多功能Thioredoxin-Like蛋白质从肠道寄生线虫ratti类圆线虫属和鞭虫是影响粘膜内稳态

文摘

细胞氧化还原状态是重要的多种功能的规定,对于维持细胞内稳态和抗氧化防御。在排泄/分泌(E / S)的产品ratti类圆线虫属和鞭虫是硫氧还蛋白序列(硫氧还蛋白)和Trx-like蛋白质(Trx-lp)被确定。的抗氧化剂Trx-lp及其交互作用与寄生虫的粘膜栖息地,美国ratti和t是Trx-lps克隆和重组表达。主要的抗氧化活性被减少胰岛素和IgM保证。进一步分析应用在体外粘膜3 d型文化模型显示Trx-lps能够绑定到单核细胞的分泌和肠道上皮细胞和诱导时间释放肿瘤坏死因子等细胞因子-α、il - 22生成和TSLP。此外,氧化还原蛋白还具有单核细胞的趋化现象的活动THP-1细胞和促进伤口愈合上皮活动。这些结果证实parasite-secreted Trx-lps多功能蛋白质,可以影响宿主肠道粘膜。

1。介绍

肠道线虫寄生普遍存在,影响人类和脊椎动物。在世界范围内,超过三分之一的人类感染寄生虫(1)的100 - 200人感染类圆线虫属(2,3),大约8亿鞭虫(4]。调查线虫ratti类圆线虫属和鞭虫是非常密切相关的人类病原同系物吗类圆线虫属stercoralis和鞭虫trichiura(5,6]。

与炎症免疫反应和主要微生物,寄生虫的免疫反应主要是那么激烈和高度管制7]。调节宿主免疫反应的报道t是卵子是有益的衰减和炎症性肠病(IBD),如克罗恩病和溃疡性结肠炎(8,9]。寄生虫释放多个排泄/分泌(E / S)产品,使他们能够建立、生存和繁殖的宿主成功(10,11]。在的情况下美国ratti和t是,这些E / S产品包括抗氧化蛋白质如硫氧还蛋白(硫氧还蛋白),热休克蛋白,以及众多蛋白酶和蛋白酶抑制剂,galectins,直向同源的宿主细胞因子(10,12- - - - - -16]。硫氧还蛋白也报告了E / S产品多种寄生虫(17- - - - - -20.]。最近,这些E / S蛋白中也发现了细胞外囊泡从寄生虫21]。

硫氧还蛋白或硫氧还蛋白系统一般从古生菌普遍存在的人类硫氧还蛋白组成,硫氧还蛋白还原酶,NADPH [22]。在此,硫氧还蛋白减少NADPH-dependent地硫氧还蛋白还原酶(23]。一般来说,硫氧还蛋白超家族成员控制thiol-based氧化还原控制,操作蛋白质二硫氧化还原酶和保护细胞的胞质蛋白对聚合(24]。redox-regulating活动对DNA复制很重要,维护细胞氧化还原状态,和,因此,细胞内稳态和抗氧化防御22,25]。此外,硫氧还蛋白是多个细胞通路的一部分(26)和调节转录因子的活动能力,抑制细胞凋亡,从高能氧自由基,保护和再生变性蛋白质和至关重要的信号转导通过硫醇氧化还原控制等更具体的过程呈现抗原(22,23,26- - - - - -28]。没有信号肽,硫氧还蛋白分泌的模由各种细胞分泌途径(29日,30.]。

硫氧还蛋白的大量细胞外活动包括抗炎和抗凋亡,因此cytoprotective效应(31日- - - - - -33]。感兴趣的、多功能原核的硫氧还蛋白,它显示不相关属性,也就是说,抗氧化活性和促进DNA复制,被描述为兼职蛋白质(34- - - - - -36]。E / S产品的类圆线虫属和其他多种寄生虫大量多功能蛋白质已发现兼职酶烯醇酶和glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(10,13,37- - - - - -39]。

而硫氧还蛋白的特点,所知甚少的功能Trx-lp [26]。Trx-lp,硫氧还蛋白家族的一员,是一个融合蛋白组成的经典Trx域(WCGPC) n端和c端proteasome-interacting硫氧还蛋白(精髓)领域,原名DUF1000(蛋白质数据库的家庭,http://pfam.xfam.org/family/PF06201)。它比经典的硫氧还蛋白(12 kDa),所有物种中高度保守的(23,25]。硫氧还蛋白的蛋白质总科在各种原生动物寄生虫包括已报告疟原虫、锥虫属和弓形虫(40- - - - - -43)和吸虫Clonorchis sinensis(44]。除了thiol-based氧化还原控制真核Trx-lps也参与信号传导过程某些酶的辅因子,调节特定信号蛋白(45,46]。例如,人类Trx-related蛋白质(TRP32),称为TXNL-1,保护细胞免受葡萄糖deprivation-induced细胞毒性和参与激活凋亡PI3K / Akt信号以及PTEN(磷酸酶和tensin同系物删除10号染色体上)抑制(47,48]。另一个例子是硫氧还蛋白域包含17 (TXNDC17),也称为Trx-related蛋白14 kDa (TRP14) STAT-3-dependent和负责人类大肠癌细胞的耐药性。TRP14还显示,像Trx1, S-nitrosylase活动而且能够控制肿瘤坏死因子-α/ NF -κB信号通路(49- - - - - -51]。此外,PTEN也是一个人类的硫氧还蛋白和其他的互动伙伴TNF -硫氧还蛋白控制α/ NF -κB信号通路以及[52,53]。小说thioredoxin-related TMX4跨膜蛋白是一种跨膜蛋白与其Trx-like域内ER可能发挥作用在蛋白质的正确折叠ER由于其还原酶功能54]。

Trx以来报道作为白细胞的化学引诱物,并诱导细胞因子(31日我们想检查如果SrTrx-lp对单核细胞的细胞也有类似的影响。

在目前的研究中我们克隆和特征两个Trx-lps和一些功能活动包括趋化现象的调查活动,促进伤口愈合过程的能力在肠道上皮细胞(IEC) Caco-2模型,及其参与细胞因子释放在一个三维(3 d)细胞培养模型。

2。材料和方法

2.1。寄生虫

的美国ratti生命周期保持在我们的实验室报告(13,15]。动物实验被批准,按照指南进行的动物保护委员会的汉堡(g21131/591 - 00.33)。生命周期的维护使用Wistar鼠是串行通道和描述的发展阶段孤立14]。t是阶段得到从Ovamed(德国汉堡)。

2.2。体的制备提取

美国ratti和t是从新鲜提取准备收获生命阶段(之前所述13,15]。

2.3。DNA测序和生物信息学分析

PCR产品和质粒测序的双脱氧法终止的桑格eurofinsgenomics.eu执行的方法。的同源性搜索NCBI Blast程序使用(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。此外,生物信息学分析专家蛋白质分析系统(ExPASy)蛋白质组学服务器瑞士生物信息学研究所(http://expasy.org/tools/)使用。获得的保守域Trx-lps蛋白质数据库(包含)的美国家庭服务器(http://pfam.xfam.org/family/PF06201)被用来代表由多个蛋白质序列比对和隐马尔可夫模型(摘要)。多重序列比对程序进行的CLUSTAL_W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)欧洲生物信息学研究所的欧洲分子生物学实验室的一部分(EMBL-EBI)。

2.4。质谱分析

SrTrx-lp和TsTrx-lp sds - page乐队被切除,切成细条,转移到超小型电子管和凝胶消化所述执行其他地区(57]。简而言之,凝胶块使退色使用30%乙腈(ACN), 0.07 NH₄HCO₃,减少20毫米二硫苏糖醇与丙烯酰胺烷基化1%,并使用100% ACN脱水57]。ACN摘除和凝胶块干使用0.1 NH真空离心和水化₄HCO₃包含0.5μ克胰蛋白酶(Promega,曼海姆,德国)。足够数量的0.1 NH₄HCO₃添加的凝胶块完全消化了,一夜之间37°C。包含上层清液的肽被转移到新的超小型电子管和ACN的凝胶块提取50%,0.1%三氟乙酸0.1 NH紧随其后₄HCO₃和雨。样品在真空离心、干燥resuspended在ACN 5%和5%甲酸,脱盐使用C₁₈StageTips [58),又干,resuspended甲酸在ACN的5%和5%。反相色谱的房子制造分析列。使用100μm内径熔融石英毛细管,喷雾提示生成与P2000激光拉(萨特仪器,诺瓦托、钙、美国)和挤满了5μReproSil-Pur 120 C₁₈aq粒子(Ammerbuch-Entringen Maisch博士、德国)。肽是直接加载在分析柱使用nanoflow UHPLC系统(1000年EASY-nLC热费希尔科学、不来梅、德国)的流量1μL / min溶剂C和0.1%甲酸(水)。肽是筛选了应用60分钟线性梯度从100%与5% DMSO溶剂(水(59),0.1%甲酸),65%的溶剂,35%溶剂B (ACN 5% DMSO溶液,0.1%甲酸)400 nL /分钟的流量。在正离子模式下洗脱肽被电离为1.6 kV nanospray离子源的Orbitrap Velos质谱仪(热费希尔科学、不来梅、德国)。调查扫描(m / z400年至1200年)进行Orbitrap分析仪在分辨率为30000紧随其后的10个最丰富的离子碎片线性离子阱的碰撞诱导解离。动态的排斥与一个排除列表的大小设置为30秒500。热.raw文件进行了分析使用Maxquant(1.5.2.8版)使用以下设置:蛋白质氨基乙酰化和氧化蛋氨酸被设置为变量的修改和丙酰胺半胱氨酸是设置为固定的修改;酶的特异性将胰蛋白酶和两个错过乳沟网站被允许。对数据库数据搜索组成的美国ratti和t是从12/01/2014条目从Uniprot / TrEMBL(版本,12462项),以及常见的污染物。错误发现率设置为1%。

2.5。克隆、表达和纯化的重组Trx-lps

美国ratti和t是像之前描述的那样RNA分离得到成年雌性寄生(15)和互补脱氧核糖核酸合成通过第一链cDNA工具包来自新英格兰生物学实验室®公司根据制造商的指示。正向和反向引物生成使用Clontech提供的在线工具(http://bioinfo.clontech.com/infusion/)(TsTrx-lp:转发:AAGGTCGTCATATGATGGCT ATAAAGGAGATAA;反向:TCCTCGAGAATTCCTAATGAGCTTCTCCCTT;SrTrx-lp:转发:AAGGTCGTCATATGATGGCTATAAAGGAGATAA;反向:TCCTCGAGAATTCCTAATGAGCTTCTCCCTT)。碎片被放大从Clontech使用输液®高清PCR克隆工具根据制造商的指示和Phusion高保真dna聚合酶从热科学(美国沃尔瑟姆)。PCR Trx-lp片段美国ratti和t是被克隆到pJC45向量(60)和IBA 3 +向量,变成了大肠杆菌的细胞(美国Clontech)和测序(欧陆坊MWG)。

的美国ratti和t是Trx-lps表示在脂多糖(LPS)免费大肠杆菌应变ClearColi®BL21 (DE3)(强光油灯简化基因组学),不触发人类细胞内毒素的反应,Luria-Bertani中包含100μ克/毫升氨苄青霉素。他融合蛋白的表达被异丙基-诱导β-D-thiogalactopyranoside(最终IPTG浓度1毫米)和由anhydrotetracycline Strep-tag融合蛋白的表达(出去,200年最终浓度μg / L), 5 h在37°C。细菌细胞是通过离心收集(6000×g) 15分钟,保持在−20°C到使用。利用Ni重组蛋白在纯化^{2 +}亲和色谱法(试剂盒、希尔登,德国)或Strep-Tactin®Superflow +(试剂盒、德国)根据制造商的指示。咪唑或desthiobiotin一夜之间被透析使用磷酸盐(PBS, pH值7.4)。尽管endotoxin-free大肠杆菌应变有限合伙人抑制剂使用多粘菌素B (30μg / mL)被添加到所有缓冲区使用。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)是用于验证和纯度的蛋白表达,可视化的考马斯亮蓝g - 250染色法。蛋白质浓度由布拉德福德量化分析。此外,洗脱分析半干的免疫印迹。sds - page和以下转移到硝化纤维膜后,膜被孵化的anti-his6-peroxidase(2)(鼠单克隆;1:5000;罗氏公司生命科学,德国曼海姆)在一夜之间在4°C。

2.6。功能活性测定

2.6.1。减少胰岛素

根据Holmgren的方法(61年)(1979年)以及Luthman Holmgren [62年二硫化)(1982),减少活动以减少胰岛素(61年,62年]。在该测试中,样品的浊度测量,这是由沉淀引起的胰岛素减少。吸光度下降为650 nm。在反应中,这些SrTrx-lp被德勤反复再生。这里,活跃Trx-lp的再生速度比直接还原德勤的胰岛素。最初,1.6毫米胰岛素(牛胰腺Sigma-Aldrich,汉堡,德国)被暂停准备50毫克的胰岛素在2.5毫升100毫米磷酸钾缓冲(pH值6.5)反应的方法。在这里,第一次调整pH值3与1 M盐酸溶液完全溶解的蛋白质和pH值调整到6.5 1 M氢氧化钠。解决方案与dH补充₂O 5毫升的体积。825年之后,大师的混合μL 1.6毫米胰岛素(160μ)和4675米决赛卷μL PE(100毫米磷酸钾,2毫米EDTA, pH值6.5)缓冲区。SrTrx-lp 1的浓度进行了测试μ米(30μ2.5 g / mL)μ米(75μg / mL), 5μ米(150μg / mL)。在一个1分钟的间隔的时间40分钟,减少胰岛素的SrTrx-lp测量。作为一个消极的控制,使用相同的反应方法没有氧化还原调控的蛋白质。SrTrx-lp被PE-buffer所取代。相对特定的酶活性是由下列公式计算:/毫克蛋白浓度在反应中混合。

2.6.2。IgM减少

据的方法沃尔曼et al .(1988),给人以Trx-lp从美国ratti或t是降低了100毫米德勤在室温下1 h (RT)和透析80毫米玫瑰和10毫米EDTA缓冲区1 h在4°C将德勤[63年]。透析缓冲也用作反应缓冲区。缓冲和1.7μM IgM (PierceTM鼠标IgM同形像控制,热科学、捷克共和国)和0.5μL, 1μL, 5μL rt,一夜之间减少Trx-lp解反应的蛋白大小测定sds - page分析nonreducing条件下丙烯酰胺梯度(5 - 12%)。硝酸银染色用于可视化蛋白质(63年]。

2.7。细胞

2.7.1。外周血细胞的准备

同意制度指导健康志愿者作为来源外周血单核细胞(跨国公司)和多形核的细胞(中性粒细胞)纯化从静脉血液样本在柠檬酸钠管(收集)。首先,红细胞沉淀从实际上添加等量的血液样本6%羟乙基淀粉(HEAS-steril®,费森尤斯公司,弗里德伯格,德国)。跨国公司从中性粒细胞分离之前报道了用两级组成的密度梯度密度离心Mono-Poly解决媒体(1.114 g / ML;议员生物医学,斯德哥尔摩,瑞典)和Lymphoflot (1.077 g / mL;Bio-Rad, Dreieich,德国)14]。跨国公司间期和中性粒细胞相间收集剩下的丢弃。细胞与PBS小心清洗,紧随其后的是一个离心步骤10分钟的1800 rpm。这一步是可选的重复一次,如果有太多的血小板。而跨国公司被添加到THP-1媒体,中性粒细胞resuspended在哈佛商学院都在5×10的浓度⁵细胞/毫升和存储在冰直到进一步使用。

2.7.2。三维Coculture

分析的免疫效果SrTrx-lp TsTrx-lp,重组蛋白作为刺激在一个3 d-coculture模型,由人类肠道上皮细胞和树突状细胞(dc),来源于单核细胞的THP-1细胞,生长在一个模拟的胶原蛋白支架在活的有机体内自然的微环境(64年]。

人类肠道上皮细胞,Caco-2细胞,生长在DMEM媒体(10% FCS, 1%不重要的氨基酸,1%笔/喉炎的症状;Liefer-Co),直到达成了70 - 80%的密度和播种12-well盘子ThinCerts™TC插入(他一一BioOne)紧随其后的200年μL胶原蛋白(维尔茨堡大学医院)插入。之前添加Caco-2细胞,胶原蛋白是孵化1 h凝胶的37°C。分离Caco-2细胞从瓶细胞使胰蛋白酶化转移前10⁵细胞/到collagen-layered插入和孵化在37°C和5%为2 h有限公司₂让他们坚持的胶原蛋白。后来,井提出了DMEM媒体。至少14天的细胞生长,直到单层成立。分化DCs, THP-1细胞被洗两次在PBS和播种无血清RPMI 1640媒体补充il - 4(1000国际单位/毫升;Peprotech,汉堡,德国)和gm - csf(1000国际单位/毫升;Peprotech)和种植(7 - 10天65年]。随后的一代成熟dc 10被染色⁵洗培养细胞与藻红蛋白(PE)共轭单克隆anti-CD86 (B7-2)抗体(鼠标反CD86-PE-conjugated抗体;美国圣地亚哥正生物科学,PE-conjugated同形像控制;PharMingen、莱顿、荷兰)分析了流式细胞术(CellQuestPro;BD)(数据未显示)66年]。适当发展细胞类型后,Caco-2-collagen插入被转移到增长DCs的井,提出了DMEM媒体(10% FCS, 1%不重要的氨基酸,1%笔/喉炎的症状)。

添加了Trx-lps刺激(5μ10克,μg, 25μg / mL),而UFM-1激活蛋白UBA-5 (25μ从nonparasitic线虫g / mL)秀丽隐杆线虫作为消极的控制。UBA-5是克隆和表达为我们组发表的67年]。进一步的控制措施,进行与细菌细胞壁组件有限合伙人(1μg / mL;Sigma-Aldrich Taufkirchen、德国)和lipoteichoic酸(LTA, 0.1μg / mL;Sigma-Aldrich Taufkirchen)分析潜在的内毒素污染和两个反应进行比较。虫提取物t是作为积极的控制响应。24小时后上层清液被,48小时、72小时和储存在−20°C到进一步使用。

2.8。细胞因子酶联免疫吸附试验(ELISA)

细胞因子的检测TNF -α,il - 10、il - 22生成和TSLP在细胞上清液,人类ELISA Ready-SET-Go !美国从eBioscience工具包(圣地亚哥)使用根据制造商的指示。发现,il - 10的灵敏度2 pg / mL, il - 22生成和TSLP 8 pg / mL的敏感性,和TNF -α4 pg / mL的敏感性。

2.9。流式细胞术

测量的亲和力美国ratti和t是Trx-lps特定细胞类型,纯化蛋白质标记使用Alexa萤石®647蛋白质标记工具微尺度(A30009)表达载体(美国俄勒冈州)根据制造商的指示。的亲和力Trx-lps单核细胞,淋巴细胞,并从外周血粒细胞,以及细胞系THP-1细胞(未分化和分化)和Caco-2细胞,进行了测试。大约2×10⁵每个反应细胞被使用。荧光标记的蛋白质在四种不同浓度(0.1测试μg和0.2μg(数据未发表)和0.4μg和0.6μ克)。BSA贴上Alexa萤石®647年作为负控制。每个样本,由SrTrx-lp或TsTrx-lp和被测试的细胞类型,200年被带到一个卷μL PBS和孵化了30分钟。实验设置了重复测试各种温度。孵化发生在RT(数据未显示)和37°C。孵化后,样品被洗两次,150年resuspendedμL PBS,通过流式细胞仪分析FACScalibur血细胞计数器(BD生物科学),与10000年收集的事件的数量。作进一步鉴定结合特异性的细胞preincubated 0.1μg和0.2μ0.4 g(数据未显示)μg和0.6μg标记蛋白质的30分钟前添加相应的标记蛋白质。CellQuestPro数据进行了分析。

2.10。趋化性试验

评估人类单核细胞的趋化活性THP-1细胞,Boyden钱伯斯被用作前面描述的(68年,69年]。德勤(100毫米)减少Trx-lps美国ratti和t是在测试浓度的3 ng, 30 ng, 300 ng,和1μg每100年μl .消极的试验进行控制(随机迁移)如趋化性缓冲(包含CaCl PBS₂,MgCl₂和BSA)和THP-1媒体(RPMI含有玫瑰和10% FCS)积极控制有限合伙人在100 ng,因为LPS诱导单核细胞的迁移细胞(70年]。THP-1细胞(2×10⁵)被允许通过迁移polyvinyl-pyrrolidone-free聚碳酸酯过滤器(孔隙大小:3μm;图像比对、图宾根、德国)在90分钟37°C和5%的公司₂。之后,迁移的细胞数用倒置的蔡司显微镜(Axiovert 25)。在三个独立的实验中进行了一式三份。

2.11。伤口愈合

对Caco-2细胞和上皮细胞迁移进行监控的能力Trx-lps改善伤口愈合过程中,我们使用了CytoSelect 24-Well伤口愈合试验(细胞生物学实验室,Inc .)根据制造商的指示。通过CytoSelect伤口愈合伤口插入一个0.9毫米字段生成。500年μL的Caco-2细胞悬液(包含0.5×10⁶插入后细胞)被添加到每个公司接触井的底部。隔夜孵化,单层成立后,插入删除,细胞被洗,不同刺激补充道。我们使用两个Trx-lps,从美国ratti和t是浓度的3 ng 30 ng, 300 ng, 1μ10克,μg, 25μ每500克μl .积极控制人类表皮生长因子(EGF;0.5 ng 5 ng, 10 ng, 15 ng, 25 ng)包括为了获得适当的浓度最大的伤口愈合效果。消极的控制细胞增加了媒体和有限合伙人。倒置的数码显微镜(evo™FL热费希尔科学)通过使用先进的显微组织观察(4 x放大)。这些细胞被培养4天,每24小时一个照片拍摄和关闭计算百分比。

2.12。统计分析

统计组之间的差异分析t以及独立样本或Mann-WhitneyU测试。作为温和的证据意义和意义的强有力的证据。

3所示。结果

3.1。识别的全长cdna编码美国ratti和t是Trx-lps、克隆和序列分析

SrTrx-lp由集群SR00399 [13),被大量发现美国rattiE / S寄生的产物美国ratti女性。部分序列被确定为硫氧还蛋白家族蛋白和被用来通过PCR获得全长cDNA序列。进一步的全长cDNA序列t是假设蛋白质M513(加入。克隆并鉴定为Trx-lp KFD58615.1)。蛋白质序列的重组表达美国ratti和t是Trx-lps被质谱验证。

保守域的Trx-lps肠道寄生虫美国ratti和t是确定了家庭的蛋白质数据库(包含)。无论是Trx-lp从美国ratti还是Trx-lp从t是包含信号肽。两种蛋白有一个氨基硫氧还蛋白域包含活动方主题CXXC (CGPC)和c端髓(thioredoxin-like proteasome-interacting域)域。

氨基酸序列的排列不同生物显示较低程度的不同物种之间的身份。Trx-lps之间从美国ratti和t是身份的程度(39%)没有高达Trx-lps之间美国ratti和马来丝虫(56%)。高度之间的身份被揭露鞭虫spp。Trx-lps(94%),类似于序列美国ratti和美国stercoralis(99.9%)(数据未显示)。比较其他寄生虫蛋白质序列一致,相似之处美国ratti和t是Trx-lps变化在35%和56%之间。redox-regulating蛋白之间的比较美国ratti和智人显示,43%的身份。

寄生虫序列对齐的份额,除了吸虫曼氏裂体吸虫催化部位序列(CGPC)与人类Trx-lp活性位点的序列。总有两个由两种氨基酸半胱氨酸,甘氨酸和脯氨酸。而不是一个甘氨酸,美国曼催化部位有精氨酸(R)(图序列1)。两个半胱氨酸负责氧化还原调控在不同的细胞过程。的预测结构SrTrx-lp作为模范地如图2。两个寄生虫Trx-lps Trx-like域(左)以及髓域(右)(图2;Phyre2:(61年])。

3.2。重组表达和纯化美国ratti和t是Trx-lp

SrTrx-lp TsTrx-lp endotoxin-free表达的重组大肠杆菌像strep-tagged His-tagged蛋白质和蛋白质。纯化His-tagged蛋白质的数量,然而,高于纯化strep-tagged蛋白质的数量。因此,与strep-tagged蛋白质初步测试后,我们进一步与His-tagged蛋白质。寄生虫蛋白质都验证了免疫印迹使用anti-strep anti-his抗体(图S1)和质谱分析。

3.3。功能活性测定

3.3.1。减少蛋白质的

(1)减少胰岛素。测量SrTrx-lp机能活动的使用胰岛素,胰岛素自由的降水β进行攻击spectrophotometrically测定波长650 nm根据霍蒙格林(1979)以及Luthman霍蒙格林(1982)(61年,62年]。浓度为1μ米(30μ2.5 g / mL)μ米(75μg / mL), 5μ米(150μg / mL)使用SrTrx-lp和测量时间的策划与沉淀的速率,约为0.064/分钟的最高浓度。SrTrx-lp减少胰岛素的相对具体的活动1556.67和再生的德勤,负控制和SrTrx-lp只有轻微的降水的最低浓度胰岛素可以测量(图3)。

(2)减少IgM。Pentameric IgM包括五个M J免疫球蛋白联合的链。其分子量约为950 kDa和它包含26个跨链二硫桥Trx-lp潜在的硫氧还蛋白基质,因此。另外减少胰岛素活性测定,dithiol-disulfide氧化还原酶活性的分析了Trx-lps IgM减少测试根据沃尔曼et al。(1988)给人以63年]。IgM可检测250 kDa。积极控制IgM降低了100毫米的德勤乐队70 kDa(重链IgM)和25 kDa(轻链IgM)发生(图4第三车道)。只有让IgM SrTrx-lp量最高,五个主要乐队被确定(图4(一),巷7)。除了乐队在70 kDa 25 kDa,类似与德勤IgM的减少,和乐队在250 kDa,现在乐队在大约30 kDa,代表单体的美国rattiTrx-lp和60 kDa代表二聚的美国rattiTrx-lp,测定。一个小乐队也在45 kDa。几乎相似的蛋白质乐队曾被观察到t是分析了Trx-lp(图4 (b));然而,t是Trx-lp也在低和中间浓度导致IgM的减少。此外,乐队在140 kDa (IgM的重链二聚体)在所有主要TsTrx-lp剂量(图4 (b))。

3.4。线虫Trx-lps与宿主免疫细胞互动

3.4.1。绑定到粘膜和免疫细胞

绑定能力其他免疫细胞以及粘膜Caco-2了细胞流式细胞仪(图5)。单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞以及Caco-2细胞,THP-1细胞,THP-1-derived树突状细胞(dc)暴露在Alexa Flour-labeled Trx-lps。实验显示相当大的微分绑定各种细胞活动。因此,SrTrx-lp(图5(一个))以及TsTrx-lp(图5 (b)所示)蛋白强烈束缚单核细胞的细胞外周单核细胞的剂量依赖性的方式(SrTrx-lp: MFI 175 - 185;TsTrx-lp: MFI 19-60)、THP-1细胞系(SrTrx-lp: MFI 36 - 108;TsTrx-lp: MFI 38 - 133),生成的DCs (SrTrx-lp: MFI 85 - 170)。SrTrx-lp和较低程度TsTrx-lp也必将Caco-2细胞(SrTrx-lp: MFI 45-52;TsTrx-lp: MFI 14-42)和有限的亲和力中性粒细胞(SrTrx-lp: MFI 15 - 16;TsTrx-lp: MFI 17-50)和淋巴细胞(SrTrx-lp: MFI 9 - 11;TsTrx-lp: MFI - 20)。

为了验证THP-1细胞的分化DCs il - 4和gm - csf anti-CD86抗体。CD86表面局部差异化DCs但THP-1细胞(数据未显示)。

3.4.2。线虫Trx-lps-Induced肠3 d-cultures Epithelial-Dendritic细胞细胞因子的状况

的美国ratti和t是Trx-lps进行诱导细胞因子的释放的能力在人类3 d-cocultures肠道上皮细胞(IEC)和DCs。释放的炎症(TNF -α),抗炎(il - 10),相关细胞因子(il - 22生成时,TSLP)进行了分析。在初步实验,优化有限合伙人和LTA测定的浓度为0.5μ和0.1克/毫升μ克/毫升(数据没有显示)。200年µ克/毫升t是提取物被用作积极控制和细胞培养基作为负控制(图6(一))。浓度的Trx-lps测试3 ng, 30 ng, 300 ng, 1μ10克,μg, 25μ克每毫升(每个)。减少(减少通过德勤)和氧化状态(新鲜纯化蛋白,只有部分减少,见减少IgM) Trx-lps不起作用的细胞因子反应(数据未显示)。这个观察表明,site-independent引发免疫反应的蛋白质可能是活跃。10μg和25μ克蠕虫Trx-lps都是最具代表性的最高浓度诱导细胞因子释放。

Cocultured细胞暴露于t是(Ts)提取显示,特别是增强生产的il - 10、il - 22生成后48 h和72 h后il - 10的更高版本,而促炎细胞因子TNF -α是表达下调(图6(一))。SrTrx——以及TsTrx-lp诱导释放促炎TNF -最初稍明显α在24小时(),其次是增加产量的il - 22生成和TSLP 48 h后孵化()。为了应对暴露cocultures Trx-lps尤其是相关细胞因子il - 22生成产48 h和72 h后()。在一个25的浓度μTsTrx-lp g, TNF -α48小时后释放增加,甚至占据了il - 22生成生产。72 h后,il - 22生成和TSLP生产主导整个TNF -α生产。10μ克/毫升Trx-lps似乎更有效的对细胞因子释放25μ克蛋白质之间的统计学意义只有IL-22-inducing SrTrx-lp浓度后48 h ()(图6 (b))。

3.5。SrTrx / TsTrx-lp显示趋化单核细胞的活动

人类的硫氧还蛋白是除了中性粒细胞单核细胞和T淋巴细胞趋化现象的31日]。因此,我们调查了寄生虫Trx-lps的单核细胞的趋化现象的活动利用Boyden钱伯斯THP-1细胞。不同浓度Trx-lp (3 ng 30 ng 300 ng, 1μg;每个每100μL)从研究寄生虫都添加到低钱伯斯的隔间。消极的控制,一些细胞迁移通过细胞膜,细胞迁移时使用有限合伙人作为兴奋剂显著增加。在不同应用Trx-lp浓度最高的迁移率是检测到3 ng。整个细胞迁移是更高的美国rattiTrx-lp比TsTrx-lp刺激后半钟形剂量反应曲线报告趋化因子更明显的TsTrx-lp(图7)。

3.6。Trx-lps促进伤口愈合

作为一种重要的功能活动是调查是否Trx-lps从线虫寄生虫表达伤口愈合的活动。因此,不同浓度的影响的Trx-lps上皮细胞(Caco-2伤口关闭(图)8、数据和图9显微摄影)进行了分析。未经处理的细胞相比,不易愈合的伤口面积缩小每天10 - 15%,刺激细胞显示两倍增长。300 ng / 500μL两种寄生虫Trx-lps浓度是最有效的促进伤口愈合过程以及10 ng的表皮生长因子,包括积极控制,而3 ng和30 ng和浓度在1μ每500克(每μL)有一个更为温和的对伤口愈合的影响。伤口愈合过程被EGF和TsTrx-lp高度显著提升以及由SrTrx-lp显著提升()。

4所示。讨论

硫氧还蛋白是一个生理上重要的多功能蛋白质和原核的硫氧还蛋白被称为所谓的兼职蛋白质(34,35]。多种生物功能包括生长因子和抗氧化特性,作为抑制剂细胞凋亡和转录因子和趋化因子(22,23,25- - - - - -28]。很少有人了解Trx-lps,特别是那些从寄生虫在parasite-host相互作用及其可能的作用。

只有一个出版的内质网位于硫氧还蛋白跨膜相关蛋白的吸虫Clonorchis sinensis与活性部位,含有硫氧还蛋白域主题Cys-Pro-Ala-Cys (CPAC)。这个氧化还原分子建议作为保护主机,parasite-generated ROS (44]。

相反,美国rattiTrx-lp的催化域序列一致小(12 kDa)无处不在的硫氧还蛋白蛋白质(WCGPC),但有大约30 kDa的大小。同样,t是Trx-lp大小约为33 kDa,相同的催化域序列作为经典的硫氧还蛋白。

在目前的研究中,从两个寄生线虫,Trx-lp美国ratti和t是被克隆、表达和描述第一次。这两种寄生虫的蛋白质存在于E / S产品的寄生虫13Brattig et al .,未发表)。分子质量(30-33 kDa)以及蛋白质结构建议类似功能的人类Trx-related蛋白质(TRP32),也称为TXNL-1,保护细胞对葡萄糖deprivation-induced细胞毒性和参与凋亡信号47,48,71年]。像SrTrx TsTrx-lp, TRP32由一个氨基硫氧还蛋白和c端髓域(44]。Trx-lps已知有几个约束力的合作伙伴和基质与通过硫氧还蛋白的领域,产生redox-active功能。c端髓域能够与substrate-recruiting 26 s蛋白酶体的交互因素的26 s蛋白酶体eEF1A1 [72年,73年]。

硫氧还蛋白相似,Trx-lps真核细胞的多功能和参与不同的细胞过程包括代数余子式函数或特定信号的调节蛋白(46)可能表明可能兼职属性必须证明在未来(34- - - - - -36]。比较Trx-like同系物由多个序列比对显示高序列相似性Trx-lpst是从t . trichiura(94%的身份)。类圆线虫属物种都非常密切相关(11,74年]。除此之外,蛋白质对齐显示相对较低(35% - -56%)之间的相似程度,不同的线虫寄生或nonparasitic。除了美国曼所有其他物种有强烈守恒的氨基硫氧还蛋白催化部位序列(CGPC)。在糖基Trx-lps拥有核心领域。硫氧还蛋白,分析寄生虫没有信号肽和蛋白质从细胞释放通过模蛋白出口(29日,75年]。

Trx-lp也不同角色在一些人类细胞和细胞外的过程,由于活性氧(ROS)发生在正常的新陈代谢76年]。的dithiol-disulphide氧化还原酶活性的重组美国ratti和t是Trx-lps要么是根据霍蒙格林(1979)分析了胰岛素减少或减少IgM沃尔曼et al。(1988)给人以61年,63年]。减少与胰岛素和胰岛素降低硫氧还蛋白的反应非常迅速沉淀。硫氧还蛋白的相对具体的活动大肠杆菌相当于一个值4930台(61年]。发现测量相对SrTrx-lp的具体活动有一个约1557辆活动表明,它有一个类似的活动古典硫氧还蛋白。氧化还原酶活性进一步分析小鼠IgM的减少。沃尔曼et al .(1988)给人以已经表明,重组人类硫氧还蛋白能够降低小鼠的二硫桥IgM (63年]。因此,我们建议Trx域包含Trx-lps也可能减少IgM的能力。我们可以表明Trx-lps确实降低了s IgM的债券。因为所有TsTrx-lp使用剂量导致同样的乐队在sds - page的形成,这Trx-lp似乎更活跃美国rattiTrx-lp。即使在最低的蛋白质浓度小乐队在25 kDa,可见70 kDa。越密集TsTrx-lp的添加浓度越高。IgM的减少没有完全删除德勤可以排除之后形成的力量乐队将在每种方法是相同的。虽然在最低浓度乐队已经形成,他们更密集的最高浓度。此外,IgM SrTrx-lp没有乐队存在的还原试验和中间添加蛋白质浓度最低。

通过这些活动分析可以证明表达的重组Trx-lps氧化还原功能,能够作为古典硫氧还蛋白。在进一步的分析中,我们可以演示的多功能活动寄生虫蛋白质。Trx据报道发布的单核细胞(77年)也为单核细胞趋化中性粒细胞,T淋巴细胞(31日]。因此,我们已经观察到美国ratti和t是Trx-lps展览单核细胞趋化现象的活动和与之交互的能力。吸引单核细胞的细胞nematode-dwelling网站随后可能导致一个激活的细胞导致连续一代的伤口愈合促进细胞因子il - 22生成和免疫调节白细胞介素(78年- - - - - -80年]。两种寄生虫Trx-lps绑定到单核细胞的细胞,THP-1细胞,单核细胞外围虽然在某些流式细胞仪分析只有有限的计算活动。因此,SrTrx-lp绑定到DCs。感兴趣的,寄生虫redox-regulating蛋白质也必将Caco-2细胞和淋巴细胞和粒细胞更弱。因此,Trx-lps似乎与肠上皮细胞相互作用,接触的一线宿主细胞E / S产品发布的殖民寄生女性,以及二线细胞,monocyte-derived DCs。

硫氧还蛋白已经被报道,感兴趣的具有免疫活动。因此,它一直被认为是抗炎作用除了抑制细胞凋亡,促进细胞生长32,81年- - - - - -83年]。硫氧还蛋白能与免疫细胞和肿瘤坏死因子,促进生产α(31日,84年)由单核细胞的血统,但它也能够抵消TNF -等炎性细胞因子的产生α(85年,86年]。在目前的研究中,肠道上皮的3 d-coculturing Caco-2细胞和THP-1-derived DCs。在此,寄生虫Trx-lps诱导释放促炎TNF -α在第一天的文化和高浓度48 h后的一代的紧随其后相关的细胞因子il - 22生成除了TSLP和il - 10水平较低。il - 22生成可能发布的主要激活DCs细胞培养2 - 3天后(78年,80年,87年]。

免疫细胞产生的il - 22生成,尤其是现在的上皮下,先天淋巴细胞(78年,80年,88年),行为通过信号转换器和激活转录(STAT-3)和最重要的是保持肠道的体内平衡,因此服务保护肠道炎症。急性结肠炎il - 22生成的一个重要来源是TLR-stimulated CD11c⁺DCs是位于地表的肠道粘膜上皮细胞,激活入侵的病原体如细菌或寄生虫。这些细胞开始,通过il - 22生成,因此STAT-3过程重要的适当的应激反应,粘膜愈合伤口,和细胞凋亡通路78年,79年,89年]。il - 22生成可能深刻地增加的扩散和营业额iec和粘液和抗菌肽的生产90年]。因此,蛋白质的释放等肠道线虫Trx-lps可能有助于保持或恢复肠道屏障的完整性。

因此,有三个可能的通路蠕虫Trx-lps采取行动:首先,硫氧还蛋白分泌/ Trx-lp保护这种寄生虫对高活性氧产量由主人的一线通过细胞免疫反应monocyte-macrophage排列。硫氧还蛋白可能是重要的氧化还原控制伤口边缘,因为大部分ROS出现是证明(91年,92年]。ROS作为第二信使改善伤口愈合过程(93年]。因此,它符合细胞的迁移和关闭伤口。然后,抗氧化分子可能是重要的保持平衡,以防止压力诱导细胞死亡。其次,分泌Trx-lp刺激粘膜DCs产生高水平的il - 22生成,促进上皮细胞增殖和保护或恢复肠道屏障的完整性。在目前的研究表明,300 ng寄生虫Trx-lps上皮Caco-2细胞的促进伤口愈合过程。三分之一的可能功能Trx-lp分泌的寄生虫可能模仿宿主的抗氧化分子,可能导致宿主的抗氧化代谢的干扰反应有关基质分子和绑定。因此,最近的报告表明,不同分子分泌由蠕虫的寄生虫可以促进伤口愈合94年和调节宿主的免疫反应95年]。

5。结论

总之,我们识别和分泌Trx-lps的特点美国ratti和t是。两个多功能蛋白抗氧化活性和表达能力与主人的粘膜细胞,由趋化单核细胞的细胞活动,表示绑定到宿主上皮细胞以及免疫细胞,通过细胞因子的释放。特别是,促进伤口愈合效果表明Trx-lp参与许多通路中发起当地parasite-host交互

信息披露

伊娃Liebau和诺伯特·w·Brattig共享的资深作者。核苷酸序列ratti类圆线虫属thioredoxin-like (SrTrx-lp)和蛋白质鞭虫是thioredoxin-like蛋白质(TsTrx-lp)存入基因库数据库下加入KX119168 SrTrx-lp和KFD58615.1 TsTrx-lp(原来称为假想蛋白M13)。

相互竞争的利益

作者没有利益冲突声明。

确认

作者欣然承认Dana Ditgen十二个月的奖学金和Emmanuela m . Anandarajah Ovamed。支持的博士生Emmanuela m . Anandarajah Evangelisches Studienwerk Villigst。他们感谢f . Geisinger和l . Feige技术和实验支持。兽医团队Bernhard Nocht热带医学研究所的承认。数据从这个工作形成一个博士论文的主要部分Emmanuela m . Anandarajah和Dana Ditgen系的分子生理学,到专家,德国明斯特。

补充材料

引用

1. m·e·维尼和j·b·洛克”类圆线虫属spp。”WormBook,2007年1 - 15页。视图:谷歌学术搜索
2. a·奥尔森l . van Lieshout h·马蒂et al .,“Strongyloidiasis-the最被忽视的被忽视的热带病?”皇家学会的事务热带医学和卫生,卷103,不。10日,967 - 972年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. m·e·维尼”的生物类圆线虫属spp。”WormBook,1卷,2015页。视图:谷歌学术搜索
4. j . Bethony布鲁克,m . Albonico et al .,“土壤传播寄生虫感染:蛔虫、鞭虫病、钩虫,”《柳叶刀》,卷367,不。9521年,第1532 - 1521页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. c . Cutillas r . Callejon m·德·罗哈斯et al。”鞭虫是和鞭虫trichiura线虫种类不同,“Acta Tropica,卷111,不。3、299 - 307年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. l . Nemetschke A·g·爱伯哈德·m·e·维尼和A·斯特雷特”animal-parasitic线虫的基因图谱ratti类圆线虫属”,分子和生化寄生虫学,卷169,不。2、124 - 127年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. j·a·杰克逊,i m·弗里s小和j·e·布拉德利”系列评论寄生虫,免疫调制和卫生假说:免疫力寄生虫和免疫学现象在现代人类种群:共同进化的遗产?”免疫学,卷126,不。3,18-27,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. d·e·艾略特和j·魏因斯托克诉”,蠕虫治疗:使用蠕虫治疗免疫介导性疾病,”实验医学和生物学的发展卷,666年,第166 - 157页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. j·魏因斯托克诉”,自身免疫:蠕虫的回报,”自然,卷491,不。7423年,第185 - 183页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. j.p.款,j·r·格兰杰,r . m .该种“寄生虫免疫调节:寄生虫分泌蛋白的作用在调节宿主免疫力,”分子和生化寄生虫学,卷167,不。1、1 - 11,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 诉l·亨特,i . j .蔡a Coghlan et al .,“寄生的基因基础类圆线虫属线虫的进化枝”,自然遗传学,48卷,不。3、299 - 307年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. 诉Steisslinger, y Tazir h . Soblik et al .,“分子和功能描述的热休克蛋白10ratti类圆线虫属”,分子和生化寄生虫学,卷168,不。2、149 - 157年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. h . Soblik a·e·尤尼斯·m·Mitreva et al .,“生命周期stage-resolved检查参与组成分泌腺excretome /从蛋白质组学分析ratti类圆线虫属识别stage-specific蛋白酶。”分子和细胞蛋白质组学,10卷,不。12日,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. a·e·尤尼斯h . Soblik i Ajonina-Ekoti et al .,”表征的巨噬细胞迁移抑制因子分泌同系物寄生线虫类圆线虫属代理在parasite-host细胞界面。”微生物和感染,14卷,不。3、279 - 289年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. a·e·尤尼斯f . Geisinger i Ajonina-Ekoti et al .,“Stage-specific excretory-secretory小热休克蛋白的寄生线虫ratti类圆线虫属假定的链接与宿主肠道粘膜防御系统,”2月日报,卷278,不。18日,第3336 - 3319页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. d . Ditgen e . m . Anandarajah k·a·迈斯纳n . Brattig c . Wrenger大肠Liebau,“利用治疗性免疫调制剂检查参与组成分泌腺寄生虫,”生物医学研究的国际ID 964350条,卷。2014年,14页,2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. h·克雷格·j·m·Wastling d·p·诺克斯,“初步体外排泄/分泌蛋白质组调查的产品处于第四阶段的幼虫和成虫Teladorsagia circumcincta”,寄生虫学,卷132,不。4、535 - 543年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. v . g . Virginio k . m .蒙泰罗f . Drumond et al .,在培养的“排泄/分泌的产品棘球绦虫granulosusprotoscoleces。”分子和生化寄生虫学,卷183,不。1,第15 - 22页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. y y, l .黄黄et al .,“分子克隆、表达和immunolocalization excretory-secretory蛋白二硫化物异构酶的产品Clonorchis sinensis”,寄生虫学研究,卷111,不。3、983 - 989年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. 傅曹x, z, m . Zhang et al .,“iTRAQ-based excretory-secretory蛋白质的比较蛋白质组学分析schistosomula和成虫日本血吸虫”,蛋白质组学杂志》30—39卷,138,页2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. a . Marcilla m . Trelis a·科尔特斯et al .,“细胞外囊泡从寄生蠕虫包含特定的排泄/分泌蛋白质和内化在肠道宿主细胞,”《公共科学图书馆•综合》,7卷,不。9篇文章ID e45974 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. e·s·j·阿恩和a . Holmgren“硫氧还蛋白的生理功能和硫氧还蛋白还原酶欧洲生物化学杂志,卷267,不。20日,第6109 - 6102页,2000年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. k . Kunchithapautham b . Padmavathi r·b·纳拉亚南p . Kaliraj和a·l·斯科特,“硫氧还蛋白与象皮病马来:定义一个16-kilodalton类线虫的硫氧还蛋白,”感染和免疫,卷71,不。7,4119 - 4126年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. j . c . Fierro-Gonzalez m . Gonzalez-Barrios a . Miranda-Vizuete和p . Swoboda硫氧还蛋白TRX-1调节成人寿命扩展引起的饮食限制秀丽隐杆线虫”,生物化学和生物物理研究通信,卷406,不。3、478 - 482年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. i m . Sotirchos a·l·哈德逊j . Ellis和m . w .戴维硫氧还蛋白的寄生线虫:16 -比较和12-kDA硫氧还蛋白Haemonchus contortus”,自由基生物学和医学,44卷,不。12日,第2033 - 2026页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. l . s . Nakao r . a . Everley s·m·马里诺et al .,”系统,即蛋白质组学筛选确定的目标thioredoxin-like蛋白质,”《生物化学》杂志上,卷290,不。9日,第5695 - 5685页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. a . Holmgren和m . Bjornstedt硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶方法酶学卷,252年,第208 - 199页,1995年。视图:谷歌学术搜索
28. w·h·沃森,x, y . e . Choi d·p·琼斯和j.p. Kehrer,“硫氧还蛋白及其在毒理学作用,”毒物学的科学,卷78,不。1,3 - 14,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. w .镍、“非经典数理蛋白质分泌的神秘。当前视图在货物蛋白质和潜在的出口路线,“欧洲生物化学杂志,卷270,不。10日,2109 - 2119年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. a . Rubartelli a . Bajetto g . Allavena e·沃尔曼,给人以和r . Sitia“硫氧还蛋白的分泌正常和肿瘤细胞通过一个群龙无首分泌通路,”《生物化学》杂志上,卷267,不。34岁,24161 - 24164年,1992页。视图:谷歌学术搜索
31. r·贝尔蒂尼o . m . z霍华德H.-F。董et al .,“硫氧还蛋白还原酶释放感染和炎症,是一种独特的化学引诱物中性粒细胞,单核细胞,T细胞,”《实验医学杂志》上,卷189,不。11日,第1789 - 1783页,1999年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. k . Kasuno k方明,h吉田et al .,“肾在阿基氧化还原失调:阿基的氧化应激标记,申请”美国Physiology-Renal生理学杂志》上,卷307,不。12日,F1342-F1351, 2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. n .近藤中村h, h . Masutani, j . Yodoi“人类硫氧还蛋白的氧化还原调控网络,”抗氧化剂和氧化还原信号,8卷,不。9 - 10,1881 - 1890年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. d·h·e·w·休伯特和i . j . van der Klei“兼职蛋白质:一个有趣的多任务处理模式”,Biochimica et Biophysica Acta-Molecular细胞研究,卷1803,不。4、520 - 525年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. c·j·杰弗瑞,“兼职蛋白质,”生化科学趋势,24卷,不。1,8 - 11,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. c·j·杰弗瑞,“为什么学习兼职蛋白质?”遗传学前沿》第六卷,第211条,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. a . Jolodar·菲舍尔伯格曼,d . w . Buttner s .哈默施密特和n . w . Brattig”分子克隆的α烯醇酶从人类丝虫的寄生虫盘尾属肠扭结结合人类的纤溶酶原,物”Biochimica et Biophysica Acta-Gene结构和表达,卷1627,不。2 - 3、111 - 120年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. k·r·Lorenzatto k . m .蒙泰罗裴瑞兹r . et al .,“Fructose-bisphosphate醛缩酶和烯醇酶棘球绦虫granulosus:基因表达模式和蛋白质相互作用的两个潜在兼职蛋白质,”基因,卷506,不。1,第84 - 76页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. 诉Steisslinger s Korten n . w . Brattig和k·d·Erttmann DNA疫苗编码兼职蛋白质盘尾属肠扭结glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(机汇-GAPDH)导致部分保护人类丝虫病的小鼠模型中,“疫苗,33卷,不。43岁,5861 - 5867年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. h . Ludemann m . Dormeyer c . Sticherling d . Stallmann h . Follmann, r . l . Krauth-Siegel。”锥虫属bruceitryparedoxin thioredoxin-like蛋白质在非洲锥虫”,2月的信,卷431,不。3、381 - 385年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. d·g·阿里亚斯诉e·马尔克斯·m·l·Chiribao et al .,“氧化还原代谢鲁兹锥体:功能描述tryparedoxins重提。”自由基生物学和医学卷,63年,第77 - 65页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. 大肠Jortzik和k·贝克尔,“硫氧还蛋白,谷胱甘肽系统恶性疟原虫”,国际医学微生物学杂志》上,卷302,不。4 - 5,187 - 194年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. l . j . Liu吉姆,y . Zhang et al .,“小说thioredoxin-like蛋白质是组件的皮层微管蛋白复合物涂层刚地弓形虫”,真核细胞,12卷,不。12日,第1599 - 1588页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. c . m .扁,廖h . et al .,“识别和硫氧还蛋白的免疫学特征transmembrane-related蛋白质Clonorchis sinensis”,寄生虫学研究,卷112,不。4、1729 - 1736年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
45. j·d·布朗,A . m ., s·r·泰勒,l·托马林b·e·摩根和e·A·小牛肉”的酶类促进H₂O₂信号和氧化应激抵抗氧化的硫氧还蛋白家族蛋白”细胞的报道,5卷,不。5,1425 - 1435年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
46. 李,s m . Kim, r·t·李,“硫氧还蛋白和硫氧还蛋白目标蛋白质:从分子机制的功能意义,”抗氧化剂和氧化还原信号,18卷,不。10日,1165 - 1207年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
47. t . Ishii y Funato h .杨爱瑾,“Thioredoxin-related蛋白质32 (TRP32)特别减少氧化再生肝磷酸酶(PRL)”生物化学杂志,卷288,不。10日,7263 - 7270年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
48. 研究x w . Wang。Liou, b和j·l·丁”一个进化保守16-kDa thioredoxin-related调节NF -蛋白质是一种抗氧化剂κB信号通路。”自由基生物学和医学,42卷,不。2、247 - 259年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
49. Padera, r·森古普塔m . Cebula et al .,“Thioredoxin-related 14 kDa的蛋白质是一种有效的l -胱氨酸还原酶和S-denitrosylase”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷111,不。19日,6964 - 6969年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
50. 李z, a, h . h .智和f . Lu,“STAT3-dependent TXNDC17表达介导耐紫杉醇通过诱导自噬在人类大肠癌细胞,”基因,卷584,不。1,第82 - 75页,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
51. w·宋,t·s·艾。Chang e . s . Boja h . m .菲尔斯和s . g . Rhee TRP14的角色thioredoxin-related蛋白质在肿瘤坏死因子-α信号通路。”《生物化学》杂志上,卷279,不。5,3151 - 3159年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
52. j .秦g·m·克罗尔w·p·肯尼迪,j·r·胡特和a . m . Gronenborn”解决方案结构的人类在混合二硫硫氧还蛋白中间复杂目标转录因子NF的肽κB。”结构,3卷,不。3、289 - 297年,1995页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
53. j。赖,j·t·道尔顿,d . l . Knoell”磷酸酶和tensin同系物删除10号染色体上(PTEN)作为分子在肺上皮伤口修复目标,“英国药理学杂志》上的报告,卷152,不。8,1172 - 1184年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
54. k . y . Sugiura荒木,siv。Iemura, t .写到,j . Hoseki和k .经营着“小说TMX4 thioredoxin-related跨膜蛋白还原酶活动”,《生物化学》杂志上,卷285,不。10日,7135 - 7142年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
55. l·a·凯利s Mezulis c·m·耶茨m . n . Wass和m·j·e·斯特恩伯格“Phyre2门户网站对蛋白质建模、预测和分析,“自然的协议,10卷,不。6,845 - 858年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
56. m . j . Smout j . Sotillo t Laha et al .,“致癌寄生虫分泌生长因子,加速伤口愈合,并可能促进肿瘤,”PLoS病原体,11卷,不。10篇文章e1005209 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
57. d .冬季和h . Steen”,优化细胞溶菌作用和蛋白质的消化协议分析的海拉细胞S3质/女士,”蛋白质组学,11卷,不。24日,第4730 - 4726页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
58. j . Rappsilber y Ishihama m·曼,“停和走萃取小贴士matrix-assisted激光解吸/电离,nanoelectrospray,和LC / MS样品预处理在蛋白质组学中,“分析化学,卷75,不。3、663 - 670年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
59. n . Sobotzki哈恩(h . Hahne) t·尼伯格et al .,“蛋白质组宽O-GlcNAc-modified蛋白质的纯化和鉴定使用点击化学和质谱分析,“蛋白质组研究期刊》的研究,12卷,不。2、927 - 936年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
60. j .秘密地和美国Brandau pJC20和pJC40-two high-copy-number向量T7 RNA polymerase-dependent重组基因的表达大肠杆菌”,蛋白表达和纯化,5卷,不。2、133 - 137年,1994页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
61. “a Holmgren硫氧还蛋白催化减少胰岛素二硫化二硫苏糖醇、dihydrolipoamide”生物化学杂志,卷254,不。19日,9627 - 9632年,1979页。视图:谷歌学术搜索
62. m . Luthman和a . Holmgren”鼠肝脏硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶:纯化和表征,”生物化学,21卷,不。26日,第6633 - 6628页,1982年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
63. e·e·沃尔曼,给人以l .道里奥l . Rimsky et al .,“人类硫氧还蛋白的cDNA克隆和表达,“《生物化学》杂志上,卷263,不。30日,第15512 - 15506页,1988年。视图:谷歌学术搜索
64. j . Pusch m . Votteler s Gohler et al .,“生理性能的三维模型模拟小肠的微环境,”生物材料,32卷,不。30日,第7478 - 7469页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
65. c . berg c . Naujokat s Tinapp et al .,“细胞系模型人体树突状细胞的分化,“生物化学和生物物理研究通信,卷333,不。3、896 - 907年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
66. n . w . Brattig Rathjens, m·恩斯特f . Geisinger还建议,和f·w·Tischendorf”Lipopolysaccharide-like分子来自沃尔巴克氏体属endobacteria丝虫属的盘尾属肠扭结的候选序列中的介质人类单核细胞的炎症和抗炎反应,”微生物和感染,卷2,不。10日,1147 - 1157年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
67. p•赫特尔j .丹尼尔,d . Stegehake et al .,“ubiquitin-fold修饰符1 (Ufm1)级联的线虫,”生物化学杂志,卷288,不。15日,第10671 - 10661页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
68. m·t·卢比奥De krom m . krom k . Luersen和n . w . Brattig”检测中性粒细胞的趋化因子提取的女性盘尾属肠扭结,”Acta Tropica,卷71,不。1,45-56,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
69. n . w . Brattig d . w . Buttner, a . Hoerauf“中性粒细胞积聚盘尾属蠕虫和中性粒细胞的趋化性是依赖沃尔巴克氏体属endobacteria。”微生物和感染,3卷,不。6,439 - 446年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
70. t .日本田岛t村田,k Aritake et al .,通过前列腺素D“脂多糖诱导巨噬细胞迁移₂和前列腺素E₂”,药理学和实验治疗学杂志》上,卷326,不。2、493 - 501年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
71. 洛杉矶Vardy h . Wang, c·p·谭et al .,“PCBP1抑制转移相关的翻译PRL-3磷酸酶,”癌症细胞,18卷,不。1、52 - 62年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
72. 大肠埃雷罗和m . a . De La Torre-Ruiz Monothiol glutaredoxins:一个共同的域为多个功能,“细胞和分子生命科学,卷64,不。12日,第1530 - 1518页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
73. r·d·芬恩·Coggill r . y .爱伯哈et al .,”包含了蛋白质数据库:家庭对一个更可持续的未来,”核酸的研究,44卷,不。1,D279-D285, 2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
74. m . Dorris, m·e·维尼和m . l . Blaxter”属的分子系统发育分析类圆线虫属和相关的线虫,”国际寄生虫学杂志,32卷,不。12日,第1517 - 1507页,2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
75. 镍和m . w .西多夫,“非常规蛋白质运输机制真核细胞的细胞表面,“细胞和发育生物学的年度审查,24卷,第308 - 287页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
76. j·e·林茨S.-Y。在香港,l·罗兹诉“氧化应激相关转录因子在次生代谢的规定,“毒素,5卷,不。4、683 - 702年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
77. b . Sahaf和a . Rosen分泌10-kDa和12-kDa硫氧还蛋白物种从血液单核细胞和改变了白细胞,”抗氧化剂和氧化还原信号,卷2,不。4、717 - 726年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
78. g . Pickert c . Neufert m . Leppkes et al .,“STAT3链接il - 22生成信号在肠道上皮细胞粘膜愈合伤口,“实验医学杂志,卷206,不。7,1465 - 1472年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
79. f .施赖伯j . m . Arasteh, t·d·罗莉”病原体抵抗介导的il - 22生成信号epithelial-microbiota接口,“分子生物学杂志,卷427,不。23日,第3682 - 3676页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
80. 沟口健二,“治疗肠道炎症的il - 22生成时,”炎症性肠病,18卷,不。9日,第1784 - 1777页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
81. y y Hoshino中村h, h .实在,松尾和j . Yodoi“硫氧还蛋白1交付新疗法,”先进的药物输送的评论,卷61,不。4、303 - 309年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
82. r .渡边,中村h, h . Masutani, j . Yodoi“氧化、抗癌和抗炎行动硫氧还蛋白1和thioredoxin-binding protein-2,”药理学和治疗,卷127,不。3、261 - 270年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
83. h .玉城丹尼,中村h . a .西et al .,“人类thioredoxin-1改善实验小鼠结肠炎与抑制巨噬细胞抑制因子生产,”胃肠病学,卷131,不。4、1110 - 1121年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
84. h . Schenk m·沃格特w . Droge, k . Schulze-Osthoff“硫氧还蛋白作为细胞因子表达的有力costimulus。”《免疫学,卷156,不。2、765 - 771年,1996页。视图:谷歌学术搜索
85. t . Hoshino,中村h . m . Okamoto et al .,“Redox-active蛋白质硫氧还蛋白防止促炎细胞因子或bleomycin-induced肺损伤,”美国呼吸和重症监护医学杂志》上,卷168,不。9日,第1083 - 1075页,2003年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
86. h .田y松尾的巨大,r .小野c . Nishigori和j . Yodoi“硫氧还蛋白改善皮肤炎症通过调节上皮细胞生产和释放促炎细胞因子,”免疫学前沿第269条,卷。4日,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
87. e·r·曼·d·伯纳德,s . c . Ng et al .,“人类肠道树突状细胞驱动异常gut-specific t细胞在溃疡性结肠炎的反应,以增加il - 4生产和il - 22生成和干扰素的损失γ”,炎症性肠病,20卷,不。12日,第2307 - 2299页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
88. m·a·Kinnebrew c . g . Buffie g . e . william Diehl et al .,“白介素23生产肠道CD103 + CD11b +树突细胞,以应对细菌鞭毛蛋白增强粘膜先天免疫防御,”免疫力,36卷,不。2、276 - 287年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
89. m . Rimoldi m . Chieppa诉Salucci et al .,“肠道免疫内稳态是由上皮细胞和树突细胞之间的串扰,”自然免疫学》第六卷,没有。5,507 - 514年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
90. m·j·布罗德赫斯特·j·m·梁诉卡et al .,“il - 22生成⁺CD4⁺T细胞与治疗有关鞭虫trichiura感染溃疡性结肠炎病人。”科学转化医学,卷2,不。第六十条ra88 60, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
91. p . Niethammer c之中,A . t .看,和t . j . Mitchison”tissue-scale梯度的过氧化氢介导快速检测在斑马鱼,”自然,卷459,不。7249年,第999 - 996页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
92. b . Enyedi和p . Niethammer上皮创伤检测机制。”细胞生物学的趋势,25卷,不。7,398 - 407年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
93. 达尼尔,t·巴顿j·布伦南et al .,“活性氧(ROS)和伤口愈合:ROS的功能作用和新兴ROS-modulating愈合过程的增强技术,”国际伤口期刊,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
94. w·c·高氏,t·a·韦恩和j·e·艾伦,”2型免疫和伤口愈合:进化改进适应性免疫的寄生虫,”自然评论免疫学,13卷,不。8,607 - 614年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
95. r . m .该种和h·j·麦克索利调节宿主免疫系统由蠕虫的寄生虫,”变态反应与临床免疫学杂志》上,卷138,不。3、666 - 675年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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