不同治疗前后皮肤利什曼病的临床及免疫学分析

抽象的

无鞭毛体从亚马逊尼群岛（La），l . venezuelensis (l)(Lv),l . (v)取代巴西橡胶树(磅)l . chagasi (l)(Lch)在游离细胞液体培养基中培养。患者(从1994年1月到2000年8月随访了皮肤利什曼病(CL)高流行地区的不同治疗。病变缓解时间为自发缓解(SR) 7周;葡萄糖(Glu)化疗9周;用La、Lv、Lb和Lch无鞭毛虫Tosyl-Lysil氯甲基酮(TLCK)治疗和Nonidet P-40(NP-40)提取(VT)免疫治疗7周。慢性淋巴细胞白血病患者的延迟型超敏反应(DTH)伴利什曼碱皮内反应(IDR)高于健康对照组()，活动性继发性感染相对于原发性感染增加()，对活动性感染的诊断价值为1.74，对临床缓解期的诊断价值为1.81。经酶联免疫吸附试验(ELISA)表征的无瘤体抗体在临床缓解后与活动性感染相比降低()诊断值在1.50到1.84之间。免疫印迹抗原条带频率和积分光密度（IOD）CL志愿者在Glu或VT治疗后，SR血清的面积密度降低。细胞内寄生是由于通过载体接种后识别寄生虫抗原的正常抗体。VT疫苗主要诱导细胞免疫，以缓解病变和保护CL感染。

1.介绍

利什曼病是一种来自热带和亚热带的全球人畜共患疾病，人类是偶然的宿主。由于疾病流行，世界十分之一的人口(7亿人)面临感染的危险。全球有1200万例病例，内脏(VL)和CL感染的发病率分别约为每年50万和100 - 150万新病例[1，2］.在样本总体()， 85例(52.5%)患者获得寄生虫，50例(30.9%)患者血液培养分离寄生虫。同工酶分析证实，血液和皮肤中的生物是相同的，这强调了从皮肤中逃脱的寄生虫的入侵潜力[3.］.

在载体中，细胞外的前鞭毛体成熟为后循环前鞭毛体(运动)，并在昆虫叮咬后，一旦进入脊椎动物宿主的细胞，进化为无鞭毛体(不运动)。无鞭毛体最终进化回原鞭毛体形式，在被感染宿主的血液进食后，结束了循环。成熟的感染杂环原鞭毛体具有表面糖基肌醇磷脂(GIPL)和脂磷聚糖(LPG)，这两种毒力因子抑制补体系统的作用。后环原鞭毛体一旦进入宿主，通过与补体受体1、3或c反应蛋白受体结合被巨噬细胞吸收，24-72小时后转化为胞内无鞭毛体，表面无GIPL或LPG。无鞭毛体开始在巨噬细胞的寄生液泡中繁殖，抑制干扰素(IFN)γ)和一氧化氮(NO)和超氧化物的产生[4］.

人类和实验动物的免疫反应是由无鞭毛体而不是原鞭毛体引起的，原鞭毛体在感染后立即进入宿主靶细胞，不被宿主免疫系统发现。无鞭毛通过抑制I类和II类MHC的表达来抑制抗原提呈，无论是基本刺激还是随后的IFN刺激γ［5- - - - - -7］.

来自寄生虫的不溶性抗原部分主要刺激CD4+ T细胞，而可溶性部分表现出混合的特征，CD4+ T细胞主要负责Th2细胞因子，CD8+ T细胞负责Th1细胞因子[8］.

残存的寄生虫会永远留在宿主体内，并可被艾滋病重新激活[9，10］.目前的挑战是识别抗原，并了解体液和细胞免疫机制如何配合免疫预防、免疫治疗和病变的临床缓解[11，12］.

的控制措施是及早发现和化疗已受到阻碍的药物，严重的副作用的毒性，并通过在寄生虫抗药性。有效和支付得起的疫苗抗利什曼病的发展一直没有实现。候选抗原，包括杀死前鞭毛体，活的减毒的寄生虫，粗寄生虫，纯的或重组的利什曼原虫蛋白质或DNA编码利什曼原虫的蛋白，以及从白蛉唾液免疫调节剂，已经使用;然而，极少数候选疫苗已经渐渐超越试验阶段[1，13］.

原核细胞和真核细胞在受到压力时，会增加热休克蛋白(HSP)的合成，以保护自身免受致死率，并代表免疫反应的目标抗原[14］.有趣的是，VT疫苗也可诱导银屑病的临床缓解[15，16]，银屑病性关节炎[17，18]，以及类风湿性关节炎[19，意外的发现[20.］.

在这篇论文中，我们提供了无鞭毛虫不溶性蛋白的免疫预防和免疫治疗作用的证据，在没有哺乳动物细胞的液体培养基中培养，通过ELISA和免疫印迹分析人原发性和继发性感染的临床缓解前后VT接种和葡聚糖治疗志愿者的体液和细胞免疫应答。

2.材料和方法

2．1．寄生虫

以下利什曼虫菌株被使用:L (L) amazonensis(拉:IFLA / BR / 67 / PH8),L (L) venezuelensis(Lv: MHOM / VE / 80 / H16),L (V)取代巴西橡胶树(磅:MHOM / VE / 75 / H27),和L（L）查加西（Lch:MHOM/BR/74/PP75）。无鞭毛体在不存在哺乳动物细胞的O'Daly液体培养基中培养[21］.第一代多价抗原和第二代单价抗原(La, Lv, Lb, Lch)疫苗已发表[15- - - - - -20.］.最后的第一代多价免疫原含1mg /mL或250μ在PBS中每利什曼原虫种类的抗原的克补充有REHYDRAGEL和4 μ克/ mL的庆大霉素。The concentration of alumina was 0.25 mL per mg (v/w) of parasitic protein.

2．2.皮肤利什曼病诊断

1994年1月至2000年8月“El Ingenio”和“La Planta”的患者中出现溃疡或结节的病例被认为是潜在的CL患者，每15天上门检查一次。采用多价利什曼碱检测IDR >5 mm, ELISA检测无鞭毛体抗原。溃疡伴发细菌感染患者给予氟沙西林(Floxapen) 100mg /kg/d口服，每8小时一次，持续10天。选择患者IDR > 5毫米,活检用真皮打孔的直径6毫米,从溃疡的边缘,和整除加工无鞭毛体的显微分析巨噬细胞May-Grunwald-Giemsa染色后,小鼠注射0.1毫升的贼,O和寄生虫文化物资的媒介21］.左臂静脉穿刺采集患者外周血，用Vacutainer进行酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹(immunoblotting)。有效的临床缓解被认为是溃疡或结节的全部消退，出现可伸缩的疤痕，没有任何炎症迹象，在缓解后的6个月随访期间没有复发。

2．3.用几种利什曼原虫无鞭毛体蛋白或葡聚糖治疗健康志愿者

研究人群()平均年龄范围5 - 62岁，45.5%为女性，分布在接受不同处理的几个组样本中，见表1，2,4．1993年10月至12月，委内瑞拉Guatire Miranda州“El Ingenio”和“La Planta”的IVIC免疫生物学实验室的工作人员将无精子蛋白免疫预防(VT)应用于易感志愿者。多价第一代疫苗在0.20 mL含200的PBS中肌注三角肌区μ每月检测3次，间隔1个月，事先签署知情同意书。在免疫治疗方面，1994年1月至2000年8月患有CL的志愿者接受了500例>3个月演化的病变μg/剂量VT，每周，在三角肌区域肌肉注射12剂。每15天进行一次家访，以发现治疗效果（表1）1，2,4）.Glu治疗在委内瑞拉加拉加斯中央大学(UCV)热带医学研究所进行，剂量为10 mg/kg/天，10天内注射，每15天随访一次。

2.4.试验纳入的主要标准

符合条件的受试者包括5至62岁的男性和女性。免疫预防的受试者为IDR -且既往无CL。另外的入选标准是在整个研究过程中使用了医学上接受的避孕方式和妊娠测试阴性(有生育潜力的女性)。对于免疫治疗，病变存在至少3个月的IDR+志愿者的诊断和治疗如上所述。

2．5．试验排除的主要标准

任何怀孕或哺乳的女性受试者均被排除在试验之外。对所有试验参与者进行了有记录的免疫缺陷史、HIV状态、机会性感染或持续未控制感染的评估，并作为排除的基础。首次服用研究药物前2周内，其药物涉及任何疫苗、过敏脱敏产品或使用局部治疗（润肤剂除外）治疗CL的受试者被排除在试验参与范围之外。已知对庆大霉素或研究药物、局部麻醉或用于试验方案相关试验的诊断剂中的任何其他成分过敏且有酗酒记录的受试者被排除在试验参与范围之外。

2.6。延迟型超敏反应

利什曼原虫抗原的IDR皮肤试验提供了DTH反应，是利什曼病细胞免疫反应的良好标志。用四种利什曼原虫(La、Lv、Lb和Lch)等浓度配制利什曼原虫皮肤试验液(多价利什曼碱)。每一种都制备了单价利什曼碱利什曼虫物种。每种情况下溶液的最终浓度都是40μ在PBS g / mL。四个μ0.1中的g 在右臂掌侧皮内注射mL，48小时后用圆珠笔技术测量反应[22］.直径>5 mm被认为是阳性IDR。

2.7。SDS-Polyacrylamide凝胶电泳

50μ考马斯蓝染色法测定每一利什曼原虫g，考马斯蓝染色法测定60μ在还原条件下，在XCell SureLock Mini-Cell (invitrogen生命技术公司)中使用Tris-glycine SDS运行缓冲液，在invitrogen公司发布的制造商说明书中，在invitage 4-20% NuPAGE三乙酸SDS- page预模凝胶中电泳[16，19，23］.蛋白用SilverXpress银或考马斯亮蓝(R-250)染色试剂盒(Invitrogen公司)染色，并用Quantity One 1D分析软件在BIORAD图像系统中分析。每一种凝胶中使用预染色分子量标记物(Biorad)。

2.8。ELISA

Antileishmania抗体在志愿者的血清无鞭毛体治疗前后进行，公布[17，19，20.，23]抗原来源于构成VT药物物质的四种利什曼原虫的无鞭毛体，作为多价提取物进行测试，并且单独不合并，如VT药物产品（La、Lv、Lb和Lch）中所示。每个ELISA板的孔涂有含有200%的溶液 μ干燥后，用含0.05% Tween 20的PBS洗涤板，后涂布含0.05% Tween 20和1%牛血清白蛋白的PBS。洗涤板，在每孔中加入血清样品(稀释为1:1000)并孵育。另一次洗涤后加入抗人IgG辣根过氧化物酶连接(Fab ')₂羊的碎片，过夜孵化。最后洗涤后加入底物ABTS(2-2 ' -偶氮-二苯并噻唑啉磺酸盐)和10μL H₂O₂.在自动ELISA阅读器（滴度仪Multiskan Plus）中读取450℃下的分析结果 牛血清白蛋白校准器，从6.25稀释至400 将ng/mL添加到指定的孔中。任何重复孔的平均浓度高于阴性对照组记录的平均浓度3个标准偏差（100 ng/mL），被认为是阳性反应。所有值均代表使用患者和健康对照血清进行的三个不同实验的重复分析平均值−. 蛋白质浓度由Lowry或BCA测定[24，25］.

2.9。Immunoblottings

50μ克在10 μ在XCell SureLock Mini-Cell (invitrogen生命技术公司)中，Tris-glycine SDS运行缓冲液在还原条件下，在invitrogen 4-20% NuPAGE三乙酸SDS- page预模凝胶中电泳[17，19，20.，23]之后，按照制造商的说明，用微型反式印迹法（Biorad）将其转移到硝化纤维纸（美国新罕布什尔州基恩市Schleicher&Schull）上。与来自不同患者血清和对照组的一级抗体反应后，用二级抗人免疫球蛋白辣根过氧化物酶进行染色（Fab′）₂羊的片段，(Amersham, UK)在室温下1:10 00稀释2小时。最后用SST (Tris-HCl 0.05 M, 0.15 M NaCl, pH 9.5)在20之间洗涤，0.05%二氨基联苯胺(w/v)， 0.03% H₂O₂(v/v)，加入0.03% CoCl，待显色后，用蒸馏水洗涤，拍照[23］.蛋白质浓度用Lowry或BCA [确定24，25］.染色后的免疫印迹从每个患者的血清中并排排列，用扫描仪扫描喷口4C和Deskcan II, 2.3程序数字化(惠普1991-1995)，然后用Gel-pro 98, 3.0 Media Cybernetic 1995-1996进行分析。获得不同波段曲线下面积对应的积分光密度(IOD)值，并计算临床缓解前后的变异系数:治疗后OD /OD预处理。值>1.0表示OD抗原升高，<1.0表示OD抗原降低。OD与每一种利什曼原虫抗原特异性结合的血清IgG一抗(13 - 150 kDa)成正比，并由患者和对照组的小鼠抗IgG (Fab’)血清显示。₂抗体

2.10。统计方法

处理组比较采用方差分析(ANOVA)模型，处理作为固定效应。为了控制多重比较，首先检验整体治疗效果的假设。如果治疗效果值<0.05，然后使用对比进行每个积极治疗组与对照组的两两比较。检验方差分析正态性和方差齐性的假设，并在适当的情况下，使用非参数方法(Wilcoxon检验、Tukey的多重比较检验)来比较治疗组。学生的-test也被使用。所有的计算都是用GraphPad Prism软件完成的。

3.结果

３．１．病人的人口统计

研究小组样本()来自La Planta，这是CL的高流行区，患病率为24.8 o/oo，在6年的随访中，不同的治疗方法使身体裸露区域的病变缓解。原发感染后出现瘢痕(49.25%)和溃疡(49.25%)的患者比例相似，而有皮肤结节的患者比例为1.5%。独特溃疡占82.57%，多发性溃疡占17.43%。溃疡面积平均厘米²范围从0.44到33.18厘米²．研究组原发病灶170个，见表1；其演变有平均月，从15天到9个月不等。

3.2。化疗和无鞭毛体疫苗治疗的患者CL中小学感染后

87例原发性病变患者的治疗分布如下:35%的病变发生了SR, 42%接受了谷氨酸疫苗，21%注射了VT疫苗。选择7周作为缓解时间的金标准，选择自无任何治疗的自然SR的CL患者。谷氨酸治疗组缓解时间为9周，VT治疗组缓解时间为7周，与金标准相似1）.2例患者接受glu治疗后无缓解静脉注射，7周后缓解。接受VT治疗的患者在7周内总共有6次剂量缓解，随访6年无复发(见表)1）.

继发感染患者()平均年龄年龄5～62岁，女性占46.87%，所有患者均有疤痕，缓解至复发的时间平均月和范围1-111个月。4例患者在原发感染引起的瘢痕边缘出现复发。总共有40个伤疤厘米²，范围为1.9-30.0 厘米²其中，独特瘢痕占65%，多发性瘢痕占35%，主要集中在右腿。复发时共新发病灶37个，溃疡87.5%，结节12.5%。独特溃疡(75%)多于多发性溃疡(12.5%)，独特结节(9.4%)多于多发性结节(3.1%)2）.继发性感染中，4例新发病变患者在8周内出现了缓解时间，7例接受Glu治疗的患者在8周内也出现了缓解(表)2）.4例SR患者复发，3例在4周内再次出现SR, 1例需要10 Glu剂量，10周内缓解。在7例继发感染患者中，4例复发，6周内无治疗缓解，3例6周内需要25个新剂量的Glu缓解(表)3.）.

３．３．CL原发和继发感染后多价利什曼碱的延迟型超敏反应

通过皮肤DTH反应分析细胞免疫，比较病变的IDR、活动性和存活率。认为反应为阳性的截止点为直径>5 mm。活动性继发感染患者的IDR较高，与活动性原发感染患者有显著差异()，而临床后缓解值相似(）.在127名以前没有CL健康志愿者，我们发现22.04％IDR积极研究组（表4）.

接种疫苗的志愿者在vt后IDR -表现出更高的IDR ()，而IDR+组的IDR相似(）.与上述数据类似(见表)5）.

对活动性感染患者的诊断价值(特异性+敏感性)为1.76，对临床后缓解患者的诊断价值(特异性+敏感性)为1.81，这说明DTH在TLCK治疗和NP-40提取后，作为诊断多价无鞭毛体leishmanine (La, Lv, Lb, Lch)多价无鞭毛体leishmanine抗原(La, Lv, Lb, Lch)的阳性工具。

3．4．在VT接种志愿者和未接种对照中，根据IDR状况判断的CL发生率

大多数CL病例(59%)在69名IDR -未接种疫苗的志愿者中诊断为寄生虫学。在这组中，26%的人服用SR, 73%的人服用Glu。在IDR+中，未接种疫苗的志愿者中发现5例CL病例(27%)，4例自行缓解，只有1例接受谷氨酸临床缓解。在61例IDR - vt后接种疫苗的志愿者中发现9例CL(14%)， 4例SR, 5例Glu治疗。在10名IDR+ vt接种后的志愿者中发现3例CL, 1例仅接受谷氨酸治疗，另外2例自行缓解。所有患者随访6年(见表)6）.

3．5．原发性和继发性感染单价无鞭毛虫抗原后CL的体液免疫

将一个值作为正值的截止点建立为IDR中的平均OD值。−) 对照组+3个标准偏差如下：La=0.41，Lb=0.40，Lv=0.44，Lch=0.41。在原发感染中，活动性CL患者血清的体液反应高于SR后()，后一种值均等于或低于截断点。继发性感染的数值相似()活动性感染的诊断价值为La=1.81、Lv=1.84、Lb=1.50和Lch=1.84，这表明单价抗原可在ELISA中用作CL的诊断工具（图1）.

拉:L (L) amazonensis；Lv:L (L) venezuelensis；磅:L (V)取代巴西橡胶树；华尔街日报:L (L) chagasi。活动前sr期和活动前vt期OD值差异无统计学意义()，高于病灶临床缓解后的值。sr后、vt后和glu治疗后缓解的患者也获得了相似的值()，证实了VT或Glu对CL患者的治疗是有效的，且与自然SR(金标准)相似。有趣的是，病变无缓解的患者glu后OD值高于病变缓解的患者sr后、vt后或glu后()，指出ELISA是一种很好的跟踪CL感染进化的工具(图2）.

32例CL患者IDR与ELISA值无显著相关性。La: 0.0098 (）;Lv: 0.0057 (）;磅:0.012 (）;华尔街日报:0.026 (）.

3.6。体液免疫与CL无鞭毛抗原和其他热带疾病

对其他热带病患者血清的ELISA检测显示，在弓形虫病、盘尾丝虫病和蛔虫病中，OD值与对照无显著性差异(）.相反，来自恰加斯病和/或活跃CL的血清具有更高的显著性()与所有利什曼原虫无鞭毛体抗原对照组相比，CL临床缓解后的OD值低于活性CL，接近临界值，与上述数据类似（图1）3.）.

3.7.不同治疗前后CL和对照组无鞭毛体抗原和血清的免疫印迹

在CL定义重要抗原的另一个工具是带在几个利什曼原虫属物种的免疫印迹频率的分析，从活动性感染和损伤的临床缓解后血清。Antigens 13 to 145 kDa revealed by 80–100% sera were selected as the most immunogenic proteins. A band was considered present if it had an optical density >10 units by densitometry analysis.

研究小组中的利什曼原虫有一组特征性的抗原。抗原乐队显示活跃的CL和post-clinical缓解患者的血清在同一病人将在同一组与印尼盾(−)控制(例如,La活跃或缓解与La IDR−控制,在活跃或缓解与磅磅IDR−控制,等等与Lv和华尔街日报)。活跃、缓解和对照IDR -组的常见条带用红色粗体表示。在各自的利什曼原虫物种中，活跃和临床缓解患者血清中显示的(对照组血清中未发现的)黑体蓝色数字(见表)5）.这表明无鞭毛体抗原可致敏B细胞受体，并在健康对照血清未发现的病变的活性和临床缓解后扩大特定寄生虫的克隆。与活动性病变患者相比，所有物种的抗原总数在临床缓解后均下降(见表)5）.对照组和患者共有的抗原解释了细胞内无鞭毛体在脊椎动物宿主中的位置，因为原鞭毛体在皮肤中被载体注射寄生虫后立即被正常免疫球蛋白识别，然后被APC、中性粒细胞和巨噬细胞吞噬。对照血清未发现而活动性皮损血清可识别的特异性无鞭毛虫抗原有8种;11磅;在Lv 4;6在华尔街日报。仅在一种利什曼原虫中发现的特异性抗原，在活性病变中具有以下分子量:La: 132;磅:115 kDa;Lv:没有;Lch: 128 kDa; after clinical remission in the group MW were: La: 100; Lb: 108; Lv: 80; and Lch: 86 kDa, respectively. In bold black numbers antigens MW 45 kDa were found in controls in La, Lb, Lv, and Lch by 100% sera, also MW 96 kDa in Lb by 100% control sera. Both antigens were not recognized by any patient’s sera (Table7)，只有通过健康的控制。在正常的落后人群中，80-100%的对照血清中La和Lv的MW为86 kDa, La和128的MW为90 kDa, Lb的MW为132 kDa，而在各自的利什曼原虫组中，CL患者的血清中没有。

4名志愿者的血清显示SR自然过程的频带频率显示14种抗原(56%)m142、132、128、120、115、104、100、98、90、86、80 53、45和27 kDa在病变缓解后下降。只有一抗原(4%)m33kda频段增加;其余10种抗原(40%)MW 136、108、74、65、60、57、50、40、35和22 kDa频率保持不变。带频率前后Glu揭示了从三个志愿者血清,显示12个抗原(41.4%)145年,132年,128年,104年,100年,70年,53岁,33岁,31日24日17日和15 kDa减少而四抗原(13.8%)83年,80年,57岁和29 kDa增加病灶缓解后,其余13抗原(44.8%)98年,86年,78年,74年,65年,60岁,50岁,43岁,40岁,35岁,27岁,22岁20 kDa保持不变。3名志愿者血清室速前后频带频率显示病灶缓解后12种抗原(37.5%)142、120、96、80、57、35、29、22、20、17、15、13 kDa降低，2种抗原(6.25%)90、60 kDa升高;其余18个抗原(56.25%)145、136、132、128、122、115、104、100、98、86、74、65、50、45、40、33、27、24保持不变。与自然sr相比，glu后和vt后低分子量抗原的谱带频率从57至13 kDa下降为主。分子量80至145 MW的谱带也减少，sr后有11种抗原，其次是6种glu后和vt后(表)8）.

3.8。密度在免疫印迹L (L) amazonensis病变缓解前后无鞭毛

变异系数计算如下：

积分光密度(IOD)面积>1.0表示抗原密度增加，< 1.0表示抗原密度减少。光密度与治疗前后血清IgG一抗成正比，各利什曼原虫无鞭毛体抗原结合强度在13 ~ 145 kDa之间，并与小鼠抗人IgG (Fab’)结合。₂抗体

SR血清中无鞭毛体抗原的免疫印迹定量分析结果显示，在原发(100%抗原)和继发(94%抗原)感染的临床缓解后，由于活动性感染结束、寄生虫得到控制后抗体浓度较低，无鞭毛体抗原的IOD显著降低。SR血清中只有一种抗原MW 70 kDa，继发性感染临床缓解后IOD增加。继发感染后血清中有6种抗原(78、65、57、50、40和29)的IOD面积增加(26.1%)，其余17种抗原(73.9%)的面积密度降低(图)4）.

VT接种志愿者初次感染后，(1)既往IDR−志愿者血清中28种抗原的IOD面积下降(90.3%)，3种抗原(9.7%)MW 145、122和22 kDa仅升高。(2)既往IDR+亚临床感染志愿者血清中有17种抗原(54.8%)IOD值降低，其余14种抗原(45.2%)IOD值升高。(3)既往治愈CL的IDR+血清中，16种抗原的IOD降低(51.6%)，其余15种抗原的IOD升高(48.4%)5）.

4.讨论

4.1。无鞭毛体治疗与TLCK诱导CL临床缓解

用TLCK处理培养的Lb无鞭毛体免疫仓鼠，感染仓鼠Lb无鞭毛体后，淋巴结淋巴细胞对有丝分裂原的T和B细胞反应逐渐增强，对刀豆蛋白a (ConA)的反应增强;(2)小鼠脾细胞对硫酸右旋糖酐和美洲商陆有丝分裂原的反应无变化;(3)感染6周后淋巴结内无寄生虫，有1 / 4小的结节，感染70天后未检出。用TLCK处理的Ld无鞭毛体预免疫仓鼠感染后，对脾脏和淋巴结细胞的有丝分裂原无明显抑制，存活1年以上，而未免疫的感染动物在感染5个月后死亡。用苯甲基磺酰氟(PMSF)处理的培养寄生虫(Lb或Ld)预免疫并感染Lb或Ld无鞭毛体的动物没有任何保护作用[26］.

4．2．皮内反应是诊断皮肤松弛症的有效工具

具有多价VT的IDR对CL监测的诊断值大于1.0，有助于了解地方病和高地方病地区的患病率和发病率。居住在没有皮肤CL的地方病地区的居民中的阳性IDR被定义为亚临床感染。在巴西南马托格罗索州的科尔吉尼奥，一个Lb流行地区，15.7%的IDR被诊断为亚临床感染利什曼宁IDR阳性，既往无感染[27];也在流行地区L (L) peruviana在秘鲁的利马、安卡什和皮乌拉，记录的IDR+病例为17.0% [28和厄瓜多尔东北部的发病率较高L (L) guyanensis和L（L）panamensis17.2%为阳性[29];所有值与委内瑞拉的数据一致:22.0% IDR+志愿者接受多价无瘤利什曼碱，健康受试者，没有CL感染。保护免疫与IDR反应和细胞免疫的关联解释了研究中IDR−(59%)的CL发生率高于IDR+(27%)志愿者。

4．3．利什曼原虫毒力的寄生虫蛋白水解酶

蛋白酶在利什曼病的发病机制中发挥重要作用，帮助寄生虫侵入哺乳动物宿主细胞并在其中繁殖。然而，很少有研究涉及丝氨酸蛋白酶在利什曼病感染中及其在宿主发病机制中的作用。用反115 kDa抗体显著降低，表明这种丝氨酸蛋白酶可能在感染过程中起作用[30.］.VT疫苗的基础是TLCK对丝氨酸蛋白酶的抑制，从而诱导CL患者的免疫预防和免疫治疗。有趣的是，其他蛋白酶抑制剂如PMSF没有效果[26］.

禁止素集中在鞭毛和鞭毛杆的表面，宿主-寄生虫的相互作用通过鞭毛杆发生。野生型禁止素的过度表达增加寄生虫的传染性[31］.VT疫苗无鞭毛体是用NP-40提取，弃上清，因此不含禁止素;因此，对表面蛋白没有抗体或细胞免疫[17- - - - - -20.］.

4.4。导致CL临床缓解的体液免疫下降

ELISA证实，特异性抗体降低了临床后病变缓解期，免疫印迹显示条带频率和IOD条带面积，指出了细胞免疫在控制感染中的基础性作用。CL患者开始VT或Glu治疗需等待3个月，以避免自愈利什曼病效应。复发患者的皮肤溃疡大小低于原发患者;因此，有可能研制出控制CL的疫苗。VT疫苗有缓解期，证明VT无鞭毛疫苗对CL治疗有效。此外，在IDR -和IDR+志愿者中，VT接种者的CL病例比IDR -未接种者低。与活性CL相比，特异性IgG抗体滴度降低SR [32］.抗体婴儿期这些特异性抗体的持续存在及其水平的急剧升高可能是VL复发的前哨信号[33]ELISA已用于使用从Lb获得的可溶性（SF）和膜富集（MF）抗原组分诊断CL。每个组分的灵敏度为89.5%，SF和MF的特异性分别为89.5%和93.4%[34］.用Lb、Ld、Lv和Lch四种VT疫苗不溶性无鞭毛体抗原也获得了类似的结果。单价无鞭毛原虫ELISA结果表明，在原发活动性感染中，抗体在B细胞上产生，一旦寄生虫得到控制，抗体在临床缓解后显著减少。这强调了细胞免疫在控制寄生虫继发感染中发挥了关键作用，如在病变的积极和临床后缓解中DTH的高阳性证明。在活动性病变中，pre-SR和pre-VT在原发感染中相似，这表明B细胞克隆被激活并对所有单价无鞭毛体反应。sr、VT和glu治疗后，抗体显著下降，因为VT主要刺激细胞免疫。有趣的是，在一组无临床缓解的glu治疗后，抗体没有减少。与有临床缓解的患者相比，本组患者的OD值显著()，非常好的内部控制。这些患者不能启动细胞免疫和降低体液免疫的原因正在调查中。

微生物在巨噬细胞中复制，表面IgG抗体通过Fc增加细胞内感染γ通过吞噬作用受体。单核细胞或巨噬细胞的连接γ受体的IgG免疫复合物，抑制先天性免疫，增加生产的IL-10，和偏置T辅助1（Th1）时，以Th2反应的反应，导致受感染的细胞中增加感染性输出[35，36］.正常的IgG抗体可以识别许多寄生虫抗原，将它们从免疫系统中分离出来，引导原鞭毛体进入细胞内。慢性感染的细胞免疫可能是由CD8+ T细胞和Th1反应介导的，一旦细胞内无鞭毛被控制和病变消失。寄生虫永远停留在宿主体内，在细胞内保持增殖平衡，不发生细胞裂解，由永久性的细胞免疫反应控制，一旦停止，寄生虫可以像艾滋病一样重新激活和传播[9，10］.

条带频率分析显示，在SR、Glu和VT处理后，血清识别的抗原中有56%的条带数量减少，分别为41%和37%，解释了ELISA、SR和Glu或VT处理后OD的减少。glu和vt治疗后，低分子量抗原的下降幅度最大。谱带频率和血清抗体的减少可能是由于抑制I类和II类MHC对受感染的宿主细胞的抗原呈递而造成的[5，6]，通过干扰抗原在MHC II类分子上的负载[37或将MHC II分子和抗原隔离在吞噬酶体内[38］.

继发感染时，SR组和glu治疗后无鞭体抗原的IOD区明显减少，仅1个抗原70 kDa增加。在病变临床缓解后，血清中低MW抗原的IOD面积增加了78、65、57、50、40和29 kDa(26%)。这可能是由于寄生虫的死亡和低分子量抗原向宿主释放，诱导B细胞致敏，产生抗体和免疫保护，类似于免疫和感染BALB/c小鼠的发现[39］.在IDR -患者接种VT疫苗后，大部分蛋白的IOD面积降低，而在IDR+亚临床感染中低、高MW抗原增加，在IDR+CL+接种VT疫苗的志愿者中，有以前愈合的CL，表明VT疫苗也杀死了诱导NK细胞释放亚临床和临床感染抗原的寄生虫。类似于Glu治疗。

4.5。细胞内寄生在利什曼原虫

要识别无鞭毛体抗原，不需要先前的淋巴细胞增敏。诱发原鞭毛利什曼原虫体外核扩散和干扰素γ从未接触过利什曼原虫的人外周血单个核细胞(PBMC)的产生。增殖的T细胞群是CD2+，频率<1:10000，这一反应可在PBMC CD45RO+记忆细胞耗竭后消除[40］.因此，在正常CD2 + T细胞和来自健康志愿者的正常免疫球蛋白从未有经验的利什曼原虫属感染与免疫印迹测定利什曼原虫属抗原反应。有趣的是银屑病患者，DTH底片无鞭毛体抗原也承认在母细胞测定利什曼原虫抗原和治疗前分别分布在两组，低和高应答者无鞭毛体抗原[16］.此外，LB和蛋白质的Lch层析级分高的DTH反应在活的有机体内在人类志愿者中发现了VT多价疫苗，证实了免疫抑制的缺失。蛋白组分获得的淋巴细胞刺激指标比完整的活体无鞭毛利什曼原虫诱导的指标低50-70% [16］.这表明体外刺激似乎选择性地集中在淋巴细胞的特定子集，其可以是调节性CD8 + T细胞17- - - - - -20.，41］.

4.6.利什曼原虫无鞭毛体TLCK治疗诱导其他疾病的临床缓解

令人惊讶的是，VT无鞭毛体抗原诱导各种形式银屑病的临床缓解[16]、银屑病关节炎(PsA) [17]，以及类风湿性关节炎[20.]，以及胶原蛋白引起的小鼠关节炎[19意外的发现[20.]分析治疗后PsA患者VT的效果，发现C反应蛋白（CRP）、补体5a、TNFα，和1L-1β在人类志愿者中减少[20.］.有趣的是，皮肤T细胞淋巴瘤的增殖体外也被VT单价Lch无鞭毛体抗原以剂量/反应关系抑制[20.]，这为将这种VT疗法应用于广泛疾病开辟了新的道路。

4.7。生产成本VT疫苗

由于目标人群(包括狗和人)的遗传多样性，多抗原疫苗可能是必不可少的。然而，必须考虑发展中国家使用的疫苗的成本。多聚蛋白(KSAC)被发现具有免疫原性，并能诱导免疫抑制婴儿期，负责人类和犬类的VL，并对抗L (L)专业，负责CL。这是一种具有成本效益的疫苗，能够保护人类和狗对多重免疫利什曼虫物种(42］.该多价疫苗生产成本极低，可在全球发展中国家推广应用。

4.8.热休克蛋白和TLCK处理无鞭毛体的作用机制

HSP与宿主和入侵微生物相似的免疫系统的长期对抗可转换针对这些宿主抗原的免疫反应，促进和/或减少自身免疫性疾病，包括牛皮癣[43- - - - - -45］.有证据表明，自我hsp60的识别在关节炎中可能有有益的作用，并可能提供新的策略，通过对自我决定因素的多肽的交叉反应来改善炎症过程的控制措施[14］.HSP60、HSP70和Gp96作为宿主衍生的toll样受体(TLR2)配体，在RA和银屑病发病机制中发挥作用[44，45］.利什曼原虫属抗原的热冲击后产生前鞭毛体在其成为液体培养基中无鞭毛体[21］.诱导银屑病缓解的Lb色谱组分的分子量与大多数HSP宿主配体的范围相似(50-70 kDa)，可抑制银屑病症状[15]，PsA[17，以及中央情报局[19，20.通过与各自受体中的肽竞争。类似的机制可能在免疫预防和免疫治疗中发挥作用，如本文所示。

5.结论

来自四种利什曼原虫的无鞭毛体，在没有经TLCK（VT）处理的细胞的自由细胞培养基中培养，在六个月后诱导CL的临床缓解 μg/剂量，每周，7周内在三角肌区肌肉内注射12次，并在6年的随访中保护志愿者免受CL的影响。通过ELISA中的抗体、抗原带频率和免疫印迹中的密度-面积密度测定测定，病变临床缓解后体液免疫降低。细胞内寄生是由于o通过载体感染后识别寄生虫抗原的正常抗体。VT疫苗主要诱导细胞免疫，通过DTH皮内反应测定，与活动性感染相比，病变缓解后。在原发性感染的VT治疗后，没有患者复发或继发感染。VT疫苗诱导患者的临床病情缓解所有形式的银屑病、PsA和类风湿性关节炎在人类志愿者和胶原诱导的关节炎在小鼠中的偶然发现，并抑制皮肤T细胞淋巴瘤的增殖体外这为将这种疫苗应用于广泛的疾病开辟了新的道路。

伦理批准

临床研究是按照赫尔辛基宣言进行。委内瑞拉医学研究院的国家伦理委员会，也是“科学调查研究所（IVIC）”的伦理委员会批准了现场试验的协议利什曼病，以及，对牛皮癣的临床试验。布拉斯布鲁尼切利博士委内瑞拉医学国家科学院任命的审判监督和监督的临床试验的所有后续跟进工作。所有志愿者都签署了知情同意授权处理。

利益冲突

José a . O’daly博士，Astralis Ltd.首席研究员和作者，首席执行官和主席，首席研究员和论文作者，确认论文中提到的商业身份没有直接的经济关系，可能导致任何作者的利益冲突。

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