锥虫属感染率在舌蝇肯尼亚马库埃尼县Mtito Andei Division的物种

摘要

非洲动物锥虫病(AAT)由采采蝇周期性传播(舌蝇是非洲热带地区畜牧业生产的主要障碍。本研究的目的是确定锥虫的感染率舌蝇肯尼亚马库埃尼县Mtito Andei Division的物种。采采蝇的物种,g . longipennis和苍白球绦虫，并从解剖的内脏器官(鼻、唾液腺和中肠)中分离出DNA。然后使用内转录间隔引物对DNA进行巢式PCR检测，并通过琼脂糖凝胶电泳鉴定单个锥虫种。在该地区捕获的117只蝇中，普通蝇39只(33.3%)，非普通蝇78只(67%)。苍白球绦虫所占比例最高，为58%g . longipennis是42%。锥虫总体感染率在所有非一般舌蝇spp.感染率为11.53%g . longipennis其中，感染率最高，为23.08%苍白球绦虫感染率为5.77%。t .间日疟原虫最具传染性(10.26%)的是t . congolense(1.28%)。平均表观密度与感染率呈显著正相关()，确认该参数作为AAT传播风险指标的重要性。

1.介绍

非洲动物锥虫病(AAT)是一种由Kinetoplastida原虫属寄生虫引起的严重牲畜疾病锥虫属并由采采蝇循环传播(舌蝇)，并由其他食血苍蝇(例如Tabanus，Haematopota，Stomoxys,Chrysops［1，2]它是撒哈拉以南非洲畜牧业生产的一个主要制约因素，因为它妨碍了充分利用土地养活迅速增长的人口[3.]．随后，这就加剧了受影响地区的贫困、饥饿和欠发达[4]．因此，这种疾病是地方病地区农业和经济发展的主要障碍[5，6].AAT及其病媒发生在撒哈拉以南非洲的大片地区，其发生与生物病媒平行[7，8]．该病的流行病学和对牲畜特别是牛生产的影响主要取决于该病及其病媒在疫区的流行和分布，以及受感染蝇在采采蝇种群中的比例[9]．采采蝇的生态分布取决于气候、植被、水和血餐(人类和动物)的存在，但采采蝇大多在农村地区发现[10]．

AAT造成的经济损失每年大约超过15亿美元。11]．采采蝇在约1000万公里处出没²非洲的肥沃土地分布在36个国家，约700万公里²如疾病得到控制，受感染的土地是否适合混合耕作[11]．在非洲发现的1.65亿头牛中，由于疾病限制，只有1000万头牛在采采蝇带发现，这些是产量最低的品种[12]．肯尼亚经济主要以农业为基础，农业占国内生产总值(GDP)的约24%，就业占70% [13]．肯尼亚只有7%的土地适合作物生产，另外5%的土地可以在雨水充足的年份维持作物生长[13]．其余的土地是干旱和半干旱的，构成了不适合种植作物但适合饲养牲畜的牧场[13，14]．

Mtito Andei位于内罗毕东南约290公里的Makueni县。该地区主要由干旱和半干旱地区组成，畜牧业是该地区的主要支柱[14]．该地区有动物锥虫病的历史，因为它被感染苍白球绦虫，g . longipennis,g . brevipalpis［14，15]．由于农业潜力低和采采蝇泛滥，该地区直到20世纪30年代才有人居住。评估流行、病媒热点和感染状况可有助于制定适宜的采采蝇和锥虫病控制措施。然而，目前还没有关于姆蒂托安代省锥虫病流行情况的准确信息。这是因为以前的数据是通过显微镜收集的血液涂片、解剖和微红细胞压积技术，这些技术不太敏感[16，17]．此外，这些方法不能识别未成熟和混合感染，导致检测水平低[18]．这项研究的目的是提供关于锥虫流行的额外信息舌蝇Mtito andai的物种。

2.材料和方法

2.1。研究地点的描述

这项研究是在位于内罗毕东南约290公里的Makueni县的Mtito andai Division进行的。研究区域被划分为五个村庄，分别是Nthunguni、Iviani、Kyusyani、Ngiluni和Kamunyu(图)1）.该地区海拔高度从600米到1100米不等。该地区的特点是草原草原的边缘农田，大部分是低洼的、平缓向东倾斜的平原，偶尔被季节性和常年河流打断[20.]．该地区的气候是典型的半干旱气候，年平均降雨量为600毫米，年平均气温为23°C。20.]．降雨是双峰式的，长雨发生在3月至5月，短雨发生在11月或12月至1月初。二月至三月的最高平均气温为摄氏32至33度[20.]．

2．2.研究设计

本研究采用简单随机抽样的横断面研究方法，测定了当地锥虫感染率舌蝇Mtito andai Division的种。用公式确定样本量，如中所述[21),为所需的最小样本量，为置信区间，是研究中预期患病率的比例，是100% -,为在0.05处的期望精度。

２．３．采采蝇的采集与鉴定

采采蝇诱捕工作于2012年4月至5月进行。选择这段时间是因为这是雨季，因此预计会有更多的苍蝇[1]．在每个村庄使用5个双锥形陷阱进行诱捕，这些陷阱部署在Mtito Andei河和Athi河附近以及附近的植被中。诱捕器放置在地理参照地点，并以丙酮和牛尿作为诱饵，以提高诱捕效率[22]．陷阱设置在不同的植被上，每隔100米设置一个固定的间隔，并放置在树荫下，以避免苍蝇因高温而过度死亡(图)2）.为了防止杆子上的蚂蚁向采集笼爬去，每根杆子上都涂上了油脂。所有被捕获的苍蝇都被计数;在进行解剖前，先用传统的识别键来确定它们的性别和种类[23]．

２.４.视密度(AD)测定

表观密度(AD)是对蝇类密度的估计，以每个捕蝇器每天捕获的蝇类数量表示．计算公式如下: 在哪里为蝇类总数，是有效陷阱的数量，和为捕蚊器运作的天数[1]．

然后计算每个诱捕点的平均AD，以获得该地区采采蝇分布的数据。

2．5．锥虫的鉴定舌蝇spp。

2.5.1。采采蝇解剖

用乙酸乙酯将果蝇固定在标本管底部的棉絮中。对新鲜固定的苍蝇进行解剖，因为在死的干苍蝇中不太可能发现锥虫[23]．解剖78只非一般蝇，摘除中肠、唾液腺和喙，显微镜下观察锥虫的存在。非一般蝇是通过腹部出现的黑色或棕色来识别的，这表明它们最后一次吸血[23].新鲜固定的苍蝇通过在70%乙醇中短暂浸泡进行表面消毒，然后在干净的纸巾上干吸，然后在生理盐水中解剖[22]．为避免交叉污染，解剖器械用3-5% (w/v)次氯酸钠浸泡约2分钟消毒，然后用蒸馏水广泛冲洗，最后用生理盐水浸泡[22].将每只苍蝇的解剖器官（中肠、长鼻和唾液腺）转移到1.5个器官中 含120毫升的微量离心管 μL组织溶解缓冲液(来自Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒)。然后将组织保存在−20°C，直到进一步处理。

2.5.2。锥虫的DNA提取

根据制造商的说明，使用Qiagen DNeasy血液和组织试剂盒提取DNA。二十(20)微升(μ在解剖组织中加入蛋白酶K L)，在56℃恒温箱中孵育过夜，直至组织完全消化。裂解液漩涡15秒和200秒μ向样品中添加1 L缓冲液AL，然后旋转以混合内容物。200 μ加入L的无水乙醇，进一步旋转充分混合，移液至DNeasy微型旋转柱中，置于2ml收集管中。柱以8000转/分离心1分钟，与收集管一起弃用。DNeasy微型旋转柱放置在一个新的2ml收集管和500μ加入洗涤液AW1的L。然后以8000转/分的速度离心1分钟，将液体与收集管一起排出。旋转柱再次放置在一个新的收集管和500μ加入洗涤液AW2的L。柱以14000 rpm离心3分钟。将流过的液体和收集管丢弃，将旋转柱放置在一个干净的1.5 mL微离心管中，然后加入30μL洗脱缓冲液(AE缓冲液)。室温孵育1分钟，8000 rpm离心1分钟，洗脱结合的DNA。从样品中提取的DNA使用纳米滴分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc.)进行定量，其纯度通过测量波长为260和280纳米的吸光度来确定。

2.5.3.PCR扩增和DNA分析

所用PCR寡核苷酸引物如表所示1．引物由Bioneer公司合成，由肯尼亚国际牲畜研究所(ILRI)提供。

这些引物旨在扩增核糖体DNA (rDNA)的内部转录(ITS)区域，这一区域在锥虫物种中大小不同，但锥虫成员除外，并能够根据其扩增片段区分锥虫．ITS 1和ITS 2(外部引物)扩增rDNA的保守区域、小亚基(SSU)和大亚基(LSU)，如图中黑色箭头所示3.而ITS 3和ITS 4(内引物)扩增rDNA的非编码间隔区，用白色箭头表示。

30例均进行PCR扩增μL反应体积包含最终浓度的1x Invitrogen PCR缓冲液，3.5 mM氯化镁₂(Promega)， 0.2 mM dNTPs混合，1.25U/μL Invitrogen Taq, 100 ng/μ正反引物各为L, 5μL为锥虫DNA模板。一套纯化的基因组DNAt . brucei brucei（T.b.b.），t . congolense基利菲(T.c.k)t . congolense所有PCR检测均以Savannah (t.c.s.) IL1180株为阳性对照，阴性对照为无核酸酶水。第一轮反应采用外引物ITS 1和ITS 2。循环条件为:95℃初始变性1个循环7min, 94℃初始变性1 min, 55℃初始变性1 min, 72℃初始变性2 min，共35个循环。最后在72°C下拉伸5分钟。PCR在Bio-Rad热循环仪上进行。在第二轮反应中，外层引物被内部引物(ITS 3和4)和5取代μ第一轮PCR产物的L作为DNA模板。第二轮反应的循环条件如初级扩增所述。为了分析扩增物，10 μPCR产物的L在2%琼脂糖凝胶中80伏特溶解45分钟，溴化乙啶染色后在紫外透射镜下观察凝胶。

2.6。数据分析

通过比较其DNA片段的分子大小与记录的锥虫种条带大小，确定了传染性锥虫[19]．然后利用这些数据计算锥虫的感染率和流行率舌蝇采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)， 95%置信区间。采用卡方检验确定感染率与蝇性和病媒种类的相关性。并进行相关分析，以确定感染率与表观密度之间是否存在显著相关关系。

3.结果

３．１．矢量分布

在这一地区被困的117只苍蝇中，苍白球绦虫所占比例最高，为58%g . longipennis有42%。捕获的采采蝇中，一般采采蝇39只(33.3%)，非一般采采蝇78只(67%)。在Kamunyu区域,g . longipennis是当时最流行的物种苍白球绦虫占主导地位的Ngiluni、Kyusyani、Iviani和Nthunguni（图4）.

除了舌蝇该地区还栖息着机械苍蝇，如Tabanus种虫害和Stomoxysspp。虻占了绝大多数Stomoxines各诱捕点的诱蝇密度(FTD)均为0.11Stomoxysspp的FTD为0.02。在所有的苍蝇捕捉中，舌蝇spp在所有窃听点中最普遍，而Stomoxyssp.占百分比最低，仅在Kyusyani地区有记录(图)5）.

３.２．表观密度(广告)

各组间的视密度(AD)无显著差异舌蝇在五个捕蝇地点所捕到的蝇类数目，根据地点的不同，由0.1至0.5只不等，平均每个捕蝇器每天捕到0.3只(图)6）.

３．３．锥虫的鉴定舌蝇spp。

使用ITS引物扩增锥虫的预期条带大小见表2．锥虫的分子鉴定t .间日疟原虫和t . congolense森林舌蝇spp.的DNA扩增子分别符合611 bp和1513 bp的预期大小，成功2）.扩增片段为阳性对照t . brucei brucei，t . congolense基利菲,t . congolense萨凡纳的规模也在预期范围内2）.

数字7显示成功扩增锥虫物种DNA片段的电泳产物样本t .间日疟原虫(样本1和5)和阳性对照t . brucei brucei（T.b.b.），t . congolense基利菲(T.c.k)t . congolense萨凡纳(t.c.)。“M”代表100碱基对分子标记(Promega)， 6为阴性对照。样本2、3和4检出锥虫阴性。

3．4．感染率

采用巢式PCR和凝胶电泳分析了78只蝇类中锥虫的感染情况苍白球绦虫和g . longipennis分别为5.77%和23.08%(表3.).整体感染率舌蝇spp为11.53%。有一个重要的不同人群锥虫感染率的差异舌蝇物种。感染t .间日疟原虫是两种采采蝇中最普遍的(10.26%)t . congolense患病率为1.28%(表3.）.

有显著(不同诱捕点间感染率差异最大，卡文游感染率最高，为6.41%，九州次之，为2.56%。Ngiluni和Iviani的感染率为1.28%，Nthunguni的感染率为0%。

表观密度与感染率呈正相关，相关系数为0.95。例如，Kamunyu地区记录了最高的表观密度和最高的感染率。

有显著的差异在里面t .间日疟原虫和t . congolense感染在雄蝇和雌蝇之间。对于这两个t .间日疟原虫和t . congolense，男性的感染率高于女性，整体感染率分别为13.95%及8.57%(见表1)4）.

4.讨论

4．1.Mtito Andei的向量分布

这项研究发现，在分布上存在差异苍白球绦虫和g . longipennis在该地区。g . longipennis是在Mtito Andei捕获的唯一一种蝇类，已知在乌干达、坦桑尼亚和埃塞俄比亚等其他东非国家也有发生[2，24]．这一种比其他采蝇属的采采蝇更容易在干燥的地区发现，因为蛹含有大量的水分储备和低渗透的蛹膜，这有助于它在恶劣的环境条件下生存[25，26]。这种苍蝇的典型栖息地是相思林地附近的干荆棘灌木丛河岸灌木丛，休息地点最好是树干、原木和多段树的树枝下面的阴凉处[24]．Mtito Andei提供了所有这些生态条件，因此适合这种苍蝇。

苍白球绦虫是广泛分布于东非的morsitans属蝇类，是动物锥虫病的主要病媒[27]．主要分布在Mtito Andei河和Athi河附近，因为它喜欢茂密的常绿植被、较重的树荫和湿润的栖息地，这些栖息地靠近河岸灌丛[22]．它也存在于其他东非国家，如乌干达、埃塞俄比亚和索马里[2，28]．先前的研究表明苍白球绦虫可能是向量锥虫属b rhodesiense在肯尼亚西部和乌干达布索加区造成非洲人锥虫病(HAT)，因为这种寄生虫已从病媒中分离出来[24，27]．

在Mtito Andei发现的机械矢量中，虻占了绝大多数Stomoxines而后者仅在九州地区有记录。这一发现证实了[1]，机械蝇的种类构成很大程度上取决于取样地点和取样地区的环境及气候条件的重大差异。在巴西等其他地区也发现了类似的现象[29]．该地区存在的机械蝇不能被低估，因为它们已被证明是机械传播的t .间日疟原虫和t . evansi［30.]，并可对采采蝇低密度地区的季节性流行模式负责[1，31]．

4．2．明显的密度舌蝇spp。

本研究未发现在视密度(AD)上有显著差异舌蝇在五个诱捕地点捕获的物种。尽管该地区采采蝇的平均AD较低(每个诱蚊器每天0.3只)，但采采蝇可能既是寄生虫的生物传播媒介，也是寄生虫的宿主，而机械媒介则在高密度时期将其放大。除了放大这种寄生虫，机械蝇还可以通过移民将其引入非流行地区。

4．3．锥体虫感染率

本研究记录了较低的总体锥虫感染率，为11.53%。在肯尼亚海岸的一项研究中也获得了类似的结果，该研究报告称，Ukunda、Diani、Muhaka、Shimba hills和Mwalewa的锥虫感染率分别为12.62%、7.24%、9.50%、7.86%和7.97% [32]．在布基纳法索Mouhoun河进行的一项可比研究报告称，在筛查锥虫感染的1423只解剖蝇中，总体感染率为10% [33]．此外，感染率t . congolense和t .间日疟原虫分别为7.6%和2.25%。以前的研究也表明，在实地捕捉的蝇类中，锥虫感染的流行率很低(约10%)，这与一般易感蝇类中各种抑制因素的相互作用有关[34]．此外，锥虫的建立和成熟过程都存在一些障碍，因此只有一小部分感染达到成熟[24]．此外，这些锥虫可能缺乏分化，触发或可能被载体的免疫反应抑制[35，36]．

锥虫总体感染率g . longipennis显著高于g . pallidipes。然而，在肯尼亚沿海地区，据报告，该国的感染率较高苍白球绦虫(5.7%)比g . longipennis(0.2%) [37]两种采采蝇在安第斯山脉的感染率差异可能是由于取食偏好、环境因素和寄主范围的差异[11，33]．研究还发现，可感染采采蝇的寄生虫数量、对采采蝇的寄生虫感染性以及采采蝇的品系或亚种也影响采采蝇的感染率[38]．此外，采采蝇在进食感染性血液时的营养状况也会影响它们获得锥虫感染的能力[9]．此外，也有报道称，低载体能力是由于在脑室前区和中肠中攻击素表达水平较高[39，40]．这种特性在苍白球绦虫这可以解释感染率的差异苍白球绦虫和g . longipennis［34]。在物种内，感染率也各不相同，这归因于个体宿主因素。例如，苍蝇对病毒的脆弱性t . brucei感染被证明是由于与细胞内立克次体样有机体(RLOs)存在相关的母系遗传特征[41]．携带这些RLOs和其他同时感染如细菌、真菌和病毒的中肠采采蝇比不携带锥虫的采采蝇更容易感染锥虫[41- - - - - -43]．

t .间日疟原虫感染在所有诱捕地点都比在诱捕地点更普遍t . congolense．在赞比亚的卢安瓜山谷也有类似的结果[44]．然而，在Côte d ' ivory，t . congolense被发现更具传染性(90%)与t . simiae和t .间日疟原虫对139只显微镜下阳性蝇类中的50只进行了进一步的物种特异性引物分析t . congolense亚型,t . simiae,t .间日疟原虫［45]．越高t .间日疟原虫感染可归因于大约10天的发育周期很短，完全在喙内完成。为t . congolense和t . brucei预计发展期分别为14天和30天[46]．此外，与喙相比，采采蝇中肠是一个充满敌意的环境，它含有能够杀死锥虫的中肠凝集素在活的有机体内［47]．中肠也有蛋白质分解消化酶、强效抗菌物质[34]、前酚氧化酶级联和免疫分子，如凝集素，当遇到微生物时，凝集素有助于免疫效应基因的表达，并介导肠道和脂肪体内容物之间的通信[48]．所有这些免疫分子的存在可以阻止t . congolense和t . brucei因为这些寄生虫在其生命周期中使用中肠;因此，检测出低感染率。众所周知t . congolense亚型寄生虫通常较低，寄生虫血症较低t .间日疟原虫［38]因此，苍蝇在吸血过程中很少接触到这种稀少的寄生虫，这可能是寄生虫无法在节肢动物媒介中建立的原因。

这项研究表明，男性的感染率高于女性。在尼日利亚，男性的感染率也高于女性[49]．一些研究表明，雌蝇的感染率应该高于雄蝇，因为它们的寿命比雄蝇长，因此它们感染的几率更高[50]．然而，这种关系尚未建立。相比之下，其他研究则解释说，男性比女性更容易被感染，因为他们在性活动和竞争中比女性参与更多[51]．在田间采采种群中，无论是男性还是女性的感染率较高，本研究未发现性别差异有统计学意义。

表观密度与感染率呈极显著正相关(）.在布基纳法索Mouhoun河流域也报告了类似的观察结果，那里的感染率与表观密度呈正相关() ［1].该观察结果验证了该参数作为AAT传输风险指标的有效性。

5.结论

本研究证实采采蝇在维持锥虫寄生虫的生存中起着重要作用，并得出结论:持续减少Mtito andai司采采蝇的数量可大大降低AAT的患病率。这项研究还表明，宿主因素在AAT的流行病学中与较高的锥虫感染率同样重要g . longipennis比苍白球绦虫但病媒的性别不那么重要。此外，研究表明，病媒的表观密度是AAT传播风险的良好指标。因此，这项研究肯定了针对生物病媒(舌蝇)、机械病媒(舌蝇)设计控制策略的重要性。Tabanus和Stomoxys和锥虫寄生虫。

6.建议

（1）既然都t . congolense和t .间日疟原虫对牛和其他反刍动物具有致病性，后者引起急性出血综合征[52]，重要的是，通过应用病媒控制策略，结合对家畜的治疗，在姆蒂托安第斯进行大规模的舌蝇综合控制，因为这些动物可以作为舌蝇的再感染源。（2）为了制定有效的锥虫病控制方案，应在该地区开展监测研究，以确定家畜中锥虫的流行情况。（3)应在不同季节进行昆虫学调查，以了解病媒的季节动态和相关锥虫病风险。潜在病媒的季节变化数据可以整合到流行病学模型中，以便更好地理解在Mtito Andei中周期性和机械性病媒的相对重要性。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

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