两种转基因mCherry质粒pXG-mCherry的构建莱山岛：未来分子分析的宝贵工具

摘要

莱山岛是Leishmaniaisis的致病因子，一种忽略的热带疾病，影响了世界各地的1200多万人。由于收购阻力，目前的治疗是有毒的，有效的有效性莱山岛人群。因此，寻求新的抗利什曼病药物是当务之急。现有的药物筛选方法基于使用重要染料的比色法测定是耗时的。目前，荧光报告蛋白的使用正在取代活性指示染料的使用。我们构建了两个表达红色荧光蛋白mCherry的质粒，具有多个克隆位点(MCS)，足以构建N端和c端融合蛋白。我们的结果也表明，改进的pXG-mCherry质粒可以用于药物筛选在体外．使用红色荧光蛋白MCHERRY是一种更容易进行多种测定的工具，不仅要测试药理化合物，还可以确定蛋白质的亚细胞定位。

1.介绍

利什曼病是由利什曼原虫属引起的一种被忽视的热带病莱山岛．根据世界卫生组织(世卫组织)的数据，3.5亿人面临感染风险，因为没有商业疫苗可用于预防[1.]．谁强调迫切需要开发新的药物治疗，疫苗和更具体的敏感诊断方法。

自承认莱山岛作为利什曼病的病原体，通用五价抗疟药一直是对抗该病的基本化疗药物。Pentostam®和Glucantime®是通用抗疟药治疗的品牌替代品。其他治疗方法，如两性霉素B和米尔福新，疗效更高，但比pentav更昂贵抗利什曼病药物。帕罗莫霉素和戊脒等抗病原体在利什曼病的治疗中显示出一定的益处，尤其是与其他药物联合使用时。但是，所有这些药理化合物都会产生严重的副作用，但没有完全治愈的信心，而且目前存在各种各样的副作用莱山岛菌株对这些药物产生了耐药性[2.]．

新药物的潜在利什摩活性的分析可以通过比色法进行，这需要使用染料，但有一些限制，例如耗时。目前应用于研究的染料有MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)和resazurin(7-羟基-3H-phenoxazin-3-一氧化物），用作细胞活力的指示剂的蓝色染料[3.–6.]，基于氧化还原过程。记者染料的限制导致使用遗传改性莱山岛用于不需要使用上述染料的生物发光和荧光药物筛选的寄生虫。

荧光素酶表达莱山岛寄生虫已被证明是有效的在体外和体内实验感染期间的研究[7.,8.]然而，发光分析需要添加昂贵的底物，如柯伦他嗪或荧光素，以检测转基因生物发出的光。这使得荧光莱山岛更有用在体外测试。实际上，荧光报告蛋白随时间推移提供非常稳定的信号，不需要特定的底物，并允许在组织研究中识别单个寄生虫[9,10.]．表达报告基因构建体的寄生虫的最新进展已被证明是一种快速方法，具有高通量/产量的药物筛查[11.]众所周知，发现新的潜在有效的化合物来对抗这种疾病仍然是一个优先事项。

此外，荧光蛋白质粒构建可以在相同的阅读框内添加基因序列，以获得融合蛋白，是确定感兴趣蛋白质亚细胞定位的有用工具[12.]．

麦赫里蛋白来源于心脏病马斯塔显示出比GFP（绿色荧光蛋白）更高的光稳定性和组织渗透性，范围为610 纳米和587 纳米激发波长[13.]这种红色荧光蛋白已被证明是一种很好的治疗手段在体外和体内化验和药物筛选[2.,9,14.]．通过使用莱山岛在此基础上，构建了表达mCherry的质粒pXG莱山岛spp．我们还通过在pXG-HYG质粒的克隆笼中添加新的限制性内切酶位点来改进pXG-HYG质粒，使其适合于更简单和更好的融合蛋白构建。

2.材料和方法

2.1.寄生虫和动物

L.大调原鞭毛体在26℃的M199培养基(不含酚红;Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)补充25 mM HEPES (pH 7.2;Sigma-Aldrich)， 0.1 mM腺嘌呤(Sigma-Aldrich)， 0.0005% (wt/vol)血红素(Sigma-Aldrich)， 2 mg/mL生物蛋白(Sigma-Aldrich)， 0.0001% (wt/vol)生物素(Sigma-Aldrich)， 10% (vol/vol)热灭活胎牛血清(Gibco Laboratories, Grand Islands, USA)，和40μg/mL庆大霉素（西格玛-奥德里奇）。

雌性BALB/c小鼠购自Harlan Interfauna Ibérica S.A. (Barcelona, Spain)。纳瓦拉大学的动物护理伦理委员会批准了所有涉及动物的程序。

2．2.pXG-mCherry分子结构

为了构建新的载体，通过PCR从pTREX mCherry扩增711 bp mCherry编码区。对于载体pXG-mCherry12（设计用于创建N端融合蛋白），我们使用带有NotI和XbaI序列的Fw引物CH01和带有BamHI序列的Rv引物CH02（表1）1.)，而对于pXG-mCherry34载体（设计用于产生C端融合蛋白），使用带有NotI的Rv引物CH03和带有BamHI和XbaI的Fw引物CH04（表1）1.）.

然后按照制造商的说明将PCR产物连接到PCR®2.1-TOPO®表达载体（ThermoFisher Scientific，Rockville，USA）中。连接产物用于转化DH5α大肠杆菌细菌通过对卡那霉素的抗性和DNA的核苷酸序列选择阳性菌落麦克里；并通过PCR确定其方向。

麦克里提取基因序列，BamHI酶切，连接到pXG-HYG中莱山岛因此，获得了两种新的载体，其中一种被指定为pXG-mCherry12，用于创建N端融合蛋白（图1）1（a）)，另一种命名为pXG-mCherry34，用于生成c端融合蛋白(图1（b））.并通过PCR验证了mCherry基因的表达方向和序列。

pXG-mCherry12, pXG-mCherry34, pXG-HYG转染至L.大调利用如前所述的Bio-Rad基因脉冲仪，通过电穿孔方法将log相寄生虫[16.]。在最终浓度为250%的潮霉素B金（法国图卢兹欧洲因维沃根）存在下，从M199琼脂平板中选择转染的寄生虫菌落 μg/mL，在M199中维持，浓度为150μg/mL潮霉素B。对所有转基因菌落进行生长曲线分析。进一步在体外研究，PXG-MCHerry12寄生虫主要使用。

2.3.荧光显微镜

麦克里然后检测表达。将pXG-mCherry12前鞭毛体离心并用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI I；西班牙马德里Abbott Vysia）染色。然后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS；ThermoFisher Scientific，Rockville，USA）清洗细胞两次，并用1%甲醛固定。

观察PXG-MCHERRY12的荧光莱山岛无鞭毛小鼠、4- 6周龄BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞用于研究。用2 mL无菌硫代乙醇酸(3%)肉汤(BD Difco)接种动物72小时，然后用5 mL冷RPMI培养基腹腔灌洗。然后用注射器去除巨噬细胞，如Neal和Croft(1984)所述[17.]并以2×10的密度接种在8孔培养室玻片（LabTek；BD Bioscience，比利时埃伦博德格姆）中^4.在RPMI培养基中每孔的细胞，使其在37℃下粘附过夜5％CO_2.培养箱。如Sacks等人（1985年）所述，通过负选择从固定培养物中分离出亚环pXG-mCherry12前鞭毛体[18.]使用花生酰霉素（PNA），并以1/10（巨噬细胞/寄生虫）的比例感染巨噬细胞。将平板在相同的条件下温育24小时，用PBS洗涤孔两次以除去非牙科寄生虫。最后，用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI I; Abbott-vision，Madrid，Spain）染色，用1％甲醛固定，并在尼康Eclipse 80i显微镜下观察。

2.4。测量荧光强度与寄生石数之间的相关性

10.^5.将通过负选择（PNA法）分离的pXG-mCherry12亚环前鞭毛体注射到每只小鼠的尾部底部，体积为100 μL磷酸盐缓冲盐水(PBS;ThermoFisher科学公司，Rockville，美国)。为了回收活寄生虫，在感染4周后，将感染小鼠的肝脏在含20%胎牛血清的Schneider培养基中均质，并在26℃下孵育，使无鞭毛体重新分化为荧光原鞭毛体。

为了评估寄生虫数量和荧光强度之间的相关性，增加寄生虫数量（在试验前后获得）体内用荧光分光光度法测定其荧光强度。进行了三个独立的实验。

2.5.利什曼原虫杀灭试验

指数相pXG-mCherry12寄生物播种于透明底的96孔黑色平板(200μL每个孔）随着在M199培养基中稀释并在26℃下稀释的浓度增加的两性霉素B和Miltefosine。孵育48和72小时后，半最大有效浓度（EC_50.通过两种不同的技术测量：荧光测量和比色方法。使用BMG Flyostar Optima Microplate读卡器（BMG Labtech，德国），在570-nm激发波长和620nm发射波长下监测荧光。另一方面，如前所述，使用用于比色测定3- [4,5-二甲基噻唑-2-基 - 2-2,5-二苯基 - 四唑溴铵（MTT）（Sigma，St.Louis，Mo，USA）如前所述[19.]．在PBS中制备MTT溶液，浓度为5 mg/mL。添加20之后μ每个孔的MTT溶液，在26℃下在4小时内孵育板。随后，80 μ将L二甲基亚砜（DMSO，PANREAC，SPAIN）加入到每个孔中以溶解甲硝酸盐晶体。在540nm处使用MultiSkan Ex Microplate光度计读数器测量光密度（OD）。

欧共体_50.通过将S形Emax模型拟合给剂量 - 反应曲线而获得。在这两种情况下，基于与未处理的对照细胞的比较来评估Promastigotes活力。结果表达为三个独立实验的平均值±标准误差（SEM）。

2.6。LPG1-mCherry融合蛋白的定位

LPG1从基因组中扩增（脂磷多糖）序列利什曼虫主要利用引物液化石油气- fw和液化石油气- rv对DNA进行PCR1.）.然后，将PCR产物连接到PCR2.1-TOPO表达载体中并用于转化DH5α大肠杆菌细菌。从重组细菌中提取的质粒是用NOTI消化的限制酶。凝胶纯化对应于LPG1将序列亚克隆到NOTI限制酶位点内的PXG-MCHERRY34质粒中。LPG1序列及其在pXG-mCherry34内的方向通过PCR和测序得到证实。将获得的质粒pXG-mCherry34-LPG1电穿孔利什曼虫主要细胞后上述寄生虫转染和菌落选择的方案。最后，通过荧光显微镜确认转基因寄生虫中的MCHerry-LPG1蛋白表达和定位。

2.7.统计分析

用GraphPad Prism 6.0h（GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA）执行统计分析[20.]．通过雇用未配对，两名尾被学生进行两组比较t测试。P值> 0.05被认为是不显着的。数据表示为平均值±SEM或平均值±SD。

3.结果

3.1。构建含有新型多克隆部位的PXG-MCHERRY载体（MCS）

将含有不同MCS的mCherry编码序列的DNA区域插入到细胞中莱山岛表达载体pxg，产生两个pxg-mcherry载体。两个构建体，称为pxg-mcherry12（7723bp）和pxg-mcherry34（7720 bp），也覆盖了潮霉素抵抗盒（图1.).如图所示1（a），PxG-MCHerry12呈现在荧光蛋白的N-末端以下限制性酶网站：Xmai，Smai，Bstxi和Noti，而PXG-MCHerry34在N末端和NOTI和BSTXI的Xmai，Smai和Xbai展示- 麦克里霉（图1（b））.通过PCR对pXG-mCherry12和pXG-mCherry34序列进行分析和确认。

３.２．两种荧光的产生L.大调分别含有pXG-mCherry12和pXG-mCherry34的菌株

将pXG-mCherry12引入L.大调通过电穿孔，通过荧光显微镜检查各种突变体进行MCHERRY表达。在大多数PXG-MCHERRY12活寄生虫中可以观察到一个显着的红颜色（图2（a））.此外，mCherry荧光通过流式细胞术检测(补充图S2在补充材料中可在线查阅https://doi.org/10.1155/2017/1964531）.荧光的产生L.大调因此菌株得到了确认。

根据这些数据，我们决定评估pXG-mCherry12克隆转染子的生长速率。如生长曲线所示，增殖速率与野生型没有差异（图1）2 (b)）.此外，相应的分析没有显示出显著的差异(图2 (b)）.

3.3。MCHERRY荧光L.大调与野生型细胞相比，寄生虫表现出类似的药物敏感性

为了分析药物敏感性，使用经典MTT法对我们的突变体和野生型细胞进行了进一步的实验。为了评估这一目标，目前用于治疗人类利什曼病的药物（米尔曲辛和两性霉素B）在野生型和pXG-mCherry12中进行了评估莱山岛在48和72小时内以不同的浓度 h、 欧共体_50.然后计算数值。两组之间未检测到差异（图3.)因此，我们的克隆在对照方面加强了上述相似性。

3.4.细胞内形式维持McHery表达：荧光强度与寄生虫数量相关

PXG-MCHERRY12红色荧光寄生虫从BALB / C感染的小鼠中获得。20％FBS Schneider的媒介允许Amastigotoot表格分化回荧光冠状物质。然后通过PNA阴性选择纯化的阶段寄生虫感染鼠腹膜巨噬细胞。数字4（a）展示了感染的巨噬细胞有荧光amastigotes。来自Amastigotes的荧光也被定量光谱氟状化（补充图S3）。补充图S3显示了PXG-MCHERRY12 Amastigotes的额外证据在体外骨髓源性巨噬细胞(BMM)感染。有趣的是，感染比率的增加(巨噬细胞:无鞭毛细胞= 1:12、1:25、1:50和1:100)也产生了更高的荧光强度。因此，表达mcherry的转基因细胞在体内感染和克隆的细胞内形式（图4（a）和补充图。S3）。

利用寄生虫数量的增加进行荧光评价，以评估寄生虫数量与荧光强度之间的相关性。实验用的是接种前和接种后获得的寄生虫体内以确定是否有荧光改变未检测到荧光减弱体内感染。如图所示4（b），经荧光光谱测量，绝对荧光强度与寄生虫数量(pXG-mCherry12回收寄生虫)之间有明显的相关性，相关系数非常显著)(图4（b））.有趣的是，类似的趋势()先前在pXG-mCherry12寄生虫中观察到的荧光强度（图4（b））.在pXG-mCherry12寄生虫和pXG-mCherry12恢复寄生虫中，质粒的拷贝数均未见差异(~80拷贝/细胞;补充图S1)。这些数据表明寄生虫数量与荧光定量之间呈线性关系。

3．5．新型荧光测定法与MTT技术的比较体外对细胞活力的评估（EC_50.)

细胞发出的绝对荧光与浓度的miltefosine和两性霉素B（图5.）.此外，还采用MTT技术评价生长抑制。因此比较了相应的剂量-响应曲线(图)5.）.

接触药物48 h后，EC如下_50.获得了数值（表1）2.):μm（荧光测定）与μm（mtt）对于两性霉素b和μm（荧光测定）与μ米替福辛的MTT值。72岁以后 h治疗方案（表1）2.），EC_50.分别用荧光法和MTT法测定μM和μM(两性霉素B)μM和μ分别为m（Miltefosine）。

欧共体_50.从荧光和比色方法获得的两种药物获得的值在表格中进行比较2.统计分析表明，两种方法之间没有差异。所有这些数据表明，使用这种新型pXG-mCherry的荧光分析莱山岛是一个有用的工具在体外药物筛选。

3.6。应用我们的结构来定位内部的蛋白质L.大调

像mCherry这样的荧光蛋白的主要应用之一是作为融合蛋白细胞定位的标记物莱山岛，我们进行了将mCherry蛋白融合到液化石油气N端的实验，得到了结构物pXG-mCherry34-LPG1（图6（a）).然后将该新载体和pXG-mCherry34转染到L.大调前鞭毛体pXG-mCherry34-表达L.大调显示荧光图案（未显示），与先前描述的pXG-mCherry12相同（图2.)此外，mCherry-LPG1转染子显示mCherry定位于高尔基体中靠近DAPI染色动粒体的区域（图1）6（b）)这种LPG1（mCherry）荧光模式与其他作者获得的结果明显相似[12.,21.,22.]．因此，新型PXG-MCHERRY构建体是用于局部利益蛋白质的有用工具。

4.讨论

虽然前循环形式莱山岛既不是感染性也不是细胞内阶段，其实施是低成本，容易，快速的测定可能是有价值的，可在分析新的候选人方面是有价值的。建议的方法可靠且价格便宜。

我们生成了两个新的载体(pXG-mCherry12和pXG-mCherry34)，它们含有多连接序列(多克隆位点，MCS)，使我们可以很容易地引入目标基因。此外，mCherry在细胞内产生荧光发射。进一步使用mCherry以及其他荧光报告基因(GFP和RFP)极大地促进了对潜在抗寄生虫药物的筛选和测试[2.,14.,23.–25.]．

事实上，我们的结果还表明，表达MCHerry的寄生虫是计算的有效工具在体外欧共体_50.不同的嗜血管药物的价值。通过本文获得的有趣数据支持这种使用。首先，MCHERRY克隆的生长曲线与WT寄生虫的生长曲线相同。其次，EC._50.最后，由于pXG-mCherry12和pXG-mCherry34可测量的红色荧光与细胞数量显著相关，这些新型载体提供了一种高灵敏度和特异性的工具来测量药物疗效，而不是使用方法b基于代谢活性，如MTT，更加繁琐和耗时。有趣的是，我们的结果与MTT法获得的数据一致。

虽然这是验证新药的第一步，但pXG-mCherry寄生虫可能代表，特别是在资源有限的实验室，一个很好的和便宜的替代药物筛选利什曼病。然而，评估药物活性在无鞭毛体中仍然是选择新的利什曼原虫药物的关键。因此，无鞭毛体的红色荧光强度可能是一种有用的技术来实现这一目标。我们证明,利什曼虫主要用我们新的McHery载体转染的细胞在无鞭毛体阶段保持红色荧光。这一结果也可以作为确定寄生虫负担的合适方法。

此外，在我们的新结构中引入多个克隆位点(MCS)便于插入感兴趣的基因，并允许检测它们的亚细胞位置。在这项工作中，我们使用LPG1基因验证我们的方法。我们的结果证实了Golgi设备中的LPG1本地化，如前所述由其他作者描述的[12.,21.,22.]．

本文并没有声称证明在核糖体位点水平上，偶体表达优于整合后的表达。我们的目标之一是产生一种新的和有用的工具，特别是蛋白质定位。我们发现寄生虫稳定地携带episomes载体(~80拷贝/细胞)，在我们的整个研究中，相应的荧光强度是相似的。此外，mCherry报告基因的偶体表达在几周内保持稳定，使我们能够进行大量的实验。

然而，由于表达mcherry的寄生虫的荧光强度随时间而降低莱山岛细胞在没有湿霉素压力下生长(补充图S4和S5)，我们认为这可能是有趣的莱山岛细胞稳定表达麦克里来自寄生虫基因组的基因(在核糖体位点水平的整合)。在我们的情况下，整合到基因组可能是有用的，但对实现我们的主要目标(蛋白质定位)不是必要的。

处理基因的重组和/或综合表达时，我们需要记住几个数据。综合报告者基因是延长生长测定的有价值的工具，例如体内研究表明，由于感兴趣的蛋白表达与选择标记无关。然而，我们的目标主要集中在在体外前鞭毛体的活动测试。Roy等人(2000)研究了荧光素酶报告基因的Episomal和稳定表达[26.]他们的研究表明，对于相同数量的寄生虫，LUC基因整合的寄生虫中的荧光素酶活性比该基因是上位体的一部分时要低。然而，呈现整合排列的细胞中的LUC-RNA表达水平接近于来自含有上位体载体的寄生虫的表达水平[26.]应考虑到外体质粒中的目标基因不能被中断或受到整合过程后可能出现的调控约束。最后，外体结构不会导致细胞基因组区域的重排或中断[27.]．

5.结论

本文提出了一种快速、简便、可靠的测试方法在体外新的药物和治疗利什曼病，也研究寄生虫的分子生物学特征。据我们所知，这是第一份将mCherry插入pXG并添加补充MCS的报告。最后，新的载体(pXG-mCherry)是评估蛋白质定位的显著工具。

相互竞争的利益

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

保罗·恩圭瓦（Paul A.Nguewa）和安德烈·瓦卡斯（Andrés Vacas）、康纳·萨格登（Conor Sugden）、斯卡·维拉斯科·罗德里格斯（Óscar Velasco Rodriguez）、米里亚姆·阿尔加拉贝尔·奥洛纳（Miriam Algarabel Olona）、何塞·佩尼亚·格雷罗（JoséPeñA-Guerrero）、埃丝特·拉雷亚（Esther Larrea）和西莉亚·费尔南德斯·鲁比奥（Celia Fernááández Rubio）构思并设计了这些完成所有实验工作。安德烈斯瓦卡斯进行统计分析。安德烈斯瓦卡斯准备数据。安德烈斯瓦卡斯、西莉亚·费尔南德斯·鲁比奥和保罗·A·恩圭瓦对手稿的格式做出了贡献。保罗·A·恩圭瓦和安德烈斯瓦卡斯整合了个人贡献。保罗·A·恩圭瓦发布了最终手稿。所有作者看了手稿。

致谢

L.大调promastigotes（Lv39c5）由Manuel Soto博士（西班牙马德里CSIC-UAM生物分子中心Severo Ochoa）提供。pTREX McHery由Manuel Fresno博士（西班牙马德里自治大学生物分子系）赠送。pXG HYG莱山岛vector是Rosa M.Reguera博士（西班牙莱昂大学生物科学系）为流式细胞仪数据采集和分析提供的一份礼物。作者感谢María Paz López女士（西班牙多诺西亚圣塞巴斯蒂安的国际医学基金会）为流式细胞仪数据采集和分析所做的工作。这项工作由罗维拉基金会资助(http://www.roviralta.org)、Fundación Caja Navarra和政府of Navarre I+D (0011-1383-2016-13-PI037利什曼病)。

补充材料

参考文献

1. 世界卫生组织,控制利什曼家族，世卫组织技术报告系列第9492010号，http://www.who.int/leishmaniasis/resources/Leishmaniasis_worldwide_epidemiological_and_drug_access_update.pdf．
2. P.Vacchina和M.A.Morales，“使用莱山岛原鞭毛体稳定表达mCherry蛋白抗菌药物和化疗，第58卷，第2期3，第1825-1828页，2014。浏览：出版商网站|谷歌学者
3. L.A.Dutra，L.de Almeida，T.G.Passalacqua等人，“新型合成呋喃和苯并呋喃衍生物的利什曼原虫活性，”抗菌药物和化疗，第58卷，第8期，第4837-4847页，2014年。浏览：出版商网站|谷歌学者
4. A.Dutta、S.Bandyopadhyay、C.Mandal和M.Chatterjee，“用于筛选印度内脏利什曼病抗肌毒力场分离株的改良MTT法的开发，”寄生虫学国际，第54卷，第2期，第119-122页，2005年。浏览：出版商网站|谷歌学者
5. E. Durieu，E.Prina，O.Leclercq等，“从药物筛查到靶向解卷积：使用LeishMania酪蛋白激酶1同种型2的基于目标的药物发现管道，以鉴定具有抗碱活动的化合物，”抗菌药物和化疗，第60卷，第5期，第2822-2833页，2016年。浏览：出版商网站|谷歌学者
6. M.J.Corral、E.González、M.Cuquerella和J.M.Alunda，“96孔微孔板分析法的改进，用于评估细胞生长和细胞生长抑制。”莱山岛Alamar蓝。”微生物学方法杂志，第94卷，第2期，第111-116页，2013年。浏览：出版商网站|谷歌学者
7. E. Calvo-Álvarez，R.Álvarez-velilla，C.Fernández-Prada，R.Balaña-Fouce和R. M. Reguera，“锥虫蛋白菌氏菌（Rp）Sep：BioMaging Research最近进展，”今天的药物发现，卷。20，没有。1，pp。114-121,2015。浏览：出版商网站|谷歌学者
8. L.Paloque，N.Vidal，M.Casanova等人，“一种用于利什曼原虫药物筛选的新的、快速和灵敏的生物发光分析法，”微生物学方法杂志第95卷第1期3，页320-323,2013。浏览：出版商网站|谷歌学者
9. E. Calvo-Álvarez, N. a . Guerrero, R. Álvarez-Velilla等，“对一种稳定表达mcherry荧光蛋白的利什曼原虫主要菌株的评估，用于体外和体内研究潜在的抗皮肤利什曼病药物和疫苗”，PLoS被忽视的热带病，第6卷，第11期，文章编号e1927，2012年。浏览：出版商网站|谷歌学者
10. A. Bolhassani, T. Taheri, Y. Taslimi等人，“荧光莱山岛种:绿色荧光蛋白稳定表达的发展及其应用在体外和体内研究，”实验寄生虫学，第127卷，第127期3，第637-645页，2011。浏览：出版商网站|谷歌学者
11. N. Singh，M. Kumar和R. K. Singh，“Leishmaniaisis：现有药物的现状和新的潜在药物目标”，亚太地区热带医学杂志，第5卷，第6期，第485-497页，2012年。浏览：出版商网站|谷歌学者
12. 张凯、T.巴伦、S.J.图尔科和S.M.贝弗利，“癌症的LPG1基因家族”利什曼虫主要,”分子和生物化学寄生虫学，第136卷，第1期，第11-23页，2004年。浏览：出版商网站|谷歌学者
13. N. C. Shaner, P. A. Steinbach，和R. Y. Tsien，《选择荧光蛋白指南》，自然方法，第2卷，第2期12，页905-909,2005。浏览：出版商网站|谷歌学者
14. M. N. Rocha, C. M. Corrêa, M. N. Melo等人，“一种替代的体外药物筛选试验使用Leishmania Amazonensis.用红色荧光蛋白转染，“诊断微生物学与传染病，第75卷，第3期，第282-291页，2013年。浏览：出版商网站|谷歌学者
15. M.W.Davis，“ApE-质粒编辑”，万维网，2008年，http://www.biology.utah.edu/jorgensen/wayned/ape.．浏览：谷歌学者
16. A. Cruz, C. M. Coburn，和S. M. Beverley，“创造无效突变体的双重靶向基因替换”，美国国家科学院的诉讼程序第88期16，第7170-7174页，1991。浏览：出版商网站|谷歌学者
17. R.A.Neal和S.L.Croft，“一种用于测定化合物抗细胞内无鞭毛体形式病毒活性的体外系统杜氏利什曼原虫,”抗菌化疗杂志，第14卷，第5期，第463-475页，1984年。浏览：出版商网站|谷歌学者
18. D. L. Sacks, S. Hieny，和A. Sher，“细胞表面碳水化合物的鉴定和抗原变化之间的非感染和感染发育阶段利什曼虫主要前鞭毛体，”免疫学杂志，卷。135，不。1，pp。564-569,1985。浏览：谷歌学者
19. C. Fernández-Rubio, D. Campbell, A. Vacas等，“新型甲基硒酰亚胺基氨基甲酸酯的利什曼反应活性”，抗菌药物和化疗，第59卷，第9期，第5705-5713页，2015年。浏览：出版商网站|谷歌学者
20. GraphPad Prism.，GraphPad软件，美国加利福尼亚州圣地亚哥，1994年。
21. D. Sean Ha，J.K.Schwarz，S. J.Curco和S. M. Beverley，“绿色荧光蛋白为转染的标记物莱山岛,”分子和生物化学寄生虫学第77期1，页57-64,1996。浏览：出版商网站|谷歌学者
22. M. M. Sansom, J. E. Ralton, M. F. Sernee等人，"高尔基定位的NTPDase1利什曼虫主要是脂磷酸聚糖延伸和正常病变发展所必需的，而分泌的NTPDase2则是毒性所必需的。”PLoS被忽视的热带病，第8卷，第2期12、Article ID e3402, 2014。浏览：出版商网站|谷歌学者
23. C.Changsen、S.G.Franzblau和P.Palittapongarnpim，“利用乙酰酰胺酶启动子改进基于绿色荧光蛋白报告基因的抗结核化合物微孔板筛选，”抗菌药物和化疗，第47卷，第12期，第3682-3687页，2003年。浏览：出版商网站|谷歌学者
24. M.Marschall、M.Freitag、S.Weiler、G.Sorg和T.Stamminger，“表达人巨细胞病毒的重组绿色荧光蛋白作为筛选抗病毒药物的工具，”抗菌药物和化疗，第44卷，第6期，1588-1597页，2000年。浏览：出版商网站|谷歌学者
25. S.W.Kamau、F.Grimm和A.B.Hehl，“绿色荧光蛋白的表达作为体外抗利什曼原虫化合物作用的标记物，”抗菌药物和化疗第45卷第5期12，页3654-3656,2001。浏览：出版商网站|谷歌学者
26. G. Roy，C. Dumas，D.Sereno等，“荧光素报道基因的蜕皮和稳定表达进行量化莱山岛巨噬细胞和动物模型中的spp感染，”分子和生物化学寄生虫学，卷。110，没有。2，pp。195-206,2000。浏览：出版商网站|谷歌学者
27. K. Van craenbroeck, P. Vanhoenacker，和G. Haegeman，“哺乳动物细胞中基因表达的Episomal载体”，欧洲生物化学杂志号，第267卷。18，页5665-5678,2000。浏览：出版商网站|谷歌学者

版权

版权所有©2017 Andrés Vacas et al。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，前提是原作被正确引用。