文摘

锥虫属evansi和锥虫属间日疟原虫,这是动物锥虫病的主要病原体在委内瑞拉,显示一个很高的免疫大。生产以来t .间日疟原虫这个寄生虫抗原是一个限制因素是很难传播在实验动物模型中,我们的目标是识别和隔离抗原t . evansi与交叉反应的t .间日疟原虫。在这里,我们使用了委内瑞拉t . evansiTEVA1隔离准备总寄生虫溶解产物及其相应的胞质和膜分数。为了提取t . evansi积分膜蛋白,进一步提取颗粒部分首先Triton x - 100,然后与十二烷基硫酸钠。后丢弃胞质和特里同x - 100可溶性蛋白质,我们采用线性蔗糖梯度离心沉降的部分净化钠十二烷基sulfate-solubilized蛋白质从海神x - 100抗微粒的一部分t . evansi。浓缩池包含多肽乐队中获得明显的分子质量27 kDa, 31 kDa, 53 kDa,被反t .间日疟原虫从实验和自然感染牛的抗体。

1。介绍

Mammal-infecting锥虫属物种组成部分Stercoraria Salivaria。锥列为Stercoraria发展后向量消化道的一部分,是通过粪便传播。相比之下,生物的传播锥列为Salivaria昆虫港发生的寄生虫的唾液腺,尽管也会发生机械传动。Salivarian锥包括亚类Tejeraia(锥虫属rangeli),Duttonella(锥虫属间日疟原虫),Nannomonas(锥虫属congolense),Trypanozoon(锥虫属brucei, Trypansoma evansi,锥虫属equiperdum),Pycnomonas(锥虫属是)。

交叉反应之间的进化密切寄生虫一般探索要么防止假阳性的解释测试(1,2)或利用他们通过种间检测试验(3]。salivarian锥体虫抗原相似性已经知道了很长一段时间;事实上之间的交叉反应t . congolense,t .间日疟原虫,t . evansi和t . brucei种虫害屡次报道(4- - - - - -6]。甚至单克隆抗体为特定的诊断开发salivarian锥体虫物种已被证明一起交叉反应(7,8]。最近,salivarian相似性和stercorarian锥体虫也被记录(9),显示之间的一个重要大t . evansi和t . cruzi。

T。间日疟原虫和T。evansisalivarian寄生虫物种导致动物锥虫病主要在牛和马,分别。他们是在委内瑞拉动物锥虫病的主要病原体。因为它更方便生产t . evansi在啮齿动物变得容易,比吗t .间日疟原虫不使用t . evansi原油纯化抗原或交叉反应抗原蛋白的检测t .间日疟原虫感染牛已经调查了过去二十年(3,10- - - - - -12]。此外,使用t . evansi抗原的诊断t .间日疟原虫感染是一个有趣的替代的实验室没有生产设施t .间日疟原虫抗原。由于寄生细胞表面是一个直观的地方探索潜在抗原蛋白,我们部分纯化的十二烷基硫酸钠(SDS)——从委内瑞拉可溶性蛋白质膜相关积分t . evansiTEVA1隔离,又名TeAp-N / D1 [13),通过使用线性蔗糖梯度离心沉降的。我们获得的分数包含t . evansi多肽表观分子量为27000、31000和53000年,被反t .间日疟原虫抗体从受感染的牛。

2。材料和方法

2.1。材料

试剂从下列来源:购买anti-mouse免疫球蛋白辣根过氧化物酶共轭,中等分子量蛋白质标记,Promega;anti-rabbit免疫球蛋白辣根过氧化物酶共轭,anti-bovine免疫球蛋白辣根过氧化物酶共轭,anti-bovine免疫球蛋白碱性磷酸酶共轭,anti-equine免疫球蛋白碱性磷酸酶共轭,diaminobenzidine (DAB),纤维deae纤维素,苯甲脒,碘乙酰胺,L-trans-epoxysuccinyl-leucylamido (4-guanidino)丁烷(e - 64),亮抑酶肽,苯基甲基磺酰氟(PMSF)σ;Gibco BRL prestained高分子量蛋白质标记;5-bromo-4-chloro-3 indolyl磷酸(BCIP)硝基蓝四唑(电视台),蛋白质测定染料试剂集中注意力,牛血清白蛋白(BSA),广泛分子量标准和硝化纤维素膜(0,45μ孔隙大小),BioRad。所有其他化学物质都是最高的质量等级。

2.2。抗原的来源

我们使用一个委内瑞拉现场隔离t . evansi名叫TEVA1 [13]。低温贮藏t . evansi来华的血液接种腹腔进入成人白化大鼠(Sprague-Dawley)。当寄生虫的数量达到≥106锥/毫升血液提取使用0.5米从老鼠通过心脏穿刺EDTA抗凝。寄生虫被使用纤维deae纤维素阴离子交换色谱法纯化柱(14),一直冻结在−80°C,直到进一步的使用。

2.3。隔离的t . evansi颗粒分数

纯化t . evansi寄生虫(~ 5×109在冰上)提取,通过声波降解法(4周期7瓦,30秒,之间有一段2分钟休息)使用16毫升的裂解缓冲(5毫米Tris-HCl缓冲区(pH值8.0)包含苯甲脒1毫米,1毫米PMSF, 10毫米EDTA, EGTA 10毫米,1毫米碘乙酰胺,20μ20 M e - 64,μ米亮抑酶肽)。寄生虫匀浆(H)离心机在100000 g×30分钟,在4°C,包含颗粒的颗粒分离比例(P)的上层清液澄清可溶性分数(S)。这个过程被重复三次完全清洗所有可溶性抗原从剩下的寄生虫膜分数。为了溶解这个分数,P受到三连续提取物与含有2%的裂解缓冲Triton x - 100。离心步骤在100000 g×30分钟,在4°C,采用单独的上层清液( 从中性detergent-washed丸)( )。

2.4。增溶的SDS海神x - 100洗寄生虫颗粒分数

海神x - 100洗颗粒resuspended裂解缓冲含有4% SDS和均质通过23号针。离心步骤在100000 g×30分钟,在室温下,采用分离的上层清液SDS从阴离子洗涤剂洗颗粒(P)SDS)。SDS浓度减少到2%,得到的上层清液样本,分析前的多肽和抗原成分SDS-polyacrylamide凝胶电泳(SDS - page)和免疫印迹,分别。

2.5。部分纯化的抗原t . evansiSDS-Solubilized颗粒部分蔗糖梯度上使用区域沉积

线性10 - 30%和5 - 20%蔗糖分析梯度(4毫升)准备在100毫米Tris-HCl (pH值8.0),0,2毫米EDTA, MgCl 0, 4毫米二硫苏糖醇,10毫米20.3米,NH4Cl, 2% SDS。加载寄生虫SDS-solubilized颗粒分数后样品到蔗糖梯度,在200000×g离心管,在室温下,18 h。分数是通过收集管的底部,和一个整除每个分数的分析是运用sds - page及免疫印迹使用血清t . evansi来华的马和t .间日疟原虫来华的奶牛。

2.6。动物血清

两个健康的马实验感染低温贮藏血液样本包含~ 106寄生虫的不同t . evansi隔离。第一匹马与TEVA1接种t . evansi隔离(H-TEVA1),第二个马是接种TeAp-ElFrio01隔离(13)(H-TeApEF)。三个健康的牛感染一个包含~ 10的低温贮藏血液样本6寄生虫的liem - 176t .间日疟原虫隔离(15](b - 103 b - 173,和b - 303)。实验感染动物的血液样本被每一天,两个月时间,血清冷冻贮藏−20°C和作为积极的控制。表1总结了从受感染动物实验获得的血清样本。

表1
通过实验感染的动物血清的识别。

此外,从颈静脉血样采集动物寄生虫学的消极和trypanosome-infected字段。马和牛锥的存在的循环检查的microhematocrit技术(16),被诊断为积极或消极的锥虫病的间接ELISA,使用澄清抗原分数t . evansi作为源的抗原(10,17]。血液凝固后在室温和离心分离,每个血清冷冻贮藏在−20°C和用于immunodetection。表2总结了从野外动物获得的血清样本。

表2
从野外动物血清的识别。

2.7。其他的程序

据布拉德福德(蛋白质浓度测定18),使用牛血清白蛋白作为蛋白质标准。p64抗原,这是可溶性的t . evansi变体表面糖蛋白(VSG)显示之间的大t . evansi和t .间日疟原虫纯化是描述Uzcanga et al。11]。纯化p64是用于生产多克隆抗体对小鼠腹水(12]。多克隆抗体anti-VSG也兔血清中产生,下面描述的过程哈洛和车道19]。进行sds - page 1.5毫米厚板凝胶含有12个或15%聚丙烯酰胺(20.]。Coomassie蓝色r - 250用于蛋白质染色。免疫印迹分析;蛋白质在凝胶electrotransferred硝基过滤器(21]。immunodetection,过滤器与牛血清孵化(稀释1:100)或特定anti-VSG多克隆抗体生成的老鼠(稀释1:5000)或兔子(稀释1:150)。床单被孵化与适当的碱性phosphatase-conjugated稀释或辣根peroxidase-conjugated二级抗体牛,老鼠,兔子或免疫球蛋白,根据情况,以下供应商的指示。最后,多肽乐队被电视台和可视化BCIP碱性phosphatase-conjugated抗体使用时,或轻拍和过氧化氢辣根peroxidase-conjugated抗体工作时,根据提供者。包含分子量蛋白质的混合物的车道标记包含在污点来确定明显多肽乐队的大小。

3所示。结果

图1(一)说明了Coomassie蓝染色多肽概要,sds - page分离各种后获得的t . evansi分数(H, S, P, 和 )。正如图中所看到的,各种各样的多肽乐队拥有广泛的大小获得不同分数。然后,从牛血清实验感染t .间日疟原虫是用来识别TEVA1t . evansi表现出大的抗原多肽t .间日疟原虫通过免疫印迹。正如之前报道的(10),一系列的交叉反应抗原分子质量明显从大约10000 - 110000道尔顿是明显的t . evansi匀浆(图1 (b))。这两个t . evansi分数,S和P,也含有抗原显示大t .间日疟原虫(图1 (b))。此外,64 kDa多肽乐队(p64)是主要的多肽的物种t . evansi在H, S和P分数,被牛反t .间日疟原虫抗体。有趣的是, 样本高纯度64 kDa多肽反应表现出大的乐队t .间日疟原虫,但没有p64被观察到的 示例(图1 (b))。此外,一系列的交叉反应抗原多肽乐队耐中性洗涤剂的治疗和保持的 样本。最密集的抗原产生的模式表明,乐队与多肽乐队迁移大约在68 - 70 kDa, 52-55 kDa,第27 - 31和kDa,分别(图1 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
分析t . evansi抗原多肽显示大的乐队t .间日疟原虫。纯化t . evansi寄生虫是均相生成全细胞提取(H),这是离心机分离颗粒的可溶性部分(S)分数(P)。然后,P是提取2% Triton x - 100和海神x - 100可溶性部分( )是分开的剩余颗粒( 通过离心分离)。(一)Coomassie蓝染色。(b)与血清免疫印迹发达b - 303(表1)。M =蛋白质分子量标记。

此前,Uzcanga et al。11]证明了主要64 kDa之间的交叉反应抗原t . evansi和t .间日疟原虫,从TEVA1纯化t . evansi委内瑞拉隔离,VSG的可溶性形式表示。64 kDa乐队获得H, S, P, 寄生虫分数被确认是相同的可溶性形式VSG (p64),通过使用特定anti-VSG多克隆抗体,在兔子和老鼠(图中成长起来的2)。如预期的结果如图1 (b),没有VSG仍在 分数与特里同治疗后x - 100(图2)。有趣的是,一些多肽乐队仍在 分数,包括大约68 - 70 kDa的多肽,52-55 kDa,第27 - 31和kDa, immunorecognized由牛血清实验和自然感染t .间日疟原虫(图3)。这些结果表明,这些交叉反应抗原乐队寄生虫积分蛋白质可能是局部膜microdomains Triton x - 100年的抵抗力。也看到图中(车道7 - 9),从马血清实验和自然感染t . evansi比反识别相同的抗原多肽乐队t .间日疟原虫抗体。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
64 kDa乐队是丰富的 分数对应于之前报道p64抗原(10,11),这是部分负责之间的交叉反应t . evansi和t .间日疟原虫。p64抗原在寄生虫匀浆(H)、可溶性(S),特里同x - 100可溶性( )分数。没有获得p64在生成的颗粒治疗后特里同x - 100 ( )。(一)免疫印迹在兔血清中使用多克隆抗体anti-p64准备。(b)免疫印迹在小鼠腹水中使用多克隆抗体anti-p64准备。M =蛋白质标记。

图3
的识别t .间日疟原虫交叉反应抗原的 的一部分t . evansi。一个整除的 分数(350μ克总蛋白)是由电泳分离制备15%聚丙烯酰胺凝胶板。sds - page后,蛋白质electrotransferred硝基,污点是条切成3毫米。条包含 分数是使用血清b - 303(巷1),B-LC31(巷2),B-LE14(巷3),B-P13(巷4),B-LC43(巷5),B-LL19(巷6),H-TEVA1(巷7),H-TeApEF(巷8),和h n / D(巷9)。血清中描述表1和2。

由于SDS强阴离子洗涤剂,能够瓦解膜结构和变性最完整的膜蛋白, 分数是reextracted包含4% SDS裂解缓冲,以溶解抗原蛋白。图4显示了一个SDS - page分离的多肽的乐队与SDS治疗(S被释放SDS),和那些留在最后的颗粒(SSDS),离心后。在4% SDS的存在,大多数蛋白质可溶性(见年代SDS分数),明显降低多肽的乐队在P明显SDS示例(图4)。多肽分子质量明显从< 25000 > 150000 Da被观察到的t . evansi年代SDS分数(图4)。的大小主要多肽乐队中包含的寄生虫SDS分数在图中表示。


图4
溶解的蛋白质中 使用SDS分数。的t . evansi 分数是均质使用4% SDS。离心后,上清液(SSDS从SDS-washed颗粒(P)是分开的SDS)。SDS浓度减少到2%,S的多肽组成SDS和PSDS分数是评估通过sds - page。显示Coomassie蓝染色的凝胶。M =蛋白质分子量标准。

以分离t .间日疟原虫交叉反应抗原,t . evansiSDS-solubilized颗粒分数受到超速离心法在蔗糖梯度区域沉积。一个200μL整除的年代SDS样本加载在一个4毫升线性10 - 30%蔗糖梯度。离心后,47 80分数μL每个收集管的底部。整除的每个部分由sds - page分析,从自然使用血清免疫印迹t .间日疟原虫来华的牛。大量的蛋白质分数24至47(图中分离了出来5),几乎没有蛋白质被认为在第一个23分数(数据未显示)。如下图通过sds - page中,大多数的陈腐的多肽乐队的中低分子量。免疫印迹分析显示一个主要打53 kDa的多肽乐队出现在所有的蛋白质含有分数(图5)。53 kDa的交叉反应抗原显示分数37岁至39岁之间的峰值。虽然分数30 - 36与其他nonantigenic多肽乐队受到了污染,这些分数是唯一的交叉反应抗原53 kDa多肽乐队。特别是,分数35和36在53 kDa交叉反应抗原浓缩乐队(图5)。此外,交叉反应抗原31日和27 kDa的乐队也获得分数37岁和43岁之间显示分数最高39和40(图5)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
分离的年代SDS分数上使用沉降线性10 - 30%蔗糖梯度。一个200μL整除的t . evansi年代SDS样本加载在一个4毫升线性10 - 30%蔗糖梯度。分数(80μL)是通过收集管的底部以下超速离心法。(一)利用sds - page分析结果的分数;显示是Coomassie蓝染色。(b)与血清免疫印迹开发b - 173(表1)。M =蛋白质分子量标记。

鉴于没有获得蛋白质的23个分数10 - 30%的蔗糖梯度,4毫升线性5 - 20%蔗糖梯度也是为了提高抗原分离。离心后,41 110分数μL每个收集通过管的底部和分析。免疫印迹分析表明,主要的53 kDa交叉反应抗原筛选了分数13日和31日之间显示出在分数达到顶峰28(图6)。27日到31日的交叉反应抗原乐队kDa分数25 - 32之间的观察,显示峰值分数(图29 - 30左右6)。总之,分数浓缩在三个主要的抗原分子质量明显的27日,31日和53 kDa部分之间大的责任t .间日疟原虫和t . evansi从海神获得x - 100耐颗粒的一部分t . evansi。此外,改进在这些交叉反应抗原的分离获得的沉降进行了线性分析梯度(图5 - 20%蔗糖6)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
分离的年代SDS分数上使用沉降线性5 - 20%蔗糖梯度。一个200μL整除的t . evansi年代SDS样本4毫升线性加载5 - 20%蔗糖梯度。分数(110μL)是通过收集管的底部以下超速离心法。(一)利用sds - page分析结果的分数;显示是Coomassie蓝染色。(b)与血清免疫印迹开发b - 173(表1)。M =蛋白质分子量标记。

我们汇集分数从13 - 19日5 - 20%蔗糖梯度由于他们只包含53-kDa交叉反应抗原乐队(池)。此外,我们也汇集分数25 - 33(池II),它包含所有主要的混合交叉反应乐队(27岁,31日,53 kDa多肽)。大的部分纯化抗原从每个池进行了分析通过免疫印迹实验采用不同于牛血清或自然感染t .间日疟原虫。400年整除μL池我和池二世被加载到12%聚丙烯酰胺制备凝胶。一次,分离,完成了的凝胶electrotransferred硝化纤维膜,切成条,使用各种分析血清t .间日疟原虫来华的牛。如数据所示7(一)和7 (b)(池I和II,职责),27日的部分纯化抗原,31日,53 kDa被从马血清感染TEVA1 TeAp-ElFrio01t . evansi隔离和牛实验和自然感染t .间日疟原虫。因此,27的多肽,31日,53 kDa对应t . evansi表现出大的抗原t .间日疟原虫。

(一)
(一)
(b)
(b)
图7
反应性的t . evansi池中包含的多肽乐队I和II来自牛的血清实验和自然感染t .间日疟原虫。整除(400μL)池I和II(分数和男性从图13 - 19日6、职责)通过电泳分离制备12%聚丙烯酰胺凝胶板。sds - page后,蛋白质被electrotransferred硝基过滤器,和这些墨迹条切成3毫米。第二条包含池我(a)或池(b)使用积极的开发从马实验感染血清(+)t . evansi实验从牛或自然感染t .间日疟原虫。寄生虫学的血清阴性血清(−)也被用作控制。在车道1 - 11 (a),血清H-TEVA1, H-TeApEF, b - 303 b - 103 b - 173, B-LC12, B-LC29, B-LC69, B-F5315, B-F5683和H-LR分别。在车道1 - 10 (b),血清H-TEVA1, H-TeApEF, b - 303 b - 103 b - 173, B-LC12, B-LC54, B-F5315, B-F5683和H-LR分别。血清中描述表1和2。

4所示。讨论

绝对牛锥虫病的控制无法实现与当前可用的方法,这是不足以防止这种疾病造成的巨大的经济影响。早期、准确的诊断的锥虫病所致t .间日疟原虫是至关重要的战略使用可用的抗寄生虫药物。然而,这种疾病的诊断可能是困难的因为没有特殊的临床症状的感染,和标准锥体虫检测方法不够敏感。牛锥虫病检测使用寄生虫学的(microhematocrit离心过程)16),免疫(间接免疫荧光法、间接ELISA、免疫印迹等),和分子聚合酶链反应或PCR诊断技术。特别是免疫测试是有价值的方法t .间日疟原虫诊断,因为他们的高灵敏度探测到锥体虫抗原的抗体。尽管动物锥虫病的诊断技术的进步,但许多急性感染被注意和一种慢性的疾病,经常没有寄生虫血症,更为普遍(22]。

和其它传染病一样,动物锥虫病的早期诊断是至关重要的在当地爆发成为一个流行的可观的比例。尤其基本在牛的农场,这种疾病可以通过向量苍蝇传播机械(Tabanids)从一个宿主传播到另一个的可能性达到整个群体在很短的时间。吸引(23)表明,动物病锥虫病的大小由non-tsetse承担t . evansi大约三倍是因为采采蝇锥承担。因此,交叉反应之间的进化密切的寄生虫可以通过使用一个种间的检测分析。特别是,交叉反应被广泛报道免疫原性的组成部分之一T。间日疟原虫和T。evansi。主要64 kDa糖化交叉反应抗原、p64以前从TEVA1纯化t . evansi隔离并标识为VSG的可溶性形式(10,11]。我们也和本地纯化两个额外的蛋白质分子质量约51和68 kDa的胞质分数相同t . evansi隔离,证明是被反t .间日疟原虫牛相关抗体和没有纯化p64 [12]。在目前的工作,我们继续隔离和表征的抗原蛋白t . evansi,这是部分负责免疫交叉反应t .间日疟原虫。

类似于血液中形式的t . brucei,t . evansi包含一个glycosylphosphatidylinositol-specific磷脂酶C (GPI-PLC)。这种酶裂解的GPI-anchor VSG,形成自由甘油二酯膜,可能是1,2-cyclic磷酸肌醇环,仍然附着在VSG[发布24,25]。这乳沟转换VSG的膜结合形式(mVSG)释放的可溶性形式的VSG (sVSG) [26]。作为显示在图2从TEVA1 p64, GPI-PLCt . evansi隔离是活跃的和功能。然后,其他寄生虫GPI-anchored细胞表面蛋白质也必须由寄生虫GPI-PLC裂解酶在不同的提取步骤执行,产生相应的可溶性形式发布。我们的研究结果显示,三个积分膜相关多肽乐队t . evansi,不含GPI锚和明显的分子质量27日31日和53 kDa,包含常见的抗原表位t .间日疟原虫蛋白质。因此,这些常见的或高度保守的抗原多肽t . evansi都是不错的候选人被认为是造成锥虫病的免疫诊断工具吗t .间日疟原虫。

这个亚属Trypanozoon是最均匀群salivarian锥体虫,它包含三个公认的物种形态无法区分,t . brucei,t . evansi,t . equiperdum。典型的分类t . brucei,t . equiperdum,t . evansi作为单独的物种是基于不同的传播方式、宿主范围和致病性,长期存在的理解t . brucei包含联锁maxicircle和minicircle动基体DNA分子(kDNA),t . equiperdum保留至少一部分maxicircle kDNA (dyskinetoplastidy)t . evansi完全失去了它(akinetoplastidy) [27- - - - - -29日]。认为,有一个被广泛接受的模式t . evansi的发展,通过t . equiperdum当骆驼感染t . brucei搬到tsetse-free地区(30.),最近的一项研究甚至建议t . equiperdum和t . evansi可分为亚种的t . brucei(31日]。因此,t . brucei,t . evansi,t . equiperdum过去的非常接近。尽管基因组t . evansi尚未解决,基因组的分类学的相对寄生,t . brucei brucei(927株),导致人类非洲昏睡病,现在已经完成(32),提供两个锥体虫生物学的一个里程碑,一个机会来考虑大量基因组层面上的问题。最近,杰克逊et al。33)生产高质量的基因组序列草案两个相关非洲锥虫,t . congolense(亚类Nannomonas),t .间日疟原虫(亚类Duttonella),具体t . congolenseIL3000和t .间日疟原虫Y486。所有这些基因序列都可以通过GeneDB (http://www.genedb.org/)或TriTrypDB (http://tritrypdb.org/)。为了确定合理的三个候选人t .间日疟原虫交叉反应抗原分子质量明显的27日,31日,53 kDa,被发现在海神x - 100耐膜的一部分t . evansi我们分析了t . brucei brucei基因组寻找基因蛋白质产品,(我)是公认的积分,(ii)被确定为immunodiagnostic抗原,(3)具有类似的大小。

沙利文et al。34]nonbiased了蛋白质组学的方法来识别潜在的非洲人类锥虫病诊断抗原,通过询问t . brucei蛋白质与血清的抗体结合t . brucei gambiense来华的患者和未受感染的人的抗体。这种方法提供了一个列表24锥体虫蛋白质选择性地绑定到抗体可能受感染的病人,因此,被视为immunodiagnostic抗原。同年,杰克逊等人产生了细胞表面phylome非洲锥虫,通过比较预测编码细胞表面蛋白的基因t . brucei与t . congolense和t .间日疟原虫(http://www.genedb.org/Page/trypanosoma_surface_phylome)。这个细胞表面phylome提供了一个详细的分析导致的基因的基因家族和得失在共享家庭,帮助识别的表面蛋白可能调解的特定方面的发病机制和疾病进展。为了进一步讨论我们的结果,我们评估的蛋白质t . brucei细胞表面phylome [35)24的名单是很常见的t . brucei沙利文immunodiagnostic抗原被发现的et al。34]。非洲锥虫基因组包含大型VSG基因家族(32,33),但monoallelic单个基因的表达是保证因为转录仅限于端粒的VSG表达网站(ES) [36- - - - - -38]。其他几个site-associated基因表达(ESAG1-12) [39- - - - - -41位于ES和与活跃cotranscribed VSG [32,42]。的产品t . bruceiESAG3基因(Tb927.2.2020)被报道为44.2 kDa的蛋白质,其中包含两个假定的跨膜螺旋。ESAG3是一个完整的膜蛋白选择性地认可t . brucei gambiense感染免疫球蛋白,大多数种蛋白质转译后的修改(例如,糖基化),这将增加他们的表观尺寸通过sds - page,我们建议t . evansi同源基因产品ESAG3可能对应于53 kDa交叉反应抗原被反公认的在这里t .间日疟原虫从受感染的牛抗体。事实上,两个潜在N-glycosylation网站被检测到t . bruceiESAG3蛋白质使用NetNGlyc 1.0服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/r·古普塔,e·荣格,椰子饼,2004。预测N-glycosylation网站在人类蛋白质,在准备手稿)。Yadav et al。43还发现了一个52-55 kDa集群的多肽t . evansi使用血清immunodominant抗原的免疫印迹实验感染马。有趣的是,两个ESAG3直系同源基因已经被报道t .间日疟原虫基因组(TvY486 0042500和TvY486 0042500)。类似的分析产生了假想蛋白4180 (Tb927.6.4180)的基因,这对应于一个跨膜蛋白16317 Da,也认定为immunodiagnostic抗原因为它绑定到感染免疫球蛋白分数。一个潜在的N-glycosylation网站Tb927.6.4180蛋白质中发现。因此,我们提出t . evansi4180年假想蛋白同源基因产品可能对应于多肽乐队表现出大的27 kDat .间日疟原虫。假设蛋白质的同源基因4180也被报道t .间日疟原虫基因组(TvY486 0603610)。

只有使用t . brucei细胞表面phylome由杰克逊et al。35),另外三个相似大小的假设的蛋白质编码的基因,和含有跨膜区域,也发现(Tb927.8.7720 24.9 kDa;Tb927.6.380 33.9 kDa;和Tb927.4.5070 51.3 kDa)。因为这些假设的蛋白质的分子质量大约与一致t . evansi显示大的抗原t .间日疟原虫(27 kDa, 31 kDa, 53 kDa),他们可能对应t . evansi直系同源基因编码为这些假设的蛋白质。然而,这些基因被确定的组内t . bruceiimmunodiagnostic抗原沙利文报告等。34]。基因Tb927.8.7720和Tb927.4.5070似乎是特定的t . brucei;然而,一个直接同源基因Tb927.6.380也被报道t .间日疟原虫基因组(TvY486 0600040)。t . brucei包含许多其他细胞表面抗原immunodiagnostic proteomically选择沙利文et al。34),如基因相关ESAG (GRESAG) 4,这对腺苷酸环化酶编码的酶(44],不变的表面糖蛋白(研究小组)和分子质量75 kDa, 65 kDa, 64 kDa。然而,这些蛋白质的大小不匹配任何积分膜抗原蛋白T。evansi在这里被识别的免疫大t .间日疟原虫。不同的成员24t . bruceiimmunodiagnostic抗原沙利文报告等。34),还必须存在t . evansi多肽具有相似的分子质量,乐队中确定这项工作,例如,ESAG6 ESAG7,转铁蛋白受体亚基编码的44221 Da和38433 Da,分别。然而,ESAG6 ESAG7包含GPI锚图案时必须由寄生虫GPI-PLC裂解提取步骤,生产相应的可溶性形式发布。因此,ESAG6和ESAG7中不能找到SDS-solubilized颗粒的一部分t . evansi。

因为先前的结果表明,对于诊断抗原可能是不够的,我们强烈认为应该评估的抗原形成一种良好的免疫诊断分析。这些抗原的识别和表征不仅可以诊断,而且对牛锥虫病预防和化疗。此外,识别的抗原蛋白,导致这两个之间的大锥可以帮助更好地理解这些寄生虫的进化。所有这些交叉反应抗原的特异性和敏感性,个人或团体,目前正在评价参数,为了建立的可能性,利用他们作为牛锥虫病的血清学免疫诊断的工具。然而,抗原表达的差异寄生虫隔离或者主机之间的免疫遗传的变化可以确定抗原识别的能力的各种动物物种。

5。结论

基于之间的交叉反应t . evansi和t .间日疟原虫,使用t . evansi抗原的诊断t .间日疟原虫感染是一个很好的替代方案实验室缺乏生产设施t .间日疟原虫抗原。三个膜相关积分多肽乐队t . evansi27日,31日,具有明显的分子质量和53 kDa,部分纯化在线性蔗糖梯度离心和被证明是抗原显示大t .间日疟原虫。这些t . evansi多肽是有吸引力的候选人被认为是造成锥虫病的免疫诊断的工具t .间日疟原虫。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究支持由FONACIT(没有。g - 2000001152也没有。实验室- 2000001639)和从Decanato de Investigacion y Desarrollo大学西蒙•玻利瓦尔(没有。s1 - ic - cb - 017 - 06)。我们要感谢a Reyna-Bello(实验Simon Rodriguez)所提供的法国牛血清作为消极的控制和人员从洋底Nacional de Investigaciones Veterinarias牛的贡献和他们的维护。