pcr检测巴贝西虫羊属在扇头蜱属囊和小反刍动物

摘要

这项研究的目的是评估的流行巴贝西虫羊属感染成人扇头蜱属囊以及伊朗西阿塞拜疆省的小反刍动物。随机选取40只羊中280只羊和122只山羊采集血样。具体的b羊属在67只动物(16.7%)中检出片段，其中绵羊52只(18.6%)，山羊15只(12.2%)()。848年的r .囊采集自自然孳生的小反刍动物和农场狗巴贝西虫羊属在94只成年蜱唾液腺，通过PCR检测。频率b羊属蜱虫群的感染比无蜱虫群高()。从反刍动物，蜱，蜱产卵，鸡蛋和幼虫的血阳性扩增物进行限制性消化以HphI.制作了一个RFLP剖面。PCR-RFLP结果表明，1株菌株具有较强的抗病性b羊属存在于这个领域。结果表明，PCR是研究小反刍动物巴贝斯虫病流行病学的有效方法。此外,r .囊，它可以通过外界传播b羊属和以及被广泛分布在西阿塞拜疆省，伊朗，可能发挥的天然载体在该领域的重要作用b羊属。

1.介绍

巴贝西虫病,引起的巴贝西虫羊属是伊朗西北部绵羊和山羊最重要的蜱传疾病之一，其特点是冷漠、发热、贫血、黄疸和血红蛋白尿，在某些情况下可能导致死亡。

通过实验研究，我们获得了寄主-寄主相互关系的知识b羊属(1,2];然而，对这种寄生虫的流行病学和地方性动物潜力知之甚少。扇头蜱属种虫害包括扇头蜱属囊,r . sanguineus和r . turanicus是否与传播有关b羊属,但r .囊已被报道为唯一的载体b羊属可以transovarially发送巴贝斯虫寄生虫到小反刍动物。蜱广泛分布在伊朗的大部分山区[3.]。因为它有可能扮演小反刍动物巴贝斯虫病的传播的重要作用，有必要调查的存在状态巴贝斯虫虱子里的寄生虫。

巴贝斯虫病的诊断可通过显微镜检查姬姆萨染色的血涂片和急性期的临床症状来实现，但是，在急性感染后，恢复的动物往往持续亚临床感染，这在显微镜下是无法检测的。它们可作为潜在的生物媒介的感染源，导致疾病的自然传播[4]。标准化巴贝斯虫病的诊断几种血清学方法在流行病学研究被广泛使用，但提到的方法是不特定的任何巴贝斯虫由于与其它物质发生交叉反应巴贝斯虫缺乏对急性感染和载体状况的区分。此外，在这些测试中经常会出现假阳性和阴性的结果[5]。使用替代技术，如聚合酶链反应(PCR)，已成为检测和鉴定的必要手段巴贝斯虫感染有效，据报道，在最近的许多研究[6,7]。与其他传统诊断方法相比，分子技术具有更高的灵敏度和特异性。

虽然以前曾对蜱的唾液腺涂片进行过甲基-绿-吡虫啉或福尔根染色，但对传递介质仍未找到答案[8]。蜱虫唾液腺的染色绝对可以确认巴贝斯虫属。感染的蜱的，但该方法的主要缺点是灵敏度低，耗时的，并且区分所涉及的物种[难度9]。因此，基于PCR的技术在巴贝斯虫病的流行病学调查的申请已经上报和高灵敏度和特异性已经由几个作者的检测验证巴贝斯虫蜱虫感染[10,11]。

伊朗对小反刍动物巴贝斯虫病的研究非常有限。既往血清学调查b羊属在伊朗不同地理区域演出[12]。考虑到血清学研究的局限性，本研究的目的是通过PCR测定伊朗西北部地区的感染率。将PCR结果与薄血涂片检查结果进行比较。此外，寄生虫在唾液腺的存在r .囊采用PCR方法从该地区自然感染的绵羊、山羊和农场犬中采集标本，采用PCR- rflp进行鉴定b羊属种类。

2.材料和方法

2.1。采集血液样本和蜱虫

从2009年6月至2009年9月，血液样本和蜱从位于伊朗西北部西阿塞拜疆省的不同地区收集。四百2血液样品从280只绵羊和山羊122即属于40种随机选择的鸡群收集。羊群，山羊的羊群，混合群（绵羊和山羊）：鸡群根据它们的组合物，分为三类。颈静脉血液样品收集到含有EDTA从耳静脉DNA提取和血液样品用于制备薄的血涂片，染色，用Giemsa和用于检测寄生虫得到的管。

取样时，通过触诊检查每只动物的全身是否有蜱虫感染。这些蜱虫被人工取出，保存在玻璃管中，用采集点标记，然后转移到实验室。分别从绵羊、山羊和农场狗的尸体上收集的299,213和335只成年蜱被鉴定为r .囊;共分离出雄蜱504只，雌蜱344只。测定饱腹雌性蜱体内的寄生虫量后，将20只蜱分别置于中空玻璃板上孵育在75-80%的相对湿度下产卵。产卵第15天，部分卵进行DNA提取，其余卵孵育成幼虫。最后，卵、幼虫和产卵蜱样本浸泡在70%乙醇中，并在−80℃冷冻，以备进一步使用。

2.2。DNA提取和PCR反应

使用Genomic DNA纯化试剂盒(Fermentas，德国)从每只绵羊和山羊的血液样本中提取总DNA，并调整到总容量为200μL置于TE缓冲液中，在- 20℃保存直到使用。蜱虫和虫卵用70%乙醇冲洗，并在无菌滤纸上风干;然后按照Oliviera-Sequeira等人描述的程序从每只蜱和卵中提取DNA。[11做了一些修改。简单地说，在400年切除的唾液腺被均匀化μ取匀浆缓冲液(0.4 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, pH 8)，与终浓度2%的十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶K(400)混合μg / mL最终浓度)。生成的混合物在56℃下孵育2 h，之后孵育300 hμ向样品中加入L的6 M NaCl。离心30秒，12000×g离心。将上清液转移到新的试管中，将等体积的异丙醇加入每个样品中，混合均匀，20℃孵育1 h。取10000×g离心20 min。球团用70%乙醇洗涤，干燥，最后在50-100重悬μ升无菌卫生署₂O。

从鸡蛋样品中提取DNA，将20毫克的鸡蛋样品称重并置于微管中，用缓冲液(10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA, 5% Triton X-100, pH 8.5)洗涤。5000×g离心2 min，弃上清，用玻璃棒浸渍鸡蛋。蛋白酶K溶液(20μL）加入到蛋浸渍和制备在56℃下温育过夜。该quality of the DNA extract in regard to purity and integrity was assessed with optical density counts at 260/280 nm and submerged gel electrophoresis.

小亚基核糖体RNA的扩增(四rRNA)基因的巴贝西虫羊属使用先前报道的敏感和物种特异性引物扩增549 bp的片段[9]。50例进行了PCR检测μ含5升总反应体积 μL of 10x PCR buffer, 2 mM MgCl₂，250 μ4个脱氧核苷酸三磷酸各M, 1.25 U Taq DNA聚合酶(Fermentas, Germany)，每个引物50 pmol，提取的DNA 50 ng。引物序列如下:Bbo-F 5’-TGGGCAGGACCTTGGTTGTTCT-3’，Bbo-R 5’-CCGCGTAGCGCCGGCTAAATA-3’。的正控制巴贝西虫羊属由Rahbari教授(伊朗德黑兰大学兽医学院)提供。无菌水作为阴性对照。

2.3。PCR产物的RFLP

pcr扩增产物被消化HphI按照供应商建议所述限制酶(Fermentas，德国)。每个消化反应设置在20分钟μL体积包含2μL的10x反应缓冲液，10μL的PCR产物和10单位的限制性内切酶。消化混合液在37℃下孵育16 h。控制,20μL PCR产物用2μL的10x反应缓冲液和8μL无菌dH₂不添加酶。用2%琼脂糖凝胶在80 V下分析消化后的PCR产物(预计3段282、164和103 bp)，并在紫外光下观察。

2.4。统计分析

采用SPSS 17.0版双尾统计分析以及。一个值小于0.05（被认为是显著的。

3.结果

薄血涂片镜检显示，感染动物的寄生虫血症在0.01 ~ 3%的梨状体，在红细胞内、梨状体和单环中检测到。所有这些形式都被归类为巴贝斯虫在显微镜下，280只绵羊和122只山羊的血涂片中，有34只(12.1%)呈阳性，8只(6.5%)呈阳性。

在402例检查的血液样本中，有67例(16.7%)产生了特异性巴贝西虫羊属SSU rRNA基因片段（图1)，其中绵羊52只(18.5%)，山羊15只(12.2%)。镜检阳性的绵羊和山羊标本PCR检测均为阳性。在40只被检查的鸡群中，b羊属29只(72.5%)鸡群中检测到感染。每个地方阳性动物的百分比从13%到20%不等。患病率之间的差异b羊属绵羊和山羊的感染有统计学意义()。

在所有的动物群中都确定了蜱虫感染。的一个特殊片段的ssu rRNA基因b羊属在848只(11.1%)扁虱中，有94只被扩增。b羊属在绵羊、山羊和家犬身上采集的蜱虫中，分别有12.7%(38/299)、13.6%(29/213)和8%(27/336)被证实。的患病率b羊属小反刍动物和唾液腺的感染r .囊如表所示1。

二十饱食的雌性蜱孵育和DNA从卵，幼虫，和产卵蜱萃取。Eight oviposition ticks were positive for the specific 549 bp fragment in accordance with its eggs and larvae (Figure1)。

一个单一的RFLP分布使用来自PCR阳性血液样品，蜱，蜱产卵，鸡蛋和幼虫产生HphI限制酶(图2)。

4.讨论

的发生b羊属，是小巴贝虫病的主要病原体，此前在伊朗曾有报道[12- - - - - -14，但具体的流行巴贝斯虫spp是未知的。据报在地中海地区[15)、以色列(16)、希腊(17]， 火鸡 [18)、西班牙(19，以及伊朗[20]，都表明，b羊属是影响小反刍动物最常见的物种。脊椎动物细胞质感染的诊断主要通过薄血涂片的镜检进行。然而，这种方法需要专业知识，因为这些寄生虫具有相似的形态特征，因此，当混合感染发生时，可能会使检验者感到困惑。也采用了血清学检测，但特异性和敏感性存在一些困难[5]。准确区分haemoparasites对理解它们的流行病学至关重要。分子方法，如PCR，具有高度的敏感性和特异性，已发展为鉴定巴贝斯虫即使有0.00001%的寄生虫血症及其载体，受感染动物的物种DNA [9,11,21,22]。利用小亚基高变区V4引物对感染血液和蜱样本进行鉴定和鉴定核糖体rna蜱样本基因（18 s rRNA）piroplasms的。该18 s rRNA基因已被可靠地应用于鉴定和分类巴贝斯虫种虫害感染(23]。

据我们所知，本研究是第一个采用分子诊断技术来确定的分子流行病学和感染率b羊属在伊朗的绵羊、山羊和媒介蜱中。分子技术，如PCR比显微镜检查和血清学检测有更高的效率b羊属(7,9]。

镜检发现寄生虫血症范围为0.01 ~ 3%，而另一项研究报道绵羊的高寄生虫血症[8]和[17据报道，寄生虫血症从未超过1%。

在伊朗之前的研究中，使用了使用IFAT的血清学测试，在该国不同地区血清阳性率为12% - 58.8% [12]。在本研究中，覆盖西北伊朗西阿塞拜疆省，发生率在13％到20％的被检验的农场。

在本研究检查的因素中，动物的种类(绵羊或山羊)和在绵羊、山羊和农场狗中的蜱的存在与PCR阳性结果相关，这表明感染的高风险b羊属绵羊和山羊。据说在野外，b羊属引起疾病只在羊，很少在山羊[17,24]。从受感染的鸡群中采集的蜱虫感染频率明显较高b羊属(27.5%)，而且从被感染的羊身上采集的蜱虫数量也明显较高b羊属(15%)。我们的研究结果表明，该病的流行率与蜱虫病媒之间存在正相关关系。结果与以往的研究结果一致，即报道的频率b羊属有蜱虫负担的鸡群感染率高于无蜱虫负担的鸡群[25,26]。的频率b羊属从山羊身上采集的蜱比从绵羊身上采集的蜱要高。这在这项研究中是出乎意料的，因为它被观察到b羊属绵羊感染频率明显高于山羊。另一方面，据说b羊属通常在绵羊中引起疾病，在自然条件下很少在山羊中引起疾病[17]。因此，原因就比较高了b羊属山羊的感染可能与媒介蜱以前的宿主有关。蜱很可能从绵羊转移到山羊身上。

在蜱虫,b羊属在检测扇头蜱属利用PCR技术从自然感染的小反刍动物身上提取[20]。这一发现的b羊属DNA在蜱的唾液腺是重要由于生物传输b羊属通过扇头蜱属属。而且它会揭示，与蜱巴贝斯虫他们唾液腺中的DNA可以被认为是巴贝西虫的天然递质[27]。b羊属是由血红(28]。我们的研究结果表明，r .囊可能在这个领域扮演着重要的角色，作为一种天然的寄生虫传播b羊属卵巢。

以前，基于rfl的检测方法用于检测牛巴贝斯虫病[29]。在一项针对24和35人的研究中b胶被感染的水牛血液样本r . haemaphysaloides蜱，分别只观察到一个RFLP模式。在我们的研究中，18S rRNA基因在161个PCR产物中只产生了一个RFLP剖面，这与之前的研究一致[29]。

综上所述，成功建立了基于ssu rRNA基因的PCR-RFLP检测方法，并用于伊朗小反刍动物巴贝斯虫病的流行病学调查。结果表明，小反刍动物巴贝丝虫在伊朗西阿塞拜疆省广泛存在r .囊可能在传播中起着重要的作用b羊属作为一个自然向量。对pcr扩增的ssu rRNA基因产物进行测序，可以更详细地了解该基因的遗传多样性b羊属。

利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

承认

本研究由伊朗乌尔米亚大学研究基金资助。

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