一环介导等温扩增用于诊断的发展蛔虫在粪便样品

抽象

蛔虫是引起人类共同的热带感染蛔虫病线虫寄生虫。它也被忽视的热带疾病中考虑。诊断主要依赖于基于显微镜的方法，其是费力，由低灵敏度是有限的，并且需要高的专业知识。我们已经开发了用于粪便样品中蛔虫病诊断介导的等温扩增（LAMP）的环路，基于第一内转录（ITS-1）的核糖体DNA的间隔区。我们使用底漆浏览器V4软件设计引物。蛔虫成人和卵子是从自然感染的学生，他们的家长/监护人为他们参与这项研究给了同意而获得的。使用碱裂解法提取基因组DNA，并在63℃下通过LAMP法扩增45分钟。LAMP产物经肉眼添加的SYBR Green染料后，也对琼脂糖凝胶显现。LAMP成功和可靠地检测蛔虫DNA从一个单一的蛋和粪便样品英寸该测定法特异性检测蛔虫不扩增与其他寄生虫共存的卵细胞DNA蛔虫粪便中。在发达的LAMP测定具有在护理点蛔虫病的诊断和使用低强度的感染情况表征控制和消除运动的巨大潜力。

1.简介

蛔虫导致土壤传播的蠕虫病（STHs）全球，是一个重大的公共卫生问题，认为是被忽视的热带疾病之一，目前针对消除[1]。这是蛔虫病与1.2十亿人[估计全球流行的病原体2，其中大多数是生活在撒哈拉以南非洲地区的儿童[3.]。成年人也常常感染蛔虫但流行和感染强度往往比儿童[低得多4]。负责蛔虫病和其他土壤传播的蠕虫感染的流行因素包括卫生条件差和卫生，供水不足，以及不良的卫生保健体系5]。

蛔虫病是通过粪-口途径感染[6]。诊断方法主要是采用世界卫生组织推荐的Kato-Katz技术，在显微镜下检查粪便样本，看是否有寄生虫卵。[7]。基于显微镜的诊断检测在感染诊断中有价值，但灵敏度低，使用繁琐，执行需要专业知识，缺乏吞吐量能力[8]。一些报道已经表明在使用的情况下镜检时漏报如产蛋量减少的以下驱虫药物治疗和轻度感染[上升8]。通常，他们可能没有在检测低水平的感染疾病消除运动特性，用于监测化学疗法的成功或失败的有用;他们是在野外环境中使用既不适应，也不适应在医疗点使用。血清学诊断测试已很少被用于常规检测蛔虫由于感染是侵入性的，在治愈后抗体的检测可能会持续存在，而交叉反应也可能与其他医疗条件发生[9]。因此可靠的诊断测试需要用于感染的诊断，消除后监测化疗有效性，和疾病监测的[10]。分子诊断工具，如环介导等温扩增（LAMP），是一个功能强大的替代传统的寄生虫测试。

LAMP是一种DNA扩增技术，由Notomi和他的同事首次提出[11]，但现已发现广泛应用作为用于引起原生动物，细菌或病毒[多种人类，动物和植物疾病的诊断工具12- - - - - -16]。LAMP能够与等温条件下更高的灵敏度，特异性，效率，和速度迅速扩增靶核酸[16]，没有非靶DNA的共存下的显著影响[17]。此外，基于LAMP的测定需要相对简单和便宜的设备，如一个孵化器，水浴，和加热块可以提供恒定的温度，因此，可以很容易地在护理点被应用，即使在现场条件下[11,16]。最近的研究已经证明，LAMP比常规聚合酶链反应更敏感和特异[18,19]。其它优点还包括试验速度，缩短运行时间，便于缺乏分子技术背景人员培训和吞吐能力。因此，在这项研究中，我们开发了介导等温扩增（LAMP）方法的诊断循环蛔虫感染粪便样品英寸

2.材料和方法

2.1。标本采集和准备

2.1.1。寄生虫材料

一个成人蛔虫试样和寄生虫卵被用作优化LAMP检测DNA的来源。该adult worm was recovered from a fecal sample of a child who had received 400 mg albendazole [20]，标准剂量进行治疗蛔虫病。将样品保存在95％乙醇中直至用于DNA提取和然后丢弃。卵蛔虫从被感染的失学儿童粪便样本，年龄6-12岁，来自夸莱县，肯尼亚，其父母已同意他们参与这项研究马萨姆本尼县级以下获得。钩虫的虫卵和T.虫还从参与儿童的粪便样品，其提供的DNA，以验证LAMP检测的特异性分离的。此外，OVA曼氏血吸虫还从实验感染的小鼠和用于测定的特异性测试这些提供的DNA回收。该曼氏血吸虫卵子捐赠自该研究所正在进行的一项研究。

2.1.2。粪便样本收集和寄生虫学的考试

每位参与实验的儿童提供一份粪便样本，该样本装在一个有盖的塑料polypot中，在采集后2小时内放入冰盒运回现场实验室。复制Kato-Katz显微镜载玻片准备按照Kato-Katz过程(7]和由两个有经验的显微镜的化合物​​显微镜下检查在×400放大倍数。另外，幻灯片的总数的5％是由第三个显微镜用于质量控制的目的读取。蛔虫以ova阳性标本分离ova进行DNA提取，优化LAMP技术。

2.2。分离蛔虫OVA

卵子的蛔虫从使用修改威斯康星州的糖浮选法[个体的粪便样品中分离得到21]。Briefly, Sheather’s sugar solution with a specific gravity of 1.27 was prepared by mixing 455 gm table sugar with 355 mL distilled water and boiled to dissolve the sugar. Approximately 6 gm of fecal sample was then placed in a 3.5-inch diameter petri dish and 30 mL of the Sheather’s solution was added. The mixture was stirred into a homogenate using a wooden tongue depressor and filtered through a layered wet cheese cloth into a 50 mL centrifuge tube. The filtrate was centrifuged at 3000 rpm for 10 min, and the solution was left to stand for 10 min to allow the parasite eggs to float. The presence of parasite ova was confirmed under the microscope by placing a cover slip over the solution and transferring it onto a microscope slide [21]。Approximately 5 mL of the supernatant was transferred into a 15 mL centrifuge tube, and 2 volumes of water were added to dilute the sugar solution, consequently, reducing the specific gravity. This allowed the eggs to settle at the bottom after a 3 min spin in the centrifuge at 3000 rpm. The resulting pellet was resuspended in 2 mL distilled water, mixed by vortexing, and then transferred into 1.5 mL centrifuge tubes.

2.3。设计LAMP引物

底漆资源管理器V4（富士通株式会社，东京，日本）用于引物设计[22]。生成多个引物集合，利用基本的局部比对搜索工具(BLAST) (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行，以验证其是否适合。那些产生密切关联，以蛔虫，从GenBank中以序列登录号AJ000895，被选择用于随后的实验。经过多次试验，选择具有FIP，BIP，F3和B3仅一组从ITS-1的引物（参见表1在本研究中使用的引物）的碱基序列。

2.4。DNA提取

从完整的卵中提取DNA蛔虫，以及从使用修改的HotShot方法[成虫23]。简言之，1，5，10，15，20，和25蛔虫将鸡蛋分别放入6个单独的PCR管中，每管30个µL(裂解试剂(氢氧化钠、EDTA和蒸馏水),并在95°C 1 h孵化。在孵育期结束时，向每个试管中加入等量的中和试剂(三氯化钾和蒸馏水)[23]。使用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington DE, USA)测定了每个试管的DNA浓度，以估计不同卵子计数所需的DNA数量。从乙醇保存的成年人身上提取DNA蛔虫worm, the specimen was cut up into tiny pieces, each measuring ~1 mm. These were then placed in a petri dish containing distilled water and soaked for 1 h to remove ethanol traces. Each piece was then transferred into a 200 µ含有40升管 µL的lysis reagent and incubated at 95°C for 1 h and followed by addition of equal volume of neutralizing reagent (TrisHCl, distilled water) to end up with DNA solution in TE buffer [23]。为了评估发达灯测试的特异性，其他三种寄生虫卵被使用，即，钩虫，曼氏血吸虫和鞭虫。这些寄生虫以粪便为基础，通常与它们共存蛔虫。卵母细胞DNA曼氏血吸虫和T.虫以上使用的HotShot方法[如所述萃取23]。然而，钩虫样本的DNA提取使用QIAmp快速DNA粪便minikit (QIAmp Fast DNA stool minikit，希尔登，德国)。

2.5。优化LAMP反应条件

我们实验了几组ITS-1 lamp引物。首先，我们以2:1的比例分析了内引物与外引物的不同比例;4: 1;6: 1;8: 1 (11- - - - - -13,15- - - - - -18]。其次，在DNA浓度不变、引物比固定的情况下，测试数个15 min - 2 h，间隔15 min的孵育时间。第三，优化了每个培养时间的理想培养温度。根据每个底漆的基本成分和推荐熔点温度，测试温度范围为56℃至63℃()每个引物56℃[11- - - - - -13,15- - - - - -18]。最后，两种DNA聚合酶，即芽孢杆菌stearothermophilus (Bst)(11]和史密斯芽孢杆菌（BSM）(24]，进行了测试，以确定其中两个之间有最佳产率，而其它的反应条件被保持在恒定。从这些实验的结果，一个引物组，由于选择其能力和一致性容易AMPLIFY蛔虫DNA在LAMP反应中(见表)1)。

2.6。灯试验

所有的反应在热循环仪中温育，GeneAmp PCR系统97（应用生物系统公司，新加坡）。经过多次优化反应，我们终于在21的最终反应体积解决以下LAMP反应条件 µL具有以下组成部分µL的each of the four primers (FIP, BIP, B3, and F3) in a ratio of 6 : 1 inner to outer primers; 8 U/µL的BSMDNA聚合酶（Thermo Scientific）进行;10倍BSM缓冲;1。2x of 2x LAMP reaction buffer [1 M TrisHCl, KCl, MgSO₄，（NH₄)₂所以₄，吐温20，甜菜碱，和dNTP] [24]。和1 µl目标DNA。Amplification was carried out at 63°C for 45 min, andBSMDNA polymerase activity stopped by a final incubation at 80°C for 10 min.

2.7。LAMP产物的检测

为了检测扩增子，5 µ产品的L，采用2％TAE琼脂糖凝胶上用SYBR Green安全DNA凝胶染色剂染色分离[11]。此外，扩增子的目视检测，进行使用SYBR Green 1种核酸凝胶染料10,000（Life Technologies）中[17以1:10的比例稀释，1µ将稀释后的染料L加入到每个放大反应中，用肉眼检测。使用尼康Coolpix 4500观察和拍摄颜色变化。

2.8。使用直接从粪便样本中提取DNA的LAMP检测方法与Kato-Katz技术进行比较

使用QIAamp Fast DNA stool minikit (QIAGEN, Hilden, Germany)从40份粪便样本中提取DNA，按照制造商的说明进行。简单地说，称了200毫克的粪便，并将其放入2毫升的试管中。加入1 mL的抑制剂缓冲液，涡流1分钟。混合物在95℃下加热10分钟，然后涡流15 s。14000 rpm(全速)离心1 min。在1.5毫升的微离心管中，有15个µ蛋白酶K L的放置和200 µ加入上清的L，然后加入200 µL缓存AL。the mixture was vortexed for 15 s. To the lysate, 200 µ加入并涡旋的无水乙醇升。为了QIAmp离心柱，600 µ加入裂解液的L和离心全速。该spin column was placed into a new 2 mL collection tube and 500 µlbuffer AW1 was added and followed by centrifugation at full speed for 1 min. After placing the spin column in another collection tube, 500 µlbuffer AW2 was applied and spun for 3 min at full speed. The spin column was transferred to a fresh collection tube and span for another 3 min at full speed. The spin column was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and 200 µL的ATE buffer was added, followed by incubation at room temperature for 1 min. It was then centrifuged at full speed to elute DNA. Samples were blinded as they had earlier been screened using Kato-Katz procedure. A contingency table was used to determine the percent agreement between the developed assay and Kato-Katz technique.

3.结果

3.1。粪便样本收集和寄生虫学的考试

粪便样品从总共581名儿童收集并检查肠道寄生虫感染。检查的儿童中三个肠道蠕虫感染的总患病率为40％，与患病蛔虫感染是7.9％。

3.2。寄生虫卵的分离和DNA提取

的卵蛔虫利用改进的威斯康星浮选方法，成功地从阳性粪便样本中分离出来，从而得到一个相对干净、没有粪便碎片的样本。完整的蛔虫鸡蛋LAMP扩增提供足够的DNA。有与样品中增加卵计数增加在DNA浓度的一般趋势。表2显示了不同卵数DNA浓度。

3.3。最佳条件

最佳LAMP实验条件为63℃，孵育期为45分钟。内引物与外引物的理想比值为6:1(图)1)。BSMDNA聚合酶代替BSTDNA聚合酶，因为后者始终未能产生优化的条件下的结果。

3.4。灵敏度的灯

该灯assay was able to detect DNA extracted from a single egg (DNA concentration 10.8 ng/µL).凝胶电泳和SYBR Green染色均证实了这一点(图)2(一个)和2 (b))。

3.5。LAMP的特异性

什么时候蛔虫特异性引物，用于从钩虫扩增DNA和T.虫线虫和曼氏血吸虫吸虫，通常与粪便共存蛔虫没有观察到交叉反应性或扩增，这表明LAMP反应是特异性的蛔虫(图3.)。

3.6。LAMP的比较来改良加藤技术

发达LAMP技术进行比较改良加藤技术和结果显示在2×2列联表（表3.和4），具有的灵敏度，特异性和预测值所指示。

4。讨论

我们开发的环介导等温扩增(LAMP)测试适合用于支持蛔虫病的控制工作，因为与Kato-Katz技术相比，它能够检测少量的寄生虫DNA。这种已开发的分析方法可以从单个卵子中检测到寄生虫的DNA，这一事实表明，即使强度很低，也能检测到寄生虫的DNA蛔虫感染可以容易地在该测定中进行检测。它具有高吞吐量;因此，许多样品可以潜在地同时处理。

基于该ITS-1核糖体DNA的区域所产生的引物已被证明是缓慢的，在累积替换和具有较低种内多态性[21]。此外，相同的属的生物体常常被ITS区域区分相比于核糖体DNA亚基它们具有更高的序列变异性，从而提高了区分的电位蛔虫和猪蛔虫A.，两者关系密切[25]。因此，在发达的LAMP检测没有与共存蠕虫寄生虫发生交叉反应：钩虫，T.虫， 要么曼氏血吸虫。这是很重要的，因为在许多地方性的地方，多重寄生虫感染经常发生在一个人。

比传统的分子生物学技术的LAMP测试的一个优点是复杂的设备并不要求用于确认的试验结果。例如，根据染色的扩增产物用SYBR Green染料的简单的颜色变化检测系统，用肉眼可视化，显示出大田条件下使用该测定法的可行性。这消除了凝胶电泳的需要。我们也证实了使用凝胶电泳的扩增产物，结果是与的SYBR Green染色一致。另外，由于在测定反应是等温的，一个简单的水浴可用于该试验中，潜在地允许在护理中低资源疾病流行地区的点要使用的技术。由该方法制备的DNA通过描述和Truent同事[23]含有杂质，然而LAMP技术能够可靠地扩增靶DNA，没有非靶DNA的共存下的显著影响[17]和其它杂质。

为了验证发达LAMP法中，使用40个粪便标本，并且当与改良加藤技术，这是WHO金标准[比较7]，85％的协议存在，83.9％阳性预测值和88.9％阴性预测值。的0.72中间卡帕成立[26]。LAMP能够从单个寄生虫卵中检测到DNA，这一事实有助于说明，开发的实验在疾病控制/消除情况中低感染设置特征方面的潜力。尽管如此，这项研究也有一些局限性。与Kato-Katz技术相比，开发的LAMP技术降低了灵敏度。这可能归因于破坏不足蛔虫卵子趋向于具有多个蛋白质性的层，粪便样品中天然的DNA聚合酶抑制剂的存在下[27]，和贮存过程中DNA的可能降解。我们通过显微镜使用的QIAamp DNA快速粪便MINIKIT DNA提取的第一步骤中观察粒料的滴确认卵子破坏不足。许多完好蛔虫在样本中可以看到ova。

五，结论

这些限制尽管如此，LAMP检测方法的开发蛔虫粪便样本感染是有希望的，可作为一种诊断工具，用于支持目前在资源有限的环境下进行的蛔虫病控制工作，以及评价以化疗为基础的干预措施的有效性。此外，它还可用于控制和消除运动针对的护理点和感染强度低的情况下的蛔虫病诊断。它还可能是疾病流行病学监测和业务研究的有用工具。

更多要点

所有的孩子发现被感染蛔虫或其他土壤传播的寄生虫接受世界卫生组织推荐的标准治疗，剂量为400毫克阿苯达唑[20]在一个合格的临床医生的监督下的单次剂量。粪便样本收集STH感染的诊断是寄生虫调查例行程序，不存在任何风险或造成任何危害儿童参与。

伦理审批

这项研究获得了肯尼亚医学研究所的科学和伦理审查股(SERU)的批准。

利益争夺

作者宣称没有关于本文的发布利益冲突。

作者的贡献

埃丝特A. Shiraho参与样品的采集，分析，以及手稿的起草。Agola L.埃里克和杰拉德M. Mkoji设计的研究和严格审查的文件。易卜拉欣N.姆旺吉，杰弗里M.麦纳，约瑟夫M. Kinuthia，马丁W. Mutuku，罗伯特·姆干比，和杰克逊M. Mwandi辅助数据收集和分析英寸手稿的最终版本是经所有作者。

致谢

这项研究由加拿大大挑战组织提供资金支持。0261-01，致Agola L. Eric和Gerald M. Mkoji，并经KEMRI主任批准出版。特别感谢肯尼亚医学研究所，该研究是在那里进行的。特别感谢也由于DVBD实验室的工作人员,Msambweni县转诊医院,允许作者使用他们的实验室样品处理和优思明哈桑的临床辅助治疗运动。我们要感谢已故的Venny CS Nyambati教授，她在去世前对论文的审阅做出了巨大贡献。最后，作者感谢所有的研究参与者及其父母/监护人。

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