文摘

本研究的目的是分析MHC-DRB1 / DQB1基因多态性之间的关系及其抗囊包虫病(公元),以及屏蔽antiechinococcosis的分子遗传标记在中国美利奴羊。MHCII-DRB1 / DQB1外显子2扩大了聚合酶链反应(PCR)健康羊包虫病的DNA样本。PCR产品特点是限制片段长度多态性(RFLP)技术。五个限制性内切酶(SacII Mval HaeIII,尚驰,Hin1I)是用来减少DRB1,而七限制性内切酶(MroxI、脊髓、SacII NciI, TaqI, Mval,和HaeIII)被用来减少DQB1。结果表明,频率的模式Mvalbb (),SacIab DRB1外显子2 (),TaqIaa HaeIIInn ()DQB1外显子2明显高于健康组与C相比。E个体,这意味着这些基因型之间有一个强大的协会和抗包虫病或易感性。卡方检验表明,个体的基因单体型DRB1-SacIab / DRB1-Mvalbb DQB1-TaqIaa / DQB1-HaeIIInn (C)相对的抵抗力。DRB1-Mvalbc / E,而个体的基因单体型DQB1-Mvalyy / DQB1-TaqIab / DQB1-HaeIIImn ()和DRB1-Mvalbb / DQB1-Mvalcc / DQB1-TaqIab / DQB1-HaeIIImn ()更容易石球此外,证实这些结果,菲尔丁实验进行与中国美利奴羊人工感染如。结果是按照第一项研究的结果。总之,MHC-DRB1 / DQB1外显子2抗C中扮演一个重要的角色。中国美利奴羊的E。此外,antiechinococcosis的分子遗传标记(DRB1-SacIab / DRB1-Mvalbb / DQB1-TaqIaa / DQB1-HaeIIInn)在中国美利奴羊就会被筛选出来。

1。介绍

羊的主要组织相容性复合体(MHC)基因位于染色体20,叫做Ovar1]。MHC基因家族包括两个主要的亚科:一级和二级基因(2]。研究表明存在同源HLA - II级位点DQB(3- - - - - -6]。和其他脊椎动物一样,高度的多态性在Ovar -DQB多态性的基因,与大多数网站位于外显子2,编码antigen-binding网站(7]。由于其高度多态特征,各种研究已经应用于许多领域。一直以来不同MHC基因的等位基因与抗病性在羊8];此外,特定的MHC等位基因与抗寄生虫在羊9]。目前,相关研究Ovar多态性和抗病性或敏感性主要集中于Ovar-DRB1 [10- - - - - -14]和Ovar-DQB [7,15]。

C。E是一个世界性的人畜共患寄生虫病引起的绦虫的幼虫阶段(metacestode阶段)棘球绦虫granulosus狗之间循环,尤其是狗,像中间宿主的主机和各种食草动物。在中间宿主和人类,幼虫发育成包虫囊肿各器官,特别是肝脏和肺部。C。E与严重的发病率和致残率,特别是在中国西北牧区的流行不仅导致相当大的减少在畜牧生产中,但也严重影响人们的生活质量。中国美利奴羊,众所周知好的羊毛的品质,有利于本地羊husbandary;然而因此相对更容易刚建成时,这种疾病会导致低性能对中国美利奴羊。

目前,许多研究关注人类[MHC-hydatid疾病协会16- - - - - -19]。然而,很少有报道发表在Ovar协会与C的研究。E在羊。在这项研究中,在努力调查MHC -DRB1 /DQB1基因多态性及其与阻力/易感性C。中国美利奴羊,E antiechinococcosis的分子遗传标记筛选出来。

2。材料和方法

2.1。动物取样和样品制备

我们收到了血液样本204 2岁的中国美利奴羊,捐赠从任务165年,农业部门9,新疆生产建设兵团。C。E健康羊羊羊包虫病的酶联免疫试剂盒(深圳联合生物技术有限公司)。我们选择101 C。E羊和103名健康对照组。从全血基因组DNA的样本得到存储在−20°C到分析。主要材料和试剂从Promega获得公司和上海Sangon生物工程技术和服务有限公司有限公司

2.2。PCR扩增

第二个外显子Ovar -DRB1被嵌套PCR扩增。第一轮与引物进行PCR OLA-ERB1 (GC) 5′20棉酚TTC 20 TCT CTG CAG CAC ATT TCT条t - 3′, 5′HL031 ttt AAA TTC GCG CTC ACCTCG 20 CT-3′(20.]。100 ng的基因组DNA被用作DNA模板总量的20倍μL是由1.5毫米MgCl PCR反应₂和120年μM核苷酸,每个引物0.2毫米和1.5 UTaq聚合酶是补充道。反应在thermocycler在下列条件下进行:一个周期的初始变性5分钟在94°C紧随其后15周期94°C的30年代,50°C 30年代,60年代和72°C,最终在72°C扩展了10分钟。三个μL(第一步PCR用于第二步使用引物PCR OLA-ERB1 (GC)和OLA-XRBI (5′AGC TCG AGC GCT GCA CAG TGAAAC TC-3′) (20.]。条件为5分钟一个周期在94°C,紧随其后的是30 94°C的周期30年代,63°C 30年代,60年代和72°C扩展最后的10分钟的72°C。第二个外显子DQB1是由底漆弗兰克-威廉姆斯:放大5′ccc公司治理文化AGA GGA TTT CGT三大′和牧师:5′acc TCG 20 CTG CCA GGT-3′(21];150 ng的基因组DNA被放大的总量112 50μl,包括1.5毫米MgCl2, 100年μM核苷酸,每个引物的0.2毫米,2 UTaq聚合酶。反应进行了热循环在下列情况下:一个周期的初始变性5分钟在94°C,紧随其后的是33周期94°C的30年代,30年代,67°C和72°C 45年代,最终在72°C扩展了10分钟。

2.3。RFLP

乳沟映射输入方法和等位基因命名指Konnai et al。(20.]。每10μL (DRB1 PCR产品与5 U的消化囊我,欣1,我有三世,Mva我和囊分别二世,总量的20μL,包括2μL 10×缓冲区。每10μL (DQB1 PCR产品与5 U的消化Mrox我,Sca我,囊二世,Nci我,Taq我,Mva我和有第三,分别。样本通过琼脂糖凝胶电泳来解决在不同浓度(表S1)网上(见补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/272601)。

2.4。克隆和测序

根据输入的结果限制消化,样品54和74年被选为克隆和测序,因为样本有IIImm,有IIInn,MvaIyy,Mva伊茨基因型,这与先前的报道[不一致20.]。所以这些样品的扩增PCR产品被克隆到pGEM-T向量,结扎质粒被选中的蓝白色殖民地筛查,阳性克隆被送往序列。

2.5。验证人工感染如

来验证上述研究结果的有效性和可靠性,十六2岁的中国美利奴羊,负面的包虫病酶联免疫试剂盒检测,选择进行人工感染实验如。八的羊的单体型DRB1 -囊Iab /DRB1 -MvaIbb /DQB1 -TaqIaa /DQB1 -有IIInn被测试组,和其他八个羊的单DRB1 -囊Iab /DRB1 -MvaIbc /DQB1 -TaqIaa /DQB1 -有IIInn,DRB1 -囊Iab /DRB1 -MvaIbc /DQB1 -TaqIaa /DQB1 -有IIImn或DRB1 -囊Iab /DRB1 -MvaIbb /DQB1 -TaqIaa /DQB1 -有IIImm,并不与包虫病阻力或易感性有关,作为对照组。每个羊美联储10成人绦虫的受精卵节片嘴。这十六个羊是在相同条件下饲养的。

2.6。统计分析

在C等位基因和基因型频率。E-negative和艾滋病中国美利奴羊进行了分析评估之间的关系以及不同基因型和C。E意义。进行卡方检验分析单和C之间的关系不同。E阻力。C。E感染率的测试和对照组比较确切概率法在人工感染如。

3所示。结果

3.1。PCR扩增

Ovar-DRB1外显子2扩大了PCR引物OLA-ERB1, OLA-HL031, OLA-XRBI;一个特定的观察296个基点1.5%琼脂糖(图印地)。Ovar-DQB1外显子2扩大了PCR引物弗兰克-威廉姆斯和牧师,和一个特定的乐队280年的英国石油(bp)在2%琼脂糖(图印地)。

3.2。PCR-RFLP

从限制消化DRB1)外显子2 PCR产物,基因型的囊我,欣1,我Mva我,囊二世,有三世(表开通)被观察到,一些基因型限制映射图1。此外,限制性内切酶的基因型Mrox我,Sca我,囊二世,Nci我,Taq我,Mva我和有三世(表开通)DQB1 PCR产品也观察到,他们的一些基因型限制映射图2。

3.3。Clonig的分析研究和顺列

我们验证了预测RFLP概要Ovar-DRB1等位基因的测序克隆184放大产品,所有观察到的碎片匹配模式完全与DNA序列的预测。克隆测序的Ovar-DQB1外显子2放大产品显示两个单点突变,T G, G,在基地位置32和159年,分别导致新的等位基因,有IIImm和有IIInn。此外,两个G-to-A点突变在96年和246年基地位置导致新的等位基因,MvaIy和Mva工业区。比较原始序列的测序结果DQB1外显子2(基因库,加入数字:Z28523)如图S3。

3.4。分析基因型和C之间的关系。E阻力

统计比较C基因型的频率。E绵羊和健康对照组显示DRB1基因型频率MvaIbb (),有IIIee,囊Iab (在底片)高于C。E羊,表明这些基因型和C之间的一个强大的协会。E阻力,而基因型的囊IIab (),有IIIdf (),有IIIbd (),MvaIbc ()DRB1)外显子2更经常发生在C。E个人与健康组相比,这意味着这些基因型之间有一个强大的协会和包虫病易感性(表1)。DQB1基因型频率TaqIaa和有IIInn (),MvaIdz (在底片)高于阳性,而基因型的Taq内勤局和有IIImn (),MvaIcz ()阳性是高于阴性(表2)。因此,我们得出结论DQB1基因型的TaqIaa,有IIInn,MvaIdz抗C。E,而基因型TaqIab,有IIImn,Mva公元Icz是容易的

3.5。验证人工感染如

耐药基因型的单体型分析,发现的单体型频率DRB1 -囊Iab /DRB1 -MvaIbb /DQB1 -TaqIaa /DQB1 -有IIInn C。E-negative羊是高于C。E羊(),表明这单体型的耐药单体型中国美利奴羊(表3)。结果验证了人工感染包虫病。的单DRB1 -MvaIbc /DQB1 -MvaIyy /DQB1 -TaqIab /DQB1 -有IIImn和DRB1 -MvaIbb /DQB1 -MvaIcc /DQB1 -TaqIab /DQB1 -有IIImn阳性是高于阴性(),这意味着这些单是容易C。E个人。

Protoscoleces可以发展成囊肿postinfection[20天内22]。十六个人工感染的羊如在第二个月被屠杀后如感染,目视检查每个屠宰动物的肝脏和肺表面的检测是绦虫的幼虫阶段(23]。结果表明,3只羊被感染如在测试组,而6羊感染了如在对照组;因此,测试组的感染率明显低于对照组()。这是证实了基因单体型DRB1-SacIab DRB1-MvaIbb / DQB1 -TaqIaa /DQB1 -有IIInn导致C。中国美利奴羊E阻力。

4所示。讨论和结论

的MHC基因是众所周知的在脊椎动物的免疫系统和编码抗原识别蛋白质用于自适应免疫反应。多态性的基因已成为一个热点话题在过去几十年。国内外各种研究,表明MHC的绵羊和山羊介绍混合基突变和富裕的多态性。Amills et al。24,25)利用PCR-RFLP探讨多态性的方法DRB在山羊,Konnai et al。20.)的多态性研究DRB1在一些羊,结果表明富裕的羊属白羊座——中存在多态性DRB1基因,Dongxiao和元26)研究DRB3中国当地的绵羊和山羊的多态性。另外,羊属白羊座-DQB1基因在国外已开展调查[21,27,中国学者研究MHC -DQB和DQA在人类28猪(),29日),和牛30.,31日]。然而,国内的报道仍没有羊属白羊座-DQB1。在目前的研究中,我们使用Mrox我,Sca我,囊二世,Nci我,Taq我,有第三,Mva我通过PCR-RFLP分析DQB第1外显子2的存在,发现2,2,4,2、3、3和6的等位基因,以及3、3、7、3、4、6和16个基因型,分别。等位基因的克隆和测序的结果,也就是说,有IIIm,有IIIn,MvaIy,Mva工业区,表明它们是中国美利奴羊的新等位基因突变引起。

广泛的多样性在许多MHC基因座为研究提供了一个宝贵的遗传标记源宿主基因型之间的复杂关系和抗病性或易感性(10]。例如,塞耶斯et al。11)建议Ovar -DRB1基因起着重要的作用在增强抵抗萨福克羊线虫感染。通过比较表型频率。E患者健康对照组,推测HLA -DRB1 * 11可能有一定的阻力。E,但HLA -DQB1 * 02将加剧疾病过程(32]。潜在的免疫遗传的倾向的敏感性和耐药性单室的包虫病调查了HLA -DRB1输入,发现HLA-DR3和HLA-DR11之间显著正相关,和着力点的发生HLA-DR3抗原与孤立的发生呈正相关,多个肺囊肿(16]。HLA的特征之间的差异已经被证明。E患者不同的课程的话题,尤其是HLA B8的协会,DR3、DQ2单体型和肉芽肿性寄生虫病更严重的形式,建议主机的HLA特征可以影响免疫介导机制(19]。这项研究发现DRB1 -囊Iab /DRB1 -MvaIbb /DQB1 -TaqIaa /DQB1 -有IIInn单体型抗包虫病,选择抗包虫病的遗传标记。

在这项研究中,多态性分析MHC -DRB1 /DQB1 PCR-RFLP方法执行,以及遗传标记的筛选antiechinococcosis中国美利奴羊。人工感染之间的关系被用来验证不同单体型的MHC基因多态位点和包虫病的阻力,这将为羊的抗病育种奠定理论基础。

缩写

MHC:	主要组织相容性复合体
Ovar:	绵羊的MHC
OLA:	绵羊的淋巴细胞表面抗原
聚合酶链反应:	聚合酶链反应
RFLP:	限制片段长度多态性
公元:	囊性包虫病
乙醯:	肺泡包虫病
如:	棘球绦虫granulosus
的话题:	棘球绦虫multilocularis。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

香港沈,国华汉均匀分布。

确认

我们感激使命165,九264 ricultural农业部门,265年新疆生产建设兵团为我们提供实验羊。本研究支持266年由中国国家自然科学基金项目(批准号30660124,267。31260535,批准号31060281)和专门研究基金会268年博士课程的高等教育(批准号20106518110003)。

补充材料