形态特征和在体外细胞病理效应的Acanthamoeba griffini从一例临床病例中分离出滋养体

摘要

光镜和透射电子显微镜观察报告的结构和结构在体外细胞病理效应的Acanthamoeba griffini从一例临床病例中分离出滋养体。活的滋养体活性中等，多形性显著，由卵形变为相当伸长的形状。变形虫在移动过程中形成了大小和厚度不同的宽片层和棘足等细胞质突起，其中含有大量的肌动蛋白。细胞质超微结构显示为其他游离变形虫的主要细胞器。滋养体与MDCK单层细胞共孵育24小时后，靶细胞局部受损，提示细胞病变效应是接触依赖的。透射电镜下，变形虫吞噬少量MDCK细胞;而未与滋养体接触的细胞形态未发生改变。单层上皮细胞在条件培养基中孵育24 h后，也观察到小面积的细胞损伤。对该变形虫分离株DF3区扩增产物进行系统发育分析和测序，确定其属于T3基因型，其中包括其他致病性变形虫;除了两种目前用于治疗Acanthamoeba是测试格里菲尼．

1.介绍

属的自由生活的变形虫Acanthamoeba常见于世界各地的土壤和水生环境中[1- - - - - -3.］.这些变形虫已经从非常不同的栖息地分离出来，包括来自南极的水[4，瓶装水[5，游泳池[6]、牙科单位[7]，洗眼[8，甚至从大气中的灰尘[9］.

AcanthamoebaSPP。是最常见的和机会主义amphizoic原生动物。Acanthamoeba castellanii是慢性肉芽肿阿米巴脑炎的病因学剂中的一种[10]以及阿米巴角膜炎，这是一种进行性和疼痛的威胁视力的眼部感染[11- - - - - -13］.第一个描述Acanthamoeba griffini是由Sawyer完成的[14，但关于这种变形虫的科学文献报道非常有限。二零零三年进行的分子分析[15，16]，认为该变形虫属于T3基因型，其他致病性变形虫也包括在该聚类中，因此具有临床相关性[17］.

通过光镜和透射电镜，我们观察了从一例角膜炎中分离出来的这只变形虫的形态，以及它对MDCK上皮细胞单层的细胞病变作用。

2.材料和方法

2．1.变形虫

2013年10月，从一起由接触镜和角膜刮伤引起的严重角膜炎病例中分离出了阿米巴(墨西哥预防失明协会，墨西哥墨西哥城Luis Sánchez Bulnes医院)。膨化后立即冷冻保存。

2．2．隔离和维护Acanthamoeba在单氧培养中

用于恢复和维护的技术Acanthamoeba从临床和环境来源的Sp.已在其他地方描述[18，19].简单地说，使用1.5%非营养琼脂平板进行初步分离，平板上播种热灭活细菌肠杆菌属aerogenes．然后将临床样本在琼脂上划线。随后在室温(22-24°C)下孵育10天。在有生长证据的情况下，将单个双壁包囊移入新鲜琼脂培养基中进行培养。

2．3.无菌培养

单氧培养物是从大量阿米巴生长的地区选择的。将选定的琼脂转移到无菌培养基中，如磷酸盐-生物tripase -血清葡萄糖培养基(PBSGM)和2% Bacto Casitone(酪蛋白胰腺消化，Becton-Dickinson, Sparks, MD)培养基(DIFCO)，这是广泛用于生长和阿米巴发育的培养基[9，20.］.两种培养基均添加10%胎牛血清(Equitech-bio, Kerville, Tex USA)和1%抗生素(青霉素，100 mg/mL;链霉素,10毫克/毫升)。滋养体在30℃硼硅酸盐管(Pyrex，墨西哥)的两种培养基中培养，每天更换两次培养基，连续两天，之后每天更换一次，连续三天。如果没有观察到细菌生长，则认为培养物是无菌的。

在2% Bacto Casitone添加10%胎牛血清(Equitech-bio, Kerville, Tex USA)和1%抗生素的无菌培养中，可以生长和维持Axenized滋养体。培养物在30°C下培养，在对数生长期结束时收获滋养体。

２.４.耐热性测试

为了确定生长的最佳培养基和温度，变形虫分别在25、30和37℃的硼硅酸盐管(Pyrex，墨西哥)中培养。通过绘制生长阶段的对数曲线确定最优生长(试验进行了三次)。用台盼蓝(0.4%)排除滋养体的活力。

2．5．致病性试验

为了诱导肉芽肿性阿米巴脑炎，作为一种评估阿米巴分离物毒力的方法，在小鼠感染模型中使用了鼻腔灌注。简而言之，无菌培养格里菲尼指数生长期(72 h)的滋养体在4℃冷冻，2500 rpm离心浓缩5 min。2×10⁵将细胞重悬于200滋养体 μ新鲜培养基或等渗溶液的L和instillated到5只雄性Balb / C小鼠的鼻孔[21］.用不含变形虫的培养基接种5只小鼠作为对照组。接种阿米巴原虫21 d后处死小鼠。将动物的脑、肝、肺、肾置于含非营养富集培养基(NNE)的琼脂平板上培养，提取变形虫。实验动物被维持在最佳的条件，根据国际标准，规范的照顾和管理实验动物。

2.6。药物活性测定

目前用于治疗癌症的两种药物的活性Acanthamoeba是测试Acanthamoeba griffini．洗必泰(Chlorhexidine diluconate, Alfa Aesar, Germany)是一种标准的防腐剂，属于双胍家族，常用在隐形眼镜保养液中;voriconazole (Sigma, Madrid, Spain)是一种麦角甾醇合成抑制剂，此前已被证明对临床菌株非常有效Acanthamoeba［22，23].对于灵敏度和活性测定，来自美国类型培养物收集（ATCC）的类型菌株，Acanthamoeba castellanii以基因型T4的Neff ATCC 30010作为对照。

活性测定以前开发的比色96孔微量滴定板测定，基于Alamar Blue的氧化还原测定[24，用于测定药物对所选植物滋养体的药效Acanthamoeba菌株。随后，在72到120小时的时间内，在Microplate Reader Model 680 (Biorad, Hercules, CA)上，使用570 nm的测试波长和630 nm的参考波长对平板进行分析。对药物敏感的菌株，抑菌率和50%抑菌浓度(IC₅₀)采用95%置信限线性回归分析计算。所有实验均进行3次重复，并计算平均值。一个配对的双尾-检验用于数据分析。的值被认为是重要的。使用Sigma Plot 12.0软件程序(Systat software Inc.)开发统计分析的抑制曲线。

2.7。MDCK细胞的培养

建立的犬肾源MDCK系(Madin Darby犬肾)单层上皮细胞在25 cm上生长²细胞培养瓶(Corning Incorporated, NY)在Dulbecco改良的Eagle’s培养基(Gibco, Grand Islands, NY)中添加10%胎牛血清(Equitech-bio, Kerville, Tex USA)和5% CO中的抗生素²气氛在37°C。

2.8。滋养体与MDCK细胞共孵育

MDCK单层细胞经胰蛋白酶处理后，置于24孔苯乙烯板上的圆形塑料盖片中生长。培养保持在37°C, 5% CO²24 h后得到融合的单层膜。在Bacto Casitone和Dulbecco 's modified Eagle 's medium (Gibco BRL)的混合培养基中，以1:2的比例添加滋养体。相同条件下孵育不同时间(6、12、16、24 h)。

2.9。MDCK单层细胞在条件培养基中的培养

条件培养基为:6 × 10⁶trophozoites from a culture in the exponential phase of growth were placed in culture flasks containing 7 mL of fresh Bacto Casitone-DMEM serum-free medium (1 : 1) and incubated at 30°C for 24 h. Trophozoites were chilled on ice for 10 min and centrifuged for 5 min at 2500 rpm. The supernatant was removed, centrifuged, and filtered through a 0.22 μm膜(Millipore, Bedford, Massachusetts)。MDCK单层细胞在条件培养液和Dulbecco 's modified Eagle 's培养基(Gibco BRL)的混合物中按等比例孵育24 h。

2.10。共聚焦显微镜

培养72h的阿米巴在冰水混合物中冷却5min，离心成球，4%多聚甲醛固定1h。然后用Dulbecco 's Phosphate Buffered Saline (DPBS)冲洗样品，用DPBS稀释的10%胎牛血清封闭1小时。随后，用DPBS冲洗细胞，用1:25 phalloidin标记的罗丹明复合物(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)溶液在37℃下处理20分钟，然后用DPBS彻底冲洗。样品用Vectashield (Vector Laboratories Inc.， Burlingame, CA, USA)安装，并在LS 700激光扫描显微镜(Carl Zeiss GmbH, Germany)中观察。

2.11。光学显微镜

使用装有AxioCam MRc数码相机(德国Carl Zeiss GmbH)的Zeiss Axiophot显微显微镜对活的和固定的滋养体及其与MDCK单层膜的相互作用进行了观察。

2.12。电子显微镜

2.12.1。透射电子显微镜法

Samples were fixed at room temperature with 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.2, postfixed with 1% osmium tetroxide in the same buffer, dehydrated in increasing concentrations of ethanol, and embedded in epoxy resins. Thin sections were observed in a JEOL JEM-1011 transmission electron microscope (JEOL Ltd. Tokyo, Japan).

2.12.2。扫描电子显微镜

样品用2.5%戊二醛固定在0.1 M碳酸氢钠缓冲液pH 7.2中，随着乙醇浓度的增加脱水，临界点干燥(31°C和1100 psi)使用Samdri仪器(tosimis Corp.， Rockville)。MD)，并在离子溅射装置(JEOL JFC-1100)中涂上金颗粒。然后用JEOL- jsm 7100f扫描电子显微镜(JEOL Ltd.)检查样品。日本东京)。

2.13。分离菌株的DNA提取及基因分型

无菌分离物。如先前针对进一步的形态学和分子分析[描述真菌和细菌 - 自由板放置在PYG介质中的变形虫转移到无菌培养17，25，26］.变形虫呈指数级生长(10⁶细胞/mL)，用于DNA提取和活性测定。

从阿米巴培养物中提取DNA，放置1-2 mL无菌培养基Acanthamoeba培养物直接进入麦克斯韦16组织DNA纯化试剂盒样品盒。Acanthamoeba基因组DNA用Maxwell 16仪器纯化，如Maxwell 16 DNA纯化试剂盒技术手册TM284所述。用NanoDrop分光光度计测定DNA的收率和纯度。

rRNA基因扩增(DF3区域)也如前所述进行[26，27］.PCR产物使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen公司，德国希尔登）纯化，并使用MEGABACE 1000自动测序仪（Healthcare公司，巴塞罗那，西班牙）在拉古纳测序服务大学（SERVICIO德SecuenciaciónSEGAI，拉大学测序拉古纳）。将得到的序列使用米加5.0软件程序[对齐28］.系统发育分析使用最大简约性、最小进化和最大似然优化标准进行，采用Mega 5.0 [28］.转换:通过最大似然启发式搜索估计转换比。通过执行1000次引导重复，可以获得节点支持的估计。基因型鉴定基于DF3区序列分析，并与现有基因进行比较Acanthamoeba基因库数据库中的DNA序列[26，29］.Acanthamoeba castellanii在PCR反应中使用Neff ATCC 30010 DNA作为阳性对照。新分离物的诊断片段3序列保存在Genbank数据库中，登录号为KF914142。

3.结果

3.1.光学显微镜

活的滋养体(平均25-35μM)极多形性，中度移动，在移动过程中，它们既有大板层，也有不同大小和形状的胞浆棘足。棘足由光滑透明的细胞质组成，许多细胞突起呈分叉状(图)1(一)和1 (b))．核:一个大的圆形到卵圆形的核，核仁突出且位于中央，由浓缩的深色染色质组成(图)1 (c)和1 (d))，并容易观察到丰富的不同大小和含量的液泡(图1 (d))．

的囊肿格里菲尼平均直径是14μm，显示了区分属于II类变形虫的形态特征[30.］.外包囊由一层厚的波状层组成，该层位于或多或少圆形的内包囊附近。两层在囊肿的大部分周长周围紧密相连，囊肿表面可见小孔(图)1 (f))．

3.2。共聚焦显微镜

用鬼笔环肽 - 罗丹明复合物处理变形虫表明肌动蛋白的强烈反应，细胞的最重要的结构蛋白之一。肌动蛋白是大量存在于细胞质的预测，尽管它也分布所有的细胞体周围（图1 (e))．

３．３．电子显微镜

3.3.1。透射电子显微镜法

在光镜下观察，在低倍的透射电子显微镜下，滋养体表现出惊人的多形性。细胞轮廓极不规则，从细长的刺足到宽阔的片层。细胞质呈颗粒状，有丰富的不同含量的液泡，大部分为消化液泡。偶尔观察到一个水排出液泡(图2(一个))．细胞膜由三层结构组成，厚度约为8.0 nm(图)2(一个)这种变形虫有一个大的圆形到椭圆形的细胞核，核仁位于中央，形状紧凑（图1）2(一个))在高倍镜下，核膜清晰可见，由一层双层膜组成，包围着约0.03的狭窄核周间隙 μm.包膜外可见大量核糖体(图)2 (b)).细胞质细胞器，如粗面内质网和线粒体是一个常规发现（图2 (c))粗面内质网结构清晰，通常与线粒体密切相关，呈短管状，表面有核糖体阵列；这些结构通常位于细胞边缘附近。线粒体被双层膜限制，呈椭圆形至圆形，具有致密的均匀颗粒基质，其中一些线粒体呈现电子致密颗粒。嵴呈不规则形状的小管，偶有分枝。在肾小管的内侧有颗粒状内容物。高尔基体系统由一个大致碟形的平滑扁平膜囊组成。在该系统凹面附近观察到一些膜结合小泡（图2 (d))．

当用phalloidin-rhodamine复合物标记滋养体时，发现在细胞轮廓周围的区域，特别是涉及细胞运动的区域，与肌动蛋白发生了大量的反应。数字2（e）图示与滋养体边缘相对应的低倍薄切片，其中细胞质缺乏细胞器，由纤维颗粒基质构成。高倍镜下可以观察到丰富的肌动蛋白丝(图)2（e）插入)。

3.3.2。扫描电子显微镜

格里菲尼扫描电镜观察到滋养体表面凹凸不平，细胞表面有大量的突起，如长短不一的丝状伪足;有时它们是分叉的。一个常见的发现是存在平坦和光滑的薄片，偶尔也发现变形虫(图2（f）)．

3．4．耐热性测试

生长曲线的分析表明，格里菲尼25 - 30°C生长最佳，72 h达到指数期，排除台虫蓝后，营养种群和生存能力均为100%。变形虫在37℃培养时未发生分裂。这些滋养体呈圆形，细胞质中出现大液泡，并迅速被包住。

3．5．MDCK单层细胞与格里菲尼滋养体和条件培养基

单层膜在等比例的Bacto Casitone和Dulbecco改良的Eagle’s培养基中孵育24小时，结构得到很好的保存(图)3(一个))．相互作用24 h后格里菲尼滋养体和MDCK细胞单层，上皮细胞单层明显受损;底物中有MDCK细胞缺失的区域，只观察到滋养体(图)3（b）)．单层上皮细胞在条件培养液中孵育24 h时，也可以看到大小不一的圆形区域缺乏细胞(图)3（c）)．透射电镜横切面上可见滋养体与单层细胞顶面密切相关;有的穿透单层细胞，脱离上皮细胞，通过不同大小的吞噬结构吞噬部分细胞。在滋养体的细胞质中存在吞噬结构是一个常规的发现(图3（d）和3（e）)．

3.6。致病性试验

小鼠感染疾病的阿米巴显示的证据，通过皱皮和漫无目的的游荡的表现，但他们能够在几天内恢复。小鼠在接种后21天处死。脑，肺，肝，肾的片段新鲜浸渍，它是可能观察到仅在脑部和肺部的几个滋养体。然而，在脑其可以是快速包囊的结果中检测到大量的囊肿。

提取器官的碎片在30°C的琼脂平板上用非营养富集培养基(NNE)培养，以恢复阿米巴。同样从脑和肺中发现稀少的滋养体，并观察到许多囊肿。

3.7。系统发育分析

对获得的新分离株DF3区扩增产物进行测序并进行系统发育分析，新分离株属于T3基因型(图)4)．

3.8。药物活性测定

全部格里菲尼和答:castellanii镜下和比色法测定Neff对氯己定和伏立康唑敏感。氯己定、伏立康唑及IC活性测定₅₀每个菌株数据表明，两种化合物能够抑制在伏立康唑的情况下，这些变形虫和生长，甚至在低浓度与IC₉₀．然而，在这项研究中伏立康唑的活性是氯己定的10倍(图)5)．

4.讨论

与其他自由生活的变形虫不同，变形虫的形态Acanthamoeba griffini是非常多变的，从圆形到细长的形状。细胞质的格里菲尼滋养体是主要的细胞器;细胞核大，细胞核中央有电子密集的核仁，清晰界定粗面内质网、线粒体、高尔基体系统以及内容丰富的液泡和丰富的肌动蛋白丝。肌动蛋白是真核细胞中最丰富、最保守的蛋白质之一，与许多重要的细胞功能如细胞运动有关。在细胞运动和吞噬过程中，发现预先排列的肌动蛋白丝网状结构聚集在质膜附近，提供了一个框架，通过细胞突起，如片状足、丝状足和内吞结构，允许快速的形态变化。我们小组在其他自由生活的变形虫中也做了类似的观察，例如Acanthamoeba castellanii［31),Acanthamoeba royreba［32］.

我们的结果表明格里菲尼具有低在体外细胞致病性，与以前的报告一致[33]关于这种寄生虫对Vero细胞培养的细胞病变效应。在MDCK细胞和之间的相互作用格里菲尼光镜下观察，24 h后单层细胞病变明显。透射电镜观察，细胞形态基本正常。然而，滋养体通过吞噬细胞的不同大小的结构产生了一些细胞的局部损伤，通过吞噬部分细胞，这种行为以前在其他细胞中观察到Acanthamoebae如答:castellanii和A. royreba［34，35］.有趣的是，MDCK单层细胞在条件培养基中也受到了轻微的损伤，说明滋养体产生了一些可溶性的溶解因子。

虽然格里菲尼没能引起中枢神经系统感染的小鼠GAE模型,他们的入侵能力证明,与未成年人感染的病人容易解决它是孤立的,以及化验用MDCK细胞,显示细胞病变效应在比例低于报道其他独立生存的变形虫。

到目前为止,Acanthamoeba7种不同基因型(T2、T3、T4、T5、T6、T11和T15)的spp分离株均与Acanthamoeba角膜炎(AK) (27，29，36- - - - - -39］.然而，全世界AK病例中最普遍的基因型是T4基因型[39］.

之前的研究报告称AcanthamoebaAK病例中T3基因型。然而，这只是T3基因型作为AK致病因子的第9份报告，据我们所知，这是在美洲大陆的第2份关于该基因型临床病例的报告。其他作者从包括中国、法国、香港、日本、西班牙、瑞典、伊朗、英国和美国在内的多个国家的临床病例中分离出了T3基因型，其百分比从1%到13%不等[27，29，36，40- - - - - -44］.此外，这些观察结果并不令人惊讶，因为如前所述，据报道T4基因型在临床和环境来源中都是最丰富的基因型[39，45]，是全球约80%报告感染病例的病原体[42］.

关于基因型T3的环境隔离，分离物的数量也低，因此，的AK例因T3低数目可以被也与此相关的基因型是在环境中较不丰富的是基因型T4和其他常见的基因型在环境中的基因型如T5或T7。基因型T3已经从环境在许多国家，包括巴西为独立46)、智利(47]，埃及[17]， 香港 [27)、伊朗(48]， 菲律宾 [49)、马来西亚(50]，以及台湾[51］.为了进一步确定T3基因型在环境和临床病例中的潜在病原体地位，需要在全球范围内开展进一步的流行病学研究和致病性研究。然而，最近的一项系统分析Acanthamoeba基因型频率与来源和致病性相关的结论是，T4实际上是最常与人类疾病相关的基因型，即使考虑到其在一般环境中的丰度。此外，T3和T11是T4的近亲，它们是第二和第三常与AK相关的[52］.应进一步开展T3基因型致病性的流行病学研究，以确定T3基因型在环境和临床病例中的致病状态。

最后，我们还测试了该菌株对目前用于AK病例的一线治疗的敏感性。实验结果表明伏立康唑能抑制小鼠的生长格里菲尼在非常低的浓度下，使其成为治疗AK病例的一线药物。最近的其他研究也报道了伏立康唑对临床起源的潜在致病性菌株具有类似的活性[23，53甚至在西班牙使用伏立康唑治疗一名AK患者取得了成功[22］.

综上所述，我们的观察表明Acanthamoeba griffini和其他的没有明显区别吗Acanthamoeba种，此外，在体外细胞病变效应与其他低毒性自由生活阿米巴类似Acanthamoeba royreba并且可能是滋养体产生的分解因子较少的结果。该变形虫是从临床病例中分离出来的，属于T3基因型，其他致病物种也属于该基因型，具有临床相关性。发现这一点也很重要格里菲尼对目前用于治疗AK的药物敏感。为了更好地了解该病的发病机制，需要进一步利用生物化学和分子生物学方法进行研究。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项工作部分得到了RICET赠款（FIS研究合作项目第RD12/0018/0012号项目）、西班牙马德里西班牙卫生部和FIS PI10/01298项目的支持“原生动物病在自由生活中的出现：分子鉴定和细菌鉴定，以确定是否能有效地将原生动物运输到其他动物身上。”Carmen M.Martín-Navarro由加那利群岛拉帕尔马的加那利基金会Manuel Morales提供博士后资助。Maria Reyes Batle由大西洋国际学院的CEI Canarias提供资助。Jacob Lorenzo Morales由西班牙财政部的Ramón y Cajal次级方案提供支持经济与竞争力研究院RYC-2011-08863。作者还感谢莫尼卡·冈萨雷斯·拉扎罗博士的批判性阅读、有益的评论和对论文的批改。

参考文献

1. J. F. de Jonckheere，《棘阿米巴的生态学》，传染病综述，第13卷，第2期5、页。S385-S387, 1991。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
2. S. Rodriguez-Zaragoza，“自由生活的变形虫生态学”，微生物学评论，第20卷，第2期。3，页225-241,1994。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
3. Z. Szénási, T. Endo, K. Yagita和E. Nagy，“对导致人类疾病的“自由生活”变形虫的隔离、识别和日益重要的重要性，”医学微生物学杂志，第47卷，第1期，第5-16页，1998年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
4. t·j·布朗，r·t·m·柯森，e·a·凯斯，"变形虫从南极的土壤和水，”应用与环境微生物学，第44卷，第5期。2，页491-493,1982。查看在：谷歌学术搜索
5. F. Rivera, M. Galvan, E. Robles, P. Leal, L. González，和A. M. Lacy，《被原生动物污染的墨西哥瓶装矿泉水》，杂志原生动物学第28卷第2期1，页54-56,1981。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
6. V. Muñoz, H. Reyes, P. Toche, C. Cárcamo, and B. Gottlieb， " Aislamiento de amebas de vida libre en piscinas públicas de Santiago de Chile， "Parasitologia上面，第58卷，第3-4号，第106-111页，2003年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
7. J.Barbeau和T.Buhler，“生物膜增加了牙科单位水线中自由生活阿米巴的数量，”微生物学研究，卷。152，没有。8，第753-760，2001。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
8. C. Paszko-Kolva, H. Yamamoto, M. Shahamat, T. K. Sawyer, G. Morris, and R. R. Colwell， " Isolation of变形虫和假单胞菌和军团菌洗眼站的sp. "应用与环境微生物学(第57卷)1，页163-167,1991。查看在：谷歌学术搜索
9. F.Rivera、G.Roy Octla、I.Rosas、E.Ramirez、P.Bonilla和F.Lares，“从墨西哥城及其周围的大气中分离出的阿米巴，”环境研究，第42卷，第1期，第149-154页，1987年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
10. A. J. Martínez，“是Acanthamoeba脑炎的机会性感染？”神经学，第30卷，第6期，第567-574页，1980年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
11. T.K.H.Butler，J.J.Males，L.P.Robinson等人，“六年回顾Acanthamoeba角膜炎在新南威尔士州，澳大利亚：1997-2002”临床和实验眼科第33卷第3期1，第41-46页，2005。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
12. C.D.Illingworth和S.D.Cook，“棘阿米巴角膜炎，”眼科学的调查，第42卷，第2期6、1998年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
13. J. Y. Niederkorn, J. E. Ubelaker, J. P. McCulley等人，“不同动物物种的角膜对体外结合和侵袭的敏感性卡斯特拉尼棘阿米巴，“调查眼科学和视觉科学第33卷第3期1，第104-112页，1992。查看在：谷歌学术搜索
14. T. K.索耶，“Acanthamoeba griffini，一种海洋变形虫的新种，”原生动物学杂志，卷。18，第650-654，1971。查看在：谷歌学术搜索
15. D. R. Ledee, G. C. Booton, M. H. Awwad等人，“使用线粒体16s rDNA序列对棘阿米巴临床分离株进行分类的优势，”调查眼科学和视觉科学，第44卷，第5期。3，页1142-1149,2003。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
16. D. V. Seal， "Acanthamoeba角膜炎最新进展——发病率、分子流行病学和治疗新药眼睛，第十七卷，第二期8，第893-905页，2003。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
17. J. Lorenzo-Morales, A. Ortega-Rivas, E. Martínez等，“埃及尼罗河三角洲地区淡水环境样本中属于T1、T2、T3、T4和T7基因型的棘阿米巴分离物”，Acta Tropica号，第100卷。1-2，第63-69页，2006。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
18. 土壤变形虫的纯化、无菌培养和描述。Acanthamoebasp。”杂志原生动物学，第4卷，176-182页，1957。查看在：谷歌学术搜索
19. G. S. Visvesvara， "致病性和机会主义自由生活的变形虫"，刊于临床微生物学手册P. R. Murray, E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover, R. H. Yolken, Eds。，第1383-1390页，ASM出版社，美国华盛顿特区，第7版，1999。查看在：谷歌学术搜索
20. F.Rivera，F.Lares，E.Gallegos等人，“墨西哥伊达尔戈三个度假胜地天然热水中的致病性阿米巴，”环境研究，第50卷，第289-295页，1989年。查看在：谷歌学术搜索
21. C. G.卡伯特森，J. W.史密斯，H. K.科恩，J. R. Minner， "小鼠和猴子的实验感染Acanthamoeba，“美国病理学杂志1959年，第35卷，185-197页。查看在：谷歌学术搜索
22. F.Arnalich Montiel，M.C.Martín-Navarro，J.L.Alióet al.，“眼内播散性青光眼的成功监测和治疗”Acanthamoeba，“眼科档案，卷。130，第1474至1475年，2012。查看在：谷歌学术搜索
23. C. M. Martín-Navarro, A. López-Arencibia, F. arnalick - montiel, B. Valladares, J. E. Piñero，和J. lorenzoo - morales，“评价市售莫西沙星和voriconazole滴眼液对临床菌株的体外活性Acanthamoeba，“格雷夫眼科临床和实验档案， vol. 25, pp. 2111-2117, 2013。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
24. C. M. Martín-Navarro, J. Lorenzo-Morales, M. G. Cabrera-Serra等人，“氯己定敏感性的潜在致病性Acanthamoeba从西班牙加那利群岛特内里费无症状人群接触镜病例中分离的菌株，”医学微生物学杂志(第57卷)11，第1399-1404页，2008。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
25. J. Lorenzo-Morales, A. Ortega-Rivas, P. Foronda, E. Martínez，和B. Valladares，“病原的分离和鉴定Acanthamoeba西班牙加那利群岛特内里费岛的水源寄生虫学研究第95卷第1期4，页273-277,2005。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
26. M. Niyyati，J.洛伦佐-Morales的，S. Rezaie等人，“基因分型Acanthamoeba从伊朗的临床和环境标本分离”实验寄生虫学号，第121卷。3，页242 - 245,2009。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
27. G. C. Booton, D. J. Kelly, Y. W. Chu等，“从角膜刮拭标本、隐形眼镜、晶状体和家庭供水中分离棘阿米巴物种的18S核糖体DNA分型和跟踪Acanthamoeba香港的角膜炎患者，”临床微生物学杂志，卷。40，不。5，第1621至1625年，2002年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
28. K. Tamura, D. Peterson, N. Peterson, G. Stecher, M. Nei, and S. Kumar，“MEGA5:使用最大可能性、进化距离和最大精简方法的分子进化遗传学分析”，分子生物学与进化第28卷第2期10, pp. 2731-2739, 2011。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
29. G. C. Booton, G. S. Visvesvara, T. J. Byers, D. J. Kelly，和P. A. Fuerst，“鉴定和分配Acanthamoeba与非角膜炎感染相关的物种基因型临床微生物学杂志号，第43卷。4, 2005。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
30. F. C. Page，“淡水和土壤体操的新钥匙和培养的指导”藻类和原生动物的培养收集，第92-96页，英国坎布里亚淡水生物协会，1988。查看在：谷歌学术搜索
31. A. González-Robles, G. Castañón, V. I. Hernández-Ramírez等，”Acanthamoeba castellanii:锕系细胞骨架的鉴定，实验寄生虫学，第119卷，第411-417页，2008。查看在：谷歌学术搜索
32. A. González-Robles, L. Salazar-Villatoro, M. González-Lázaro, M. Omaña-Molina，和A. Martínez-Palomo，”VahlkampfiaSp:培养滋养体的结构观察，实验寄生虫学，卷。130，第86-90，2012。查看在：谷歌学术搜索
33. J. F. de Jonckheere，“细胞培养中的细胞病变效应和毒性小鼠的36种类型菌株，属于19个不同Acanthamoebaspp。”应用与环境微生物学第39卷第3期4，第681-685页，1980。查看在：谷歌学术搜索
34. A. González Robles, G. Castañón, A. R. Cristóbal Ramos et al. "Acanthamoeba castellanii：在cytophatic机制的结构基础，”实验寄生虫学，第114卷，133-140页，2006。查看在：谷歌学术搜索
35. A. González-Robles, L. Salazar-Villatoro, M. Omaña-Molina, J. Lorenzo-Morales，和A. Martínez-Palomo，”Acanthamoeba royreba:形态特征和在体外细胞病理效应”,实验寄生虫学号，第133卷。4, pp. 369-375, 2013。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
36. A. H. maghood, J. Sissons, M. Rezaian, D. Holder, D. Warhurst, and N. A. Khan， "Acanthamoeba来自英国和伊朗的T4基因型和来自临床分离株的T2基因型，”医学微生物学杂志第54卷第5期8，页755-759,2005。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
37. G. Spanakos, K. Tzanetou, D. Miltsakakis, E. Patsoula, E. Malamou-Lada，和N. C. Vakalis，“致病基因分型Acanthamoebae临床分离物呈T5基因型的报告寄生虫学国际，卷。55，没有。2，第147-149，2006年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
38. J. Lorenzo-Morales, R. morcilo - laiz, C. M. Martín-Navarro et al. "Acanthamoeba西班牙一名硬质透气性隐形眼镜佩戴者因T11基因型引起的角膜炎隐形眼镜和前眼第34卷第3期2, pp. 83-86, 2011。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
39. J.洛伦佐·莫拉莱斯、C.M.马丁纳瓦罗、A.洛佩斯·阿伦西亚、F.阿纳利希·蒙蒂尔、J.E.皮涅罗和B.瓦拉达雷斯，”Acanthamoeba角膜炎:一种在世界范围内日益重要的新兴疾病?寄生虫学的趋势，第29卷，第2期4，页181-187,2013。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
40. M. Niyyati, J. Lorenzo-Morales, S. Rezaie等人，“伊朗一名美容软性隐形眼镜佩戴者因T3型棘阿米巴和Vahlkampfia混合感染的首次报告，”实验寄生虫学第126卷第1期1，第89-90页，2010。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
41. M. M. Rahman, K. Yagita, A. Kobayashi等，“利用核和线粒体小亚单位核糖体RNA对日本临床棘阿米巴分离株的遗传特征研究”，韩国寄生虫学杂志， vol. 51, pp. 401-411, 2013。查看在：谷歌学术搜索
42. A. Risler, B. coupatg - goutaland, M. Pélandakis，“基因分型和系统发育分析Acanthamoeba与角膜炎相关的分离物，”寄生虫学研究，第112卷，第112期。11, pp. 3807-3816, 2013。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
43. N. Sharifi, S. Botero-Kleiven, D. Öhman, A. Barragan，和J. Winiecka-Krusnell，“基因型特征Acanthamoeba引起瑞典患者眼部感染的sp.:在一个持久性角膜炎病例中识别T15基因型斯堪的纳维亚传染病杂志，第42卷，第2期10，页781-786,2010。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
44. 张颖，孙旭东，王志强等，“我国北方地区角膜炎患者棘阿米巴18S核糖体DNA基因型的鉴定”，调查眼科学和视觉科学第45卷第5期第6页，1904-1907,2004。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
45. R. Siddiqui和N. A. Khan，“生物学和发病机制Acanthamoeba，“寄生虫和向量2012年第5卷第6条。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
46. K. Caumo和M. B. Rott， "Acanthamoeba在巴西南部的游泳池中使用T3, T4和T5，Acta Tropica，第117卷，第117号3, pp. 233-235, 2011。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
47. B. Astorga, J. Lorenzo-Morales, C. M. Martín-Navarro et al. "Acanthamoeba属于T3、T4和T11:基因型分离自智利圣地亚哥的空调机组，”真核微生物学杂志，第58卷，第2期6，第542-544页，2011。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
48. R. Solgi, M. Niyyati, A. Haghighi等人，“耐热性Acanthamoeba从伊朗西北部的温泉中分离出来的"水与健康杂志，第10卷，第5期。4, pp. 650-656, 2012。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
49. W. L. Rivera和D. E. Adao，“18s核糖体dna基因型的鉴定Acanthamoeba与菲律宾隔绝，”热带医学和寄生虫学年鉴第102卷第1期8，页671-677,2008。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
50. l l。Chan J.-W。Mak Y.-T。低,T.-T。Koh, I. Ithoi，和S. M. Mohamed， "隔离和描述Acanthamoeba来自马来西亚吉隆坡的空调，"Acta Tropica，第117卷，第117号1，页23-30,2011。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
51. S.-W。黄和b m。徐，“分离和鉴定Acanthamoeba利用文化富集PCR结合台湾春季游憩区”Acta Tropica，第115卷，第3期，第282-287页，2010年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
52. S. K. Maciver, M. Asif, M. W. Simmen, J. Lorenzo-Morales， " A systematic analysis ofAcanthamoeba基因型频率与来源和致病性相关：T4被确认为富含病原体的基因型，”欧洲原生动物学杂志，第49卷，第2期，第217-221页，2013年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
53. a.m. Cabello-Vílchez, c.m. Martín-Navarro, a.b López-Arencibia等，“伏立康唑作为一线治疗潜在致病性药物Acanthamoeba从秘鲁压力。”寄生虫学研究，第113卷，第113期。2, pp. 755-759, 2014。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索

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