新型砷纳米颗粒在抑制细胞外和细胞内增殖方面比As (III)更有效和更低毒性杜氏利什曼原虫

摘要

内脏利什曼病是由原生动物寄生虫引起的一种病媒传播的热带疾病，威胁着全世界约3.5亿人杜氏利什曼原虫．像砷和锑这样的金属已被用于治疗由动质体寄生虫引起的利什曼病等疾病。砷(III)在相对较高的浓度(30μg/mL)已被证明具有抗利什曼活性，但据报道该浓度在一些实验哺乳动物系统中是有毒的。纳米尺寸的金属(0)颗粒已经被证明比它们的高氧化态形式更有效。目前还没有关于砷纳米颗粒(as - nps)作为抗利什曼病剂的信息。我们测试了我们实验室首次开发的As-NPs的抗利什曼特性。As-NPs抑制了体外生长，耗氧，感染和巨噬细胞增殖多诺瓦尼此外，这种抗利什曼活性对小鼠巨噬细胞的细胞毒性作用相对较小。从我们的研究结果可以明显看出，As- nps比As (III)更有潜力作为一种抗利什曼病剂。

1.介绍

内脏利什曼病或黑热病是一种在世界热带和亚热带地区（包括印度次大陆）发生的传染病，由原生动物寄生虫引起，杜氏利什曼原虫．多诺瓦尼在其生命周期中有两种形态:在白蛉载体中肠内活动的有鞭毛的细长原鞭毛体和存在于哺乳动物宿主巨噬细胞吞噬酶体复合体中的不活动的无鞭毛卵形体。无鞭毛体的存活和增殖，随后通过逃避宿主免疫机制再次感染新的巨噬细胞，确保了疾病在哺乳动物宿主中的进展。该病每年的总流行人数约为1 200万人，面临危险的人口约为3.5亿人。据估计，全世界每年约有50万例内脏利什曼病[1- - - - - -4]．

像砷和锑等两种密切相关的金属体是治疗由Kinetoplastid寄生虫引起的疾病的选择药物。锑和砷是同一组，周期表的同一组XV的成员，并通过相同的通道运输到细胞中，载体[5]，以及泵[6]．有趣的是，抗砷利什曼虫物种对锑具有交叉抗性[7，8].之前，已证明30 μg/mL亚砷酸钠具有抗利什曼活性[9]．然而，据报道，这种浓度的砷在一些系统中是有毒的[10，11]结果发现，芳香族砷化合物对锥虫最具活性。这些含砷药物对锥虫而非宿主的选择性明显是由芳香环结构赋予的[12，13]．有前途的体外用纵向胶质剂获得胰蛋白酶活性[14]．

纳米药物已被证明比传统药物有效得多。如今，纳米医学正迅速发展成为广泛研究的有效治疗工具[15，16]．在利用纳米医学治疗利什曼病的跨学科领域，世界各地开展了各种令人兴奋的新研究[17- - - - - -20.]．到目前为止，只有少数报道描述了金属纳米颗粒作为抗利什曼剂的使用[21- - - - - -23].尽管使用砷（III）形式作为抗利什曼原虫药物，但砷纳米颗粒（作为NPs）的使用尚待报道。

在我们的实验室中，首次合成了稳定的黄棕色球形纳米颗粒[24]．本研究的目的是研究As的抗利什曼作用是否在其纳米颗粒形式中增强。在这里，我们测试了As- nps在比As (III)低很多倍的浓度下对这种寄生虫的生长、耗氧量、传染性和细胞内增殖的影响。

2.材料和方法

2.1. 试剂和质粒

除非另有说明，否则所有生化物质，如FCS、抗生素和G418都是最高质量的，从Sigma Chemical Co.（美国）购买。pTEX EGFP质粒是英国伦敦卫生和热带医学院Martin C.Taylor博士慷慨赠送的礼物。

2．2.寄生虫文化

前鞭毛体多诺瓦尼（MHOM / IN / 83 / AG83）在含有10％热灭活的FCS（胎牛血清），25mM HEPES，2mM L-谷氨酰胺，50U / ml青霉素和50的RPMI 1640培养基中在23℃下培养。 μ克/毫升链霉素。寄生虫接种密度为1 × 10⁶细胞/mL培养3 d，得到指数生长的对数期细胞，用于寄生虫的传代培养。

2.3.As NPs的制备和电子显微镜

元素灰色砷(0)，在散装阶段(As₄)，为固体，不溶于水溶液。在通常情况下，元素砷的核心覆盖一层氧化物。因此，在水介质中很难评估元素砷（0）的效果；这就是为什么砷（0）不能应用于细胞培养基中。砷（0）只有通过使其成为纳米颗粒，才能使其水溶。本研究中使用的纳米颗粒是通过简单的湿化学程序制备的，并通过先前公布的SEM和TEM进行了表征[24].简而言之，在典型程序中，1.0 纳索毫升₂(LOBA Chemicals)浓度为1.0 × 10^−2.M与12 mL蒸馏水混合，在此溶液中加入0.6 mL冰冷的NaBH₄加入浓度为1.0 × 10的溶液^-1M.混合物在室温下静置2小时，出现黄褐色As(0)溶液。溶液进一步加热至~60°C 15分钟，冷却至室温。As(0)的最终浓度为735μM。

对As(0)溶液的SEM、TEM和DLS (Malvern)测量表明，粒子呈球形，计算出的平均粒径为76 nm(见补充材料中的补充图1)http://dx.doi.org/10.1155/2014/187640)．DLS测量是在Malvern Nano ZS仪器中进行的，该仪器配备了4 mW He-Ne激光器(λ= 632.8 nm）根据制造商的协议。已测量溶液的zeta电位，发现其为−18.1 mV，表明粒子带负电。详细的表征在早些时候公布[24]．

2.4.生长动力学多诺瓦尼使用不同浓度的As-NPs

寄生虫接种密度为0.5×10⁶细胞/ ml并在23℃下在5mL RPMI-1640培养基中孵育24小时。孵育后，0.6×10⁶细胞/mL进一步培养，不添加或添加不同浓度的As-NPs。在纽鲍尔改良计数室(血球计)中使用相差显微镜以24小时为间隔连续2天计数前鞭毛体数量。从三个独立的实验中每组的平均细胞数被绘制成图形。集成电路_50.通过在与使用的AS-NPS与AS-NPS孵育24小时后绘制细胞数的绘制来确定值。

2．5．As-NPs和NaAsO的细胞毒性试验₂((3)]利什曼虫前鞭毛体

根据前面发表的程序进行了该测定[25]．简而言之,登录阶段利什曼虫细胞（1×10⁶在23°C的生长培养基中，在不使用或使用指定浓度的As NPs或As（III）溶液的情况下，在规定的时间间隔内培养96孔板中每个孔的细胞。每个时间点的每个浓度一式三份。处理后，10 μ向每个孔中加入1个MTT溶液（CCK-8，Sigma），然后用微孔板读取器（BioRad；型号：iMark）每隔1小时至3小时收集读数根据制造商的协议。计算每组1到3小时的平均读数。对照组和处理组中的活前鞭毛体百分比()，并以图形表示。确定标准误差和标准偏差，并绘制相应的图。

2.6。As-NPs对巨噬细胞的细胞毒性试验

5000个RAW 264.7细胞接种于96孔板的每孔中，37℃孵育24小时。第二天，在37°C的新鲜培养基中，用指定浓度的As-NPs处理这些细胞24和48小时。每种浓度、每种时间点用四口井。一组未处理的细胞作为对照。治疗后，100μ每孔加入10个新鲜培养基μL的MTT试剂(CCK-8, Sigma)，随后，每隔1小时至4小时用酶标仪(BioRad;模型没有。根据制造商的协议。计算了每组一到四小时的平均读数。对照和不同浓度As-NPs处理的活细胞的定量来自这些平均值()绘制为直方图。在另一个实验中，生成标准曲线来确定MTT细胞数和od值的等效性。值是通过配对来确定的-在未处理组和用As NPs处理组之间进行试验。

2.7.EGFP质粒转化为多诺瓦尼promastigote.

将空质粒EGFP(增强型绿色荧光蛋白)转化为多诺瓦尼原鞭毛被电穿孔[26利用Bio-Rad基因脉冲星仪器，使用450 V和550 VμF电容。简而言之，对数期晚期的原鞭毛(0.5-1.0 × 10⁷)中午12点收割 g（4°C）10分钟 min，并在电穿孔缓冲液（21）中洗涤两次 赫普斯，137毫米 毫米氯化钠，0.7 嗯，不₂阿宝₄， 6 mM葡萄糖，pH 7.4)。细胞最终以1 × 10的密度悬浮⁸取0.40 mL，取0.2 mm冷冻电孔比色皿。30微克的质粒DNA溶解在40μ将电穿孔缓冲液L加到比色皿中，冰温10分钟。细胞在冰上再孵育10分钟，并加入10 mL无药生长培养基(rmi -1640)。经过24小时的苏醒，20小时μg/mL G418，在26℃下轻轻摇匀10 d。通过显微镜观察转染细胞的存在情况(补充图2)，药物浓度随着每个传代逐渐增加。最后，所有转染的细胞维持在300μG418的g / mL。

2.8。氧消耗的测量多诺瓦尼使用Gilson Oxygraph

用Gilson Oxygraph(型号:Gilson Oxygraph 5)测定寄生虫耗氧量6）根据前面发布的程序[27].以1×10的密度接种的寄生虫⁶细胞/mL 37℃孵育24小时。从这里，1 × 10⁶进一步培养细胞，不含或含指示浓度的As- nps或As (III)。孵育后，1 × 10⁶在PBS中采集经处理或未经处理的寄生虫细胞，并将其转移到氧计细胞中，以记录耗氧量。每一组的耗氧量测量25秒。通过添加焦亚硫酸钠测量氧计细胞中溶解在PBS中的总氧，并以100%表示。平均值为图中显示了寄生虫细胞耗氧量百分比的三个独立测量值使用未配对的数据计算值-测试。

2.9。巨噬细胞与利什曼虫前鞭毛体

RAW 264.7细胞系(ATCC TIB-71)，用于感染研究杜氏利什曼原虫前鞭毛体是一种转化的小鼠巨噬细胞系，该领域的一些研究人员经常使用[28]．将原料264.7细胞接种到盖玻片上并感染L.d。稳定表达EGFP的寄生虫(寄生虫/巨噬细胞= 20:1)。37℃孵育4小时后内化，用培养基清洗两次，去除未吞噬的原鞭毛。将原溶液在各自的培养基中稀释到所需的浓度。然后，在37°C条件下，不添加或添加指定浓度的As- nps或As (III)，孵育包含盖板的指定时间段。然后用DAPI染色固定细胞。尼康倒置荧光显微镜(Nikon Eclipse Ti-U)用GFP和UV滤镜(用于DAPI)观察感染细胞和感染细胞内的寄生虫阳性点。图片以TIFF图像格式拍摄，并在adobephotoshopcs5中进行处理和合并。

从图像中，计算总巨噬细胞数和感染巨噬细胞数。还测定了代表内化寄生虫（无鞭毛体）的GFP阳性点状点的数量。由此获得的每100个感染细胞的点数与相应浓度的As NP和IC绘制_50.从图中相应地确定值。

为了研究将寄生虫添加到巨噬细胞后的附着情况，在4°C下培养4小时。随后的处理过程与受感染组相似。

为了观察这些NPs的固化效果，将As-NPs (2μM)加入感染24小时后的巨噬细胞，并进一步孵育24和48小时。每个感染细胞内的总细胞数和平均寄生虫阳性(+)点数(来自三个独立的实验)被计算并以图形表示。

2.10。统计分析

所得结果的统计显著性通过以下分析确定：标准差，配对-未配对测试-test和Fisher精确测试。

3.结果

3.1。在抑制生长和氧气消耗时，AS-NPS更有效利什曼虫原鞭毛比As (III)多

不同浓度As- nps和As (III)对紫花苜蓿生长的影响多诺瓦尼在相差显微镜下用血球计定量测定原鞭毛。的集成电路_50.As NP的值为2.37 μ使用从24小时样本中获得的寄生虫细胞数测定M（方法和图1(一))为了进一步证实我们的结果，用MTT法检测As NP和As（III）对前鞭毛体的细胞毒性。我们的结果清楚地表明，用2 μ与其他较低浓度的As NPs（0.1和1.0）相比，72小时的M As NPs对前鞭毛体生长的影响最为显著 μ米)(图1 (b)（i） ）。而在相同浓度范围内，As（III）对寄生虫的存活影响较小（图中的红线、蓝线和绿线）1 (b)(ii))，只有10-20处理才观察到类似的杀伤效果μAs (III)的管理远高于As- nps的管理(图1 (b)(2))。MTT法测定的结果与血球计数法测定的结果相一致。

在春季表现出生长抑制活性，以对寄生虫呼吸的影响测试了突出的突起和（III）。呼吸活动多诺瓦尼寄生虫直接通过使用材料和方法中所述的氧计测量耗氧量的百分比进行评估。使用2 μ与细胞未经治疗的细胞相比，MS-NPS 24,48和72小时（图2(一个))．但是，正如所料，寄生虫用2次治疗 μM As（III）对其耗氧量几乎没有影响（图2 (b)插图）。甚至10倍的浓度为（III）甚至浓度的浓度较小，对春季呼吸的影响较小（图2 (b))．As- nps和As (III)对寄生虫耗氧量的影响有统计学意义(见表)1(一)和1(b))。

3.2. As-NP比As（III）更有效地降低病毒的传染性利什曼虫promastigote.体外

As-NPs对寄生虫生长和代谢活性的抑制作用使我们研究了它们对寄生虫感染性的影响利什曼虫寄生物体外我们还比较了As NPs和As（III）对前鞭毛体感染性的影响。在As NPs存在的情况下感染前鞭毛体的巨噬细胞有少量GFP阳性斑点（图3（a）；(F)和(H))表明巨噬细胞中寄生虫负担降低(图)3（a）；面板（b）和（d）和表2（一种））。然而，在AS（III）存在下，内化寄生虫（AMASTIGOTES）的数量与控制集中的那些非常相似（图3（a）；比较面板(J) (L)和(B)、(D) (F), (H))。集成电路_50.在感染研究中使用As-NPs浓度范围(37°C孵育24小时)确定的值为1.5μM(图3（b）)．此外，通过纳米颗粒的处理，附着在巨噬细胞表面的荧光寄生虫的数量也减少了，这表明寄生虫在内化之前对巨噬细胞的附着有抑制作用(图)3（c）；比较面板(B)和(D)和表2(b))。这些实验重复了几次，得到了非常相似的观察结果。

3.3。AS-NPS阻断肠道术中的增殖利什曼虫寄生虫

在前面的部分中，我们已经证明了AS-NP对寄生虫的附着和感染性的抑制作用。此外，我们询问纳米颗粒是否可以对巨噬细胞内寄生虫的前染利产生影响。解决此问题，24小时后巨噬细胞在另外24小时和48小时内用AS-NPS治疗（图4（a）; 面板（G）、（H）和（I）、（J）分别。我们的结果清楚地表明，As NPs还可以显著阻止巨噬细胞内的寄生虫增殖（图1）4（a）:比较面板(D)， (F)与(H)， (J)和图4 (b)).而As NP未处理细胞中的寄生虫阳性荧光斑点随时间显著增加（图4（a）；(B)， (D)和(F))，被处理的感染细胞中的寄生虫阳性点保持静止(图4（a）:将(B)， (D)和(F)与(H)和(J)和图进行比较4 (b):在治疗过的样本中:寄生虫阳性点)。在第一次添加24小时后重复添加新鲜As-NPs没有产生多大效果(数据未显示)。实验结果具有良好的重复性和可重复性由Fisher精确检验确定的这个实验的值具有统计学意义(图)4 (b))．

在这里，为了探索As NPs处理是否对巨噬细胞本身有任何影响的可能性，我们拍摄了一些经纳米颗粒处理的巨噬细胞的显微图像。图5(一个)显示了这些图像的代表性，这些图像清楚地表明经As NPs处理的巨噬细胞的形态（相和DAPI）没有变化。此外，我们还通过MTT法检测了经纳米颗粒处理的巨噬细胞的活性。图形5 (b)显示as - nps处理导致活细胞中25%的损失与未处理对照相比。值得注意的是，由于在本实验所需的处理过程中丢失，对照组的活细胞数(~4000)比初始种子细胞数(5000)减少。

4.讨论

元素砷(0)不溶于水介质。它在自然界主要以两种生物相关的氧化态存在:砷酸盐[as (V)]和亚砷酸盐[as (III)]。在蛋白质中，As (III)结合半胱氨酸和组氨酸残基，导致细胞内谷胱甘肽的消耗。在五价态下，砷与磷酸盐竞争，特别是在柠檬酸循环中，以改变ATP的产生[29]．人们对砷的抗菌、抗病毒和抗真菌活性进行了多项研究[30.]．根据之前的一份报告，有30人μg / ml为（iii）（相当于约230 μM)被证明是反利什曼的[9]．哺乳动物系统中这种浓度非常有毒[10，11].本研究首次证明新型As NPs比As（III）具有更好的抗利什曼原虫功效。值得注意的是，As NPs对寄生虫的生存能力、耗氧量和传染性具有显著抑制作用的浓度对于As（III）来说太低显示对寄生虫的任何显著抑制作用（图1- - - - - -4)．此外，与As- nps相当的抗利什曼效应只有在浓缩As (III) IC至少10倍的情况下才能实现_50.结果表明，无鞭毛体对As-NPs的敏感性高于原鞭毛体。这一数据表明as - nps将具有与反利什曼原虫同样的效力体内．此外，ζ电位值表明的带负电荷的纳米颗粒可能面临没有问题，以在感染的内脏，即肝脏和脾脏中到达巨噬细胞的吞噬细胞。虽然用AS-NPS处理的宿主巨噬细胞的细胞和核形态保持不变（图5(一个))，经处理的巨噬细胞的存活率仅降低25%（图5 (b))．值得注意的是，1μM As (III)被证明具有严重的毒性体外和体内［10，11]．此外，预测其毒性程度并非凭直觉体内从体外观察。有报告显示，这两种系统的毒性水平存在显著差异[10，11]．综上所述，我们的研究结果表明，as - nps与as (III)相比，具有非常好的潜力，可以发展成为一种对宿主巨噬细胞影响较小的有效的抗利什曼病药物。

5.结论

内脏利什曼病是一种致命的疾病，每年在全世界范围内影响约500000例。很明显，其发病机制取决于巨噬细胞内寄生虫的增殖能力。如果能以某种方式控制这种增殖，病原体可能会失效。传统抗利什曼病药物的主要问题是利什曼病治疗药物的毒性和价格都很高。因此，开发更便宜、副作用更小的新药是一项长期的需求。相对较高浓度的砷（III）（30 μg/mL）已证明具有抗利什曼原虫活性；但据报道，这种浓度在一些实验哺乳动物系统中是有毒的。我们已经证明，在我们实验室首次开发的As NPs显著抑制了寄生病原体的耗氧量和细胞内增殖-NPs大约比As（III）低几倍。此外，这种抗利什曼原虫活性对小鼠巨噬细胞系的细胞毒性作用相对较小。因此，从我们的研究结果中可以明显看出，As NPs比As（III）具有更大的潜力，可以开发成一种廉价、毒性更低的抗利什曼原虫药物。

缩写

为:	砷
As-NPs:	砷的纳米颗粒
L.d．:	杜氏利什曼原虫
扫描电镜:	标准错误的意思。

利益冲突

提交人声明没有关于本文的出版物的利益冲突。

作者的贡献

Sudipta Chakraborty和Kaushik Bhar对该论文的贡献相同。

致谢

作者感谢加尔各答大学纳米科学和纳米技术研究中心、科学技术和生物技术系(DST和DBT;印度政府)的财政支持。作者感谢生物化学系高级研究中心(大学资助委员会)。Sudipta Chakraborty、Kaushik Bhar、Sandip Saha和Rajarshi Chakrabarti的研究奖学金分别由DST、UGC和科学与工业研究理事会(印度)提供。

补充材料

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版权

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