IMSS,从TYI-S-33转移到俱乐部和PEHPS媒体,后者2媒体更好的增长在72年和96年h转移后,俱乐部> PEHPS > TYI-S-33(图1)。营养体生长在俱乐部中有32%和19%的收益率比那些生长在72和96 h TYI-S-33介质,分别,而俱乐部的收益率高于19%和8%的PEHPS同时孵化。俱乐部中允许的最短的倍增时间增长大肠阿米巴营养体(21.8小时);PEHPS的倍增时间为22.0 h和TYI-S-33 23.2 h。
(2 -放射性产品14C-PA) lpc的和(14C)棕榈酸积累培养时间的函数;几乎是线性增加第一个60分钟,然后减速,到达了一个高原在90分钟。营养体生长在任何three-culture媒体维护磷脂酶的生产1和一个2(图2)。然而,当寄生虫在俱乐部培养的产量更高。在120分钟的磷脂酶A1和一个2,俱乐部和TYI-S-33之间差异具有统计学意义,但不是俱乐部和PEHPS之间(图2)。最后,从(2 -水解产物的积累14C-PA) - pc增加P30蛋白量的线性函数1和一个2磷脂酶活性(图3)。
所有仓鼠接种了营养体培养在任何测试媒体显示肝脓肿的形成。所有脓肿直径大于3毫米。
4所示。讨论
我们引入一个新的培养基(俱乐部)的无菌生长大肠阿米巴。俱乐部的媒介是修改PEHPS介质(14];的生牛肝PEHPS被生牛肉肺在俱乐部所取代。俱乐部旨在避免在牛肝中抗生素残留。生长曲线和毒力因子分析是将类似传统PEHPS TYI-S-33介质或内部。出人意料地,我们发现营养体生长在俱乐部中表明磷脂酶活性高于那些生长在TYI-S-33介质(11]。
在种植72 h,营养体收益率在俱乐部在TYI-S-33高出30%。这优越的性能是重要的,不能用简单的媒体变化来解释(16]。当比较两个媒体的构成,主要区别是没有在俱乐部中酵母提取物。酵母提取物被认为是一个重要的组成部分在文化媒体阿米巴虫(29日,30.]。然而,我们已经保持了大肠阿米巴HM-1应变连续文化与yeast-extract-free PEHPS超过25年(14,21]。以上证明,酵母提取物不营养体生长所必需的。
当我们俱乐部之间的增长模式和PEHPS相比,似乎营养体生长在俱乐部比在PEHPS早些时候开始和结束。这个缺陷PEHPS可能是由于存在杀寄生虫药或抗生素残留在生牛肝18- - - - - -20.),而不是抑制增长可能会造成生长延迟。
磷脂酶生产的是相同的媒体;看似高产量俱乐部没有统计学意义。到目前为止,似乎俱乐部中优于PEHPS媒介文化大肠阿米巴营养体;但是这必须证明了长期使用。
阿米巴虫毒力因素的有效性在活的有机体内肝脓肿的形成;甚至有人表明阿米巴虫增加毒性后接种在仓鼠和恢复肝脏病变(31日]。虽然已经提到致病性阿米巴虫引起肝脓肿而不致病的阿米巴虫无法生产,最近,它已经表明,一些非病原的种类可以产生肝脓肿(32]。我们进行了一个试验来证明的营养体HM1: IMSS菌株生长在俱乐部中有能力生产肝脓肿以及那些生长在PEHPS TYI-S-33。
另外,俱乐部中可能包含的因素支持适当的增长和增加磷脂酶的活动。验证如果肺提取因素比其他文化媒体,我们将比较阿米巴虫培养的生长和酶活性在俱乐部或PEHPS媒介。目前没有商业中提取从动物器官10,11]。
这种寄生虫在这个新俱乐部的成功文化媒介允许执行分析的经济和稳定的环境。类似于PEHPS介质,俱乐部避免试验变化由于interlot可变性常见的商业文化传媒(13]。在这方面,应该提到,一批大型集中器官提取足以超过一年的供应内部准备中(14]。
可靠的培养大肠阿米巴在俱乐部中允许我们调查这个寄生虫的生物学,研究其毒性因素,开发更好的诊断方法,为更好的治疗方法,并测试新的药物。
总之,我们认为俱乐部介质是一个更好的选择培养基,既经济又免费的interlot变化出现在商业TYI-S-33。
伦理批准
本研究在当地注册墨西哥社会保障研究所的研究委员会。国际医学研究指导原则涉及动物。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
本研究支持FIS / /保护/ G15/1403 IMSS。作者感谢Gerardo Lozano博士优秀的兽医援助。