可以在外周血kDNA-PCR取代骨髓的检查内脏利什曼病的诊断吗?

文摘

本研究的目的是评估是否分子(kDNA-PCR)和寄生虫学的诊断外周血(PB)可以取代入侵而痛苦的骨髓(BM)集合的诊断内脏利什曼病(重要)。PB疑似六世患者被寄生虫学的评价和分子技术使用的黄金标准(GS)结合临床、流行病学和检测试纸测试(PB-rK39)结果和BM的寄生虫学的考试。基于GS, 38 32名患者的样本分组:组1,20六世的样本情况下,组2,18 non-VL病例的样本。为了评估寄生虫学的和分子技术在铅、样品检测。从组1 PB kDNA-PCR是积极的在20个样品和19 20 BM kDNA-PCR考试。然而,巴菲外套的寄生虫学的考试是不敏感,能够检测只能从组1 4例。所有样本组2都是消极的。我们的结论是,内脏利什曼病的诊断,外周血不是有用的寄生虫学的考试;然而,分子诊断kDNA-PCR,外周血进行,可能是有用的替代骨髓的寄生虫学的考试。

1。介绍

内脏利什曼病(重要的)已经在88个国家被报道,世界上90%的负担是本地化在印度,巴西,和苏丹(1]。在美洲,六世被称为美国内脏利什曼病(AVL)及其病原体利什曼虫(利什曼虫)infantum(l(l)chagasi,syn)。2]。重要的特点是它的长期性和系统性传播能力(3),它可以是致命的,如果治疗不管理。作出正确的诊断,六世需要使用高度敏感和特定的实验室方法4,5]。在重要的背景下,技术,被认为是黄金标准(GS)的直接显微镜检查骨髓(BM)或脾吸入样本,与观察无鞭毛体涂片(BM-S)和promastigotes孤立的文化(BM-C) [6,7]。最近,rK39检测试纸测试已经包括(8]。虽然脾抽出物涂片显示灵敏度最高,其次是BM抽出物涂片,考试都需要侵入性和风险更大程序(9- - - - - -11]。考虑到相当数量的六世患者儿童和免疫功能低下的患者,最好采取低风险和痛苦的过程,得到了相似的敏感性和特异性率。因此,本研究的目的是评估寄生虫学的是否和分子技术在BC(淡黄色的外套)或执行世行(全血),从外周血(PB)的体积小,可以替代的寄生虫学的检查骨髓(BM),他的收集是侵入性和痛苦,诊断内脏利什曼病(重要)。

外周血(PB)是一种生物材料,可以很容易地收集并用于测试调查六世如高度敏感利什曼虫DNA扩增的PCR进行全血或淡黄色的外套样品4反的)和血清学检测利什曼虫抗体(6]。

使用全血样品(WB)和巴菲外套(BC)患者没有六世,寄生虫学的和分子技术进行评估。这些样本被用来准备涂片(PB-S)和接种NNN中补充了BHI (PB-C)。此外,世行执行kDNA-PCR和公元前样本(PB kDNA-PCR)以及BM样本(BM kDNA-PCR)。这些技术的表现相比GS实验室的技术(PB-rK39;BM-S和BM-C)的结果。

2。方法

2.1。病人

这个研究机构研究伦理委员会的批准(协议编号0006/11)。签署知情同意后,参与者怀疑有重要的来自不同地区的大学参加了巴西圣保罗医院(HC-FMUSP)。从77年样品检测,我们选择38 32名患者的样本的样本BM和PB是匹配的。

2.2。实验室的黄金标准(GS)和重要的情况下的定义

实验室的GS是寄生虫学的技术(直接镜检和文化)的BM样本,除了检测试纸诊断测试(rK39)全血铅样品(PB-rK39)。被认为是一个真正重要的情况下,参与者必须目前的临床试验,流行病学测试和实验的GS之间的至少一个积极的测试。

38个样本32例符合入选标准的研究和分组如下:1:20国集团18真正重要的病例的样本根据临床和流行病学数据与一个积极的结果在至少一个GS实验室的技术。组2:18 16 non-VL病例的样本呈现症状最初兼容六世和GS负面结果的实验室的技术。

2.3。收集和处理的生物样本

BM送气和PB样本在EDTA(3.5毫升)收集管和提交以下诊断程序。

2.3.1。寄生虫学的技术(黄金标准测试时骨髓)

从骨髓涂片染色镜检(BM-S)和外周血样本PB (PB-S)。5毫升的BM和PB样本(WB和公元前1506×g和20000 g×,职责。)被用来准备八个幻灯片涂片。从每个过程(BM、WB PB和BCPB1在20000×1506×g和BCPB2 g) 2准备幻灯片,由Panotico随后染色方法(Newprov即时新城东区、巴拉那河、巴西),一种全新的或Romanowsky染料。他们分析了显微镜(1000 x放大),寻找无鞭毛体和200字段在每个涂片检查(12]。

BM文化(BM-C)和PB (PB-C)与BHI NNN中补充。公元前40毫升BM或同样体积的(1506×g和20000×g)从PB样本接种到2管,包含NNN介质(美国DIFCO),这2毫升的BHI介质添加(美国DIFCO)。管是在25°C和BOD孵化器孵化样本每周分析共30天通过光学显微镜寻找promastigotes [13]。

2.3.2。外周血分子诊断技术(PB)和骨髓(BM)聚合酶链反应:PB kDNA-PCR和BM kDNA-PCR

世行和BC通过离心(1506×g和20000×g)的铅样品以及BM样本提交DNA提取的基因组DNA提取工具(真正的生物技术公司、台湾、中国)从一个初始体积为300μl . DNA样本识别和存储在−20°C。kDNA引物设计在一个守恒的地区利什曼虫sp. kDNA minicircles。正向引物20 (5′-GGGKAGGGGCGTTCTSCGA a - 3′)和反向引物22 (5′-SSSWCTATWTTACACCAACCCC-3′)产生了一对120 -基地-放大产品(14]。

放大进行总量的20倍μ包含100 L ng模板DNA, 50毫米的氯化钾,10毫米的Tris-HCl (pH值8.0),0.2毫米的核苷酸(加拿大安大略省Fermentas,热Fisher), MgCl 1.0毫米₂,0.4μM的底漆,1单位Taq DNA聚合酶(加拿大安大略省Fermentas,热Fisher)。在每个实验中,两个负控制包含无菌水,而不是模板DNA测试。积极的控制婴儿利什曼虫从文化中提取DNA。每个反应进行一个初始变性步骤94°C的5分钟,其次是35周期为1分钟94°C, 58°C 1分钟,72°C, 30秒,最终扩展步骤72°C的5分钟。反应进行的minicycler thermocycler (MJ研究集团/乔丹,魁北克,加拿大)和PCR产品可视化在2% ethidium bromide-stained琼脂糖凝胶通过紫外线透照器(αInnotech集团/αInnotech Multimage,加利福尼亚,美国)。

减少污染的风险,试剂制备和PCR主结构,DNA提取、电泳进行在三个独立的地区。确认放大抑制剂不在,一个片段的人类β球蛋白基因测试在所有的样品15]。

2.3.3。血清学技术

整个PB PB-rK39样本测试的检测试纸工具包使用包含39个氨基酸的肽重组kinesin-like基因中发现的重复l . chagasi。这个测试被广泛用于重要的诊断领域的研究(11]。

2.4。统计分析

确定测试的协议,kappa测试是使用在95%置信区间值≤0.05被认为是重要的。数据分析与统计软件占据12.0版本(占据公司LP,大学城,德克萨斯州,美国)。

3所示。结果

关于GS技术(表1),在组1(20真正重要的样本),我们得到了以下结果:16个样本被BM-S积极,也包括8 BM-C;15被PB-rK39积极(四个寄生虫学的考试是负面的BM),虽然有五个样品,两个HIV阳性的患者,由PB-rK39产生了消极的结果,是积极的BM的寄生虫学的考试。18组2由16 non-VL病例的样本被所有负面的黄金标准技术(BM-S、BM-C和PB-rK39)。这些non-VL 16例的临床随访发现,在大多数的皮肤利什曼病(1)红斑狼疮(2)、前列腺炎(1)肝炎(1)尿路感染(1),干燥综合征(1),淋巴瘤(2),胃溃疡(2),结节病(1),糙皮病(1),咽炎(1),甲状腺功能减退(1),和贫血(1)β球蛋白基因DNA样本都是放大的证明没有放大抑制剂。

根据表1PB kDNA-PCR,表现在全血和淡黄色的外套,是积极的,100%的样本组1 (20/20)。PB-S是积极的(4/20),20%的样本和PB-C负样本。四PB-S阳性样本来自BCPB1(一个淡黄色的外套样品离心机在1506×g)和BCPB2(两个巴菲外套样品离心机在20000×g),另一个在BCPB1和BCPB2(巴菲外套样品离心后测试1506和20000××g g)。值得注意的是这些四个样品是寄生虫学的积极进行分析时直接在相应的全血样品。

分析PB kDNA-PCR和BM kDNA-PCR他们提出的特异性为100%,敏感性为100%和95%,分别为(表2)。

良好的一致性,kappa指数为0,79和0,74年获得(),当PB kDNA-PCR与金本位技术:分别BM-S和rK39(表3)。比较PB kDNA-PCR和BM kDNA-PCR结果显示一个几乎完美的相关性(0.94,)(表3)。

4所示。讨论

在这项研究中PB样本测试替代的入侵和痛苦的过程获得BM样本六世的诊断。Abeijon和Campos-Neto16]调查潜在的无创性urine-based抗原检测试验诊断活动六世。PB样本调查重要的优势之一是,相同的生物材料可以与此同时分析了寄生虫学的,血清学和分子技术与尿液样本。六世患者的主要症状在我们的研究中肝脾肿大,发热和全血细胞减少症提出了所有的病人组1(真正重要的情况下,表1)。他们都是巴西人,来自六世流行地区(2,3]。

关于寄生虫学的调查在外周血中,巴菲外套PB-S检测阳性样本的20%,而所有样品都是积极的全血样品检测时,如预期,因为寄生虫都集中在巴菲外套促进白细胞内无鞭毛体的可视化4]。然而,20%检测BM-S相比非常低,一个黄金标准(80%的积极性)。同样,PB-C没有发现任何积极的样本而BM-C检测到40%。十六20个样品被PB-S负面,这低灵敏度可以用这一事实来解释有寄生虫的骨髓和脾脏样本(6,7),证明他们为什么是重要的黄金标准实验室的调查。在目前的研究中,文化并不是一个敏感的方法与其他技术相比,即使在BM的情况下,这次考试能够证实只有40%真正的阳性样本。除了非常容易污染,文化是耗费时间要求4周发布一个最终结果,已经被其他作者承认(17),在这项研究证实。

根据理想的分子检测的目标利什曼虫,选择kDNA由于大量存在minicircles细胞的寄生虫,大约10⁴每个细胞(副本17]。此外,证明了可行性PB的寄生虫,这是一种生物材料,获得比大英博物馆让我们更容易寻找kDNA PB。然而,不同的寄生虫学的调查PB、分子调查(kDNA) PB巴菲外套不存在差异(BCPB: 1506×g和BCPB: 20000×g)和全血。样品20/20都是积极的。据斯利瓦斯塔瓦等。4)的PCR分析全血或淡黄色的外套准备可能有用的筛选试验。获得的100%的敏感性是PB kDNA-PCR相比,黄金标准技术(BM-S、BM-C和PB-rK39)。通过比较分子和寄生虫学的技术,Ozerdem et al。18与kDNA-PCR]获得更好的结果(29/50或58%)相比,显微镜检查(10/50或20%)血液样本的Giemsa-stained涂片疑似六世的病人。在我们的研究中,PB kDNA-PCR显示出良好的一致性测试物质的快速检测试纸(PB-rK39) (0.74,),这是一个快速和高度敏感的技术,因此,它已被用来作为参考测试。Disch et al。9和安德森et al。19)获得的敏感性为91%(48/53)和92.5% (37/40)kDNA-PCR用来测试时全血铅样品六世,患者经临床和显微镜检查BM或淋巴结样本。弗拉加et al。20.]在PB kDNA-PCR的有效性进行评估,发现一个很好的敏感性(43/45;95.6%),高于发现BM样本:kDNA (41/45;91.1%);涂片显微镜检查(36/45;80%);和文化(12/45;26.7%)。Antinori et al。21)用PCR和获得了敏感性为98.5%(64/65)和95.7%(45/47)在PB和BM,分别再次确认更好的灵敏度PB-PCR(全血)与BM-PCR相比。相比之下,克鲁兹et al。10]发现更高的积极性Ln-PCR BM(24/24)比全血铅(Ln-PCR) (19/24)。

通过免疫层析法测试,由于其灵敏度和速度,PB-rK39可以屏幕六世疑似病例,尤其是在免疫活性的病人。尽管它不是我们的主要目标,有必要加强六世抗体的存在,与临床和流行病学数据,有助于促使医疗决定,但不能区分过去和活跃的感染。为了诊断积极重要的感染PB样本,从免疫活性的或免疫缺陷患者,kDNA-PCR是最合适的。与大英博物馆,还介绍了利用在一个容易接受生物样品。尽管如此,寄生虫学的检查外周血(PB-S和PB-C)不能替代骨髓的寄生虫学的考试(BM-S和BM-C)。

总之,kDNA-PCR小卷的PB进行,全血或淡黄色的外套,与重要的黄金标准测试显示一个好的协议。因此外周血可能是有用的替代侵入性和痛苦的过程获得骨髓样本内脏利什曼病的诊断。

伦理批准

伦理委员会的HCFMUSP-BRASIL(给定的数字CAPPesq 0006/11)批准了这项研究。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢教授西尔玛美国英语好对她帮助校正和Edite h . y . Kanashiro硕士,for providing help in the parasitological examination, the “Laboratório de Micologia (LIM-53)” and the “Laboratório de Bacteriologia (LIM 54)”. The research project was conducted fully sponsored by FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) with Grant no. 2010-50304-8 under the supervision of Lucia Maria Almeida Braz.

引用

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