文摘
鞭虫病是一种疾病的贫困的排泄和分泌(ES)产品,从而诱导保护性免疫的研究作为候选疫苗抗原。在这项研究中,ES的产品t·缪里斯和免疫血清。免疫血清公认的20多个蛋白质2 d-gel ES的产品t·缪里斯成虫。Tm16是质谱分析发现的蛋白质之一。Tm16股票57%序列与Ov16身份,immunodominant诊断抗原盘尾属肠扭结。重组与羧基末端Tm16 hexahistidine生产使用毕赤酵母属pastoris。多克隆抗体rTm16所生成的一个主要和two-boost免疫三个雌性Balb / c小鼠25μ克重组Tm16 ISA720佐剂乳化。这些多克隆抗体证实Tm16本地化的ES产品和可溶性部分成人蠕虫。此外,Tm16的高分辨率的晶体结构是通过分子置换来解决。Tm16属于phosphatidylethanolamine-binding-like蛋白(PEBP1)家族,这是第一个结构PEBP1寄生虫。
1。介绍
鞭虫trichiura三种最常见的土壤传播线虫,导致超过4.5亿人鞭虫病,估计全世界有544000残疾调整生命年根据2015年全球疾病负担研究[1]。鞭虫病仍然是一个问题在美国,有13%的学生在克莱县,肯塔基州,出没鞭虫trichiura(2- - - - - -4]。鞭虫病也是一个健康关心穷人在墨西哥湾沿岸的农村地区,阿巴拉契亚部落土地,和内心的城市,和难民社区,囚犯,心理健康患者,农民工,和孩子们在全国各地被允许在土壤或沙子,可以污染(3,4]。当前方法土壤传播寄生虫感染如鞭虫病包括大规模药物治疗,但主要的药物(甲苯咪唑、阿苯达唑)用于治疗鞭虫病(28 - 36%)低治愈率(5),不完全打破再感染的恶性循环(6]。这一观点解释了为什么全球人类鞭虫感染仅下降2.1%在过去的十年里(1),是一个重要的需要替代疗法,改善感染者的健康为了缓解全球卫生和被忽略的经济和社会负担。目前,鞭虫病诊断使用粪蛋数量和需要开发额外的诊断方法。
一个可能的方法是识别诊断或疫苗抗原t . trichiura使用鼠标一样,鞭虫缪里斯作为一个模型。就像t . trichiura t·缪里斯鞭虫的狭长头部嵌入大肠上皮细胞层的主机。有优先级描述ES产品作为寄生虫的候选疫苗抗原。ES产品已知抑制宿主的免疫反应,促进寄生在宿主的充满敌意的环境7,8]。小鼠免疫和一些西文产品几乎无菌保护性免疫力的挑战t·缪里斯的感染鸡蛋(7,8]。我们发现疫苗的努力包括ES产品的识别和描述,从而诱导保护性免疫的候选疫苗。我们在座的识别、生产、和鞭虫ES Tm16晶体结构的蛋白质。Tm16股票57%氨基酸与Ov16身份,immunodominant诊断抗原盘尾属肠扭结。Ov16被确认来自西非盘尾丝虫病患者血清和决心是一个选择性抗原被认为只有从感染者血清盘尾属肠扭结,但没有其他丝虫的寄生虫感染人9]。
基于其氨基酸序列,Tm16属于PEBP和DOCK1总科。PEBP中高度保守的微生物包括细菌、酵母、线虫、植物、果蝇和哺乳动物(10)与功能参与控制的几个信号通路与其他细胞组件交互包括地图的抑制激酶途径(10),NF -B通路(11),监管heterotrimeric G蛋白的作用[12],丝氨酸蛋白酶抑制(13]。PEBP也充当一个激酶调节器控制形态之间切换拍摄增长和花结构(14]。DOCK1(也称为DOCK180)坐标ELMO1调节小GTPase Rac,从而影响一些生物过程,包括吞噬作用、细胞迁移、和信号通路。Dock1在秀丽隐杆线虫Rac-dependent细胞迁移中起着至关重要的作用,整个胚胎和成年生活至关重要的线虫(15]。DOCK180是一个效应分子,能传感信号通过CRK适配器蛋白质酪氨酸激酶(16]。Farnesylated DOCK180可以推动细胞传播,这意味着它是由酪氨酸激酶参与细胞运动的规定。一些研究建议DOCK1-like蛋白参与了细胞骨架重组所需的吞噬细胞延长其表面在垂死的细胞吞噬作用期间(17]。
2。材料和方法
2.1。生产的排泄和分泌(ES)的产品t·缪里斯和免疫血清
ES产品生产使用建立协议(18- - - - - -25]。ES产品从一夜之间获得的文化t·缪里斯成虫隔绝实验室维护STAT6 / KO小鼠。集中t·缪里斯ES产品用于AKR鼠进行免疫接种,产生抗血清,并测试疫苗功效t·缪里斯感染。与100年每个老鼠皮下注射免疫μg ES产品制定ISA720 (Seppic、法国)三次间隔2周。抗血清(鼠标anti-ES血清)获得免疫小鼠后10天最后免疫和免疫小鼠随后与300年的挑战t·缪里斯受孕的鸡蛋。
2.2。ES产品的电泳和免疫印迹
收集anti-ES血清免疫小鼠t·缪里斯ES产品。鼠标anti-ES血清用于识别ES产品分开在2 d凝胶如前所述26]。简单地说,100年μg / 600μ克t·缪里斯ES产品两个二维凝胶上分离。这种凝胶含有100μ克t·缪里斯ES产品转移在PVDF膜,含有600μ克t·缪里斯ES产品与考马斯亮蓝染色。使用鼠标anti-ES识别的斑点免疫印迹免疫血清作为主要抗体和HRP-conjugated anti-mouse免疫球蛋白(表达载体,美国,1:5000)二级抗体。点被ECL可视化化学发光(热科学,美国)。有超过20个蛋白质斑点免疫血清的认可。十的公认的相应的蛋白质斑点Coomassie-stained凝胶与免疫印迹图像和切除被匹配。
2.3。蛋白质鉴定和液相色谱串联质谱(质/女士)
十个景点被切除的2 d-page凝胶ES产品和发送到耶鲁大学凯克生物资源实验室对蛋白质识别用液相色谱串联质谱(质/ MS)。一旦收到凯克生物技术中心,点用50%乙腈与摇摆10分钟,然后用50%乙腈/ 50 mM NH洗净4HCO3。最后一个洗后NH 50%乙腈/ 10毫米4HCO3,这种凝胶点被速度真空干燥。每个点resuspended 35μl NH 10毫米4HCO3包含0.25μg消化年级胰蛋白酶(Promega V5111)和孵化37°C 14个小时。
质/ MS分析进行热科学Orbitrap精英配有水域nanoAcquity UPLC系统利用一个二元溶剂系统(缓冲:100%的水、0.1%甲酸;缓冲B:甲酸乙腈100%,0.1%)。捕获了在5μl / min, 97%缓冲使用海域的3分钟对称®C18 180μm×20毫米陷阱列。肽分离使用ACQUITY UPLC PST(本·)C18 nanoACQUITY列1.7μ米、75μm×250毫米(37°C)和筛选了300 nl /分钟以下梯度:3%缓冲B在初始条件;10% B 1分钟;在38分钟35% B;在43分钟90% B;B在48分钟90%;在50分钟回到初始条件。女士在Orbitrap收购剖面模式在300 - 1800 范围使用1微扫描30000决议,AGC的目标1 e6,一个完整的马克斯离子50毫秒的时间。收集15 MS / MS / MS扫描物种达成3000年强度阈值(电荷状态一个及以上)。数据依赖MS / MS在离子阱在质心模式使用1微扫描,15000决议,AGC的目标2 e4,马克斯的100 MS, 2.0 隔离窗,CID碎片的规范化的碰撞能量35。启用动态排除重复数1,重复30年代期间,排除列表大小为500,和排斥60年代的持续时间。
数据搜索内部使用吉祥物算法(矩阵科学;2.5.1版)后未解释MS / MS谱使用吉祥物蒸馏器程序来生成峰列表。对一个NCBInr数据库数据搜索。搜索参数使用胰蛋白酶消化高达2错过分裂;10 ppm的肽质量公差;MS / MS片段+ 0.5 Da的宽容;和变量修改半胱氨酸的氧化和丙酰胺加合物。正常和诱饵数据库搜索是搜索来确定错误发现率,与置信水平设置为95% ( )。
2.4。Tm16重组蛋白的生产
DNA编码完整Tm16从成人的总第一链cDNA放大t·缪里斯和克隆到毕赤酵母属pastoris表达载体pPICZα(美国表达载体),使用EcoRI和NotI限制网站添加一个c端hexahistidine标签。正确的开放阅读框(ORF)测序证实了使用相对应的向量在引物侧面区域编码α因素和3′AOX1基因。重组质粒的线性化后消化尚驰和转化p . pastoris通过电穿孔X33应变。一个殖民地是选自zeocin-resistant YPD盘子和重组Tm16蛋白质(rTm16)在媒体含0.5%甲醇诱导表达72小时。文化的上层清液含有分泌rTm16 0.22被离心分离和过滤μm PES过滤器。净化了rTm16倪固定化金属亲和色谱法(IMAC)和与咪唑洗脱梯度相同的缓冲区。纯化蛋白是透析对TBS pH值7.5删除咪唑,集中1.6毫克/毫升,储存在−80°C。
2.5。结晶、数据收集和结构的决心
rTm16结晶是平的盘子在289 K使用蒸汽扩散。坐在包含下降1.5μL(22毫克/毫升rTm16 5毫米Bis (2-hydroxyethyl) aminotris(羟甲基)甲烷pH值6.5和1.5μL沉淀剂的解决方案(0.1 M消息灵通的pH值7.5,10% (v / v)异丙醇,20% (w / v)挂钩4000),而储层含有300μL的沉淀剂的解决方案。晶体的尺寸0.2毫米×0.05毫米×0.5毫米(图S.1补充材料,可在网上https://doi.org/10.1155/2017/4342789)在48小时内,这些晶体衍射的最大~ 1.7在主源。
晶体是flash-cooled直接在一连串的N2气体收集衍射数据之前在113 K贝勒医学院的核心设施(Rigaku HTC探测器,Rigaku FR-E +超亮的微焦点旋转阳极发生器,与最大方差法高频光学)使用清楚(《星际迷航》)包27]。数据集成使用MosFLM和扩展SCALA [28]。数据收集和处理统计数据总结表1。
Tm16结构是解决分子置换(先生)使用移相器(29日,30.)与人类phosphatidylethanolamine-binding蛋白质的晶体结构pdb代码1本·[31日)的所有配体和水作为搜索模型。沉积模型是通过模型构建与傻瓜(32与凤凰[]和结构改进33]。结构数据生成使用PyMOL [34]。总结在表结构解决方案,细化统计数据1。质量的电子密度如图S.2地图。
2.6。凝胶排阻层析法和Multiangle光散射(SECMALS)
rTm16集中和缓冲交换使用10 15毫克/毫升PBS kDA截止滤光片(Amicon ultra - 0.5毫升离心过滤器)。25μL rTm16被注入到Phenomenex耶那3μ米秒- 2000列(Phenomenex托兰斯,CA) 0.5毫升/分钟的流量使用安捷伦1260无穷系列高效液相色谱法。流动相是PBS缓冲pH值7.4。发现洗脱,紫外检测器(安捷伦),一个miniDAWN triple-angle光散射检测器(怀亚特科技),和一个Optilab雷克斯微分折射计(怀亚特技术)串联连接。蛋白质浓度监测在使用蛋白质消光系数的峰值在280海里。的各向同性散射体探测器正常化是牛血清白蛋白。分子质量计算的光散射和干涉折射计数据使用阿斯特拉6.1软件。
2.7。代的鼠标抗血清和免疫印迹
生成多克隆抗体Tm16,三个雌性Balb / c小鼠皮下注射免疫25μ克重组Tm16 (rTm16)用ISA720佐剂乳化(Seppic、法国),紧随其后的是两个促进三星期的时间间隔。最后提高14天后,老鼠安乐死,收集他们的血液,血清分离和汇集。结果老鼠anti-rTm16血清整除,储存在−20°C。本机Tm16的本地化t·缪里斯成年ES产品是由使用鼠标anti-rTm16血清蛋白免疫印迹。总5.0 - -10.0μ克t·缪里斯成年ES分离在预制4 - 20%梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶(表达载体)转移到PVDF膜(微孔)。本机Tm16是探测1:4000稀释的鼠标anti-Tm16血清和可视化HRP-conjugated anti-mouse免疫球蛋白(英杰公司、美国、1:5000)和ECL化学发光(热科学,美国)。50 ng rTm16 rTm14-3-3,另一个重组t·缪里斯蛋白质,分别作为积极的和消极的控制。
2.8。系统发育树的一代
系统发育树生成使用一键分析模式在网上http://www.phylogeny.fr。肌肉3.8.31用于多重序列比对而PhyML 3.1发展史和TreeDyn 198.3被用于渲染树。
3所示。结果
3.1。识别Tm16
的t·缪里斯排出产品分离二维凝胶和可视化Coomassie染色(图1(一))或探测用鼠标anti-ES免疫血清(图1 (b))。Coomassie-stained凝胶和免疫印迹凝胶和匹配相一致。十个重叠的地方被切除的蛋白质质谱分析(MS)鉴定。通过对基因库爆炸搜索数据库,187氨基酸蛋白质氨基酸身份与Ov16分享57%,一个immunodominant抗原盘尾属肠扭结(9身份与人类Tt16),和86%t . trichiura(CDW60800.1)识别和Tm16命名。主要的蛋白质被女士详细表2。
(一)
(b)
Tm16被确认在9点和7都写在大胆的表2。信心得分的每个肽的识别Tm16吉祥物所提供的蛋白质提供了表3作为证据的鉴定蛋白质在每一个点分开。
种系发生树比较Tm16表明它属于同一分支Ov16(图2)。Tm16属于phosphatidylethanolamine-binding-like蛋白质(PEBP)和奉献者的胞质分裂蛋白1 (DOCK1)总科(图2)。的PEBP总科中高度保守的微生物包括细菌、酵母、线虫、植物、果蝇和哺乳动物(10]。PEBP参与控制的几个信号通路与其他细胞组件交互包括地图的抑制激酶途径(10),NF -B通路(11),监管heterotrimeric G蛋白的作用[12],丝氨酸蛋白酶抑制(13)和作为一个激酶调节器控制形态之间切换拍摄增长和花结构(14]。
3.2。生产rTm16和本地Tm16本地化
rTm16高度表示为可溶性蛋白在毕赤酵母属酵母pastoris x 33,甲醇诱导和可以净化~ 99%纯度的IMAC(图3(一个))。抗血清产生对rTm16(鼠标anti-rTm16)已经足以确定本机Tm16的本地化t·缪里斯蠕虫免疫印迹和证明,本机Tm16本地化t·缪里斯成年ES产品(图3 (b))。鼠标anti-rTm16 Tm16也是特定的,不承认另一个重组hexahistidine标记t·缪里斯抗原Tm-14-3-3(图3 (b))。重组Tm16出现~ 1 kDa高于本地Tm16自rTm16包含hexahistidine标记表达糖基。
(一)
(b)
3.3。Tm16结构
Tm16解决分子的结构替代单体在不对称单位。晶体结构,rTm16单体的解决方案和解决方案分子质量取决于SECMALS ~ 21.4 kDa(图4(一))。原子坐标和结构因素已经存入加入5号tvd下的蛋白质数据银行。Tm16的典型拓扑phosphatidylethanolamine-binding-like蛋白质(PEBP),有四个螺旋和九个β链,包括中央six-strandβPEBP褶皱(图的表4 (b))。一个大型中央腔对应于假定的PEBP配体结合口袋位于中央测试表(数据的结束4 (c)和4 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
发现的结构类似于Tm16大多数是3 d结构对齐使用PDBeFold结构相似的选项(http://www.ebi.ac.uk/msd-srv/ssm/)和人类最相似的结构phosphatidylethanolamine-binding-like蛋白质(hPEBP) [31日与其他哺乳动物]其次是同系物。的主链原子Tm16单体结合hPEBP rmsd的所有主链原子(图0.4565(一个))。此外,假定的绑定Tm16腔也非常符合hPEBP有足够的空间来容纳配体(图5 (b))。Tm16的结构可以作为一个合适的模型来预测其他寄生虫phosphatidylethanolamine-binding-like蛋白质的结构预测基于拓扑和保护(图序列5 (c))。
(一)
(b)
(c)
Tm16是第一个结构的晶体结构的寄生虫PEBP和显示一个典型的phosphatidylethanolamine-binding-like拓扑,绑定腔能够容纳各种配体和暗示的能力与大分子结合相关信号通路和转导、细胞迁移和法规(数字4和5)。因为Tm16股票与hPEBP广泛的结构相似,它可能有类似的功能。
鉴于Tm16之一t·缪里斯分泌蛋白免疫小鼠诱导保护性免疫,它可以作为公认的候选疫苗预防调查鞭虫感染。的高收益表现Tm16可溶性重组蛋白在可伸缩的重现p . pastoris系统的第一步发展它使用我们作为疫苗试验的候选疫苗t·缪里斯小鼠模型。由于相似性Tm16 Ov16它可能更适合作为诊断抗原。需要更多的研究来确定Tm16函数作为摘要PEBP / DOCK1监管分子和影响这些假定的功能对Tm16未来的应用。
5。结论
Tm16被确认为抗原的发现努力的一部分,和方法开发的生产和净化Tm16。其相似性Ov16使其成为一个有前途的诊断抗原。产生的重组蛋白是单分散的,纯粹是用于结构的决心。Tm16是第一个寄生虫PEBP结构,揭示了哺乳动物PEBP重要结构相似。的角色Tm16生存的寄生虫在宿主,人类鞭虫病的病理学和开始交互基于其假定的功能配体结合和细胞信号是未来调查的主题。
信息披露
原子坐标和结构因素已经存入加入5号tvd下的蛋白质数据银行。
的利益冲突
作者没有利益冲突的声明。
作者的贡献
Oluwatoyin Asojo和本·詹构思研究和解释结果。刘Zhuyun生产蛋白质和ESP研究执行。Junfei魏ES和克隆实验进行生产的。珀斯Pollet SECMALS和分析SECMALS结果执行。Shanii泰伯和艾伦·凯莱赫识别和优化蛋白质结晶过程。Oluwatoyin a Asojo收集晶体数据,解决了晶体结构。本·詹和Oluwatoyin a Asojo写了初稿的手稿。Peter j . Hotez和玛丽亚艾琳娜Bottazzi怀孕了鞭虫病项目。所有作者同意最后的手稿。
确认
作者感谢Drs。琼Kanyo Tukiet Lam的质谱和蛋白质化学的w . m .凯克耶鲁大学生物资源实验室分析LC / MS女士和吉祥物。他们感谢疫苗探索中心在国家热带医学学院的贝勒医学院资助这些研究。他们感谢Nathaniel狼编辑指导。他们感谢Sukyeong Lee博士访问BCM x光设备和米切尔·l·米勒博士访问赖斯大学x射线晶体筛选设备。他们感谢艾丽莎m . Hudspeth费尔南达卢戈,塞拉姆Gebremedhin,和内森霍夫曼处理Shanii Tabb在夏天。Shanii泰伯被一个美国化学学会项目支持种子为高中学生奖学金。