的发展艾美球虫属nieschulzi(球虫，尖复合体)初生胎鼠细胞的壳和卵囊

摘要

的在体外顶端复合寄生属的配子细胞和卵囊的产生艾美球虫属球虫病仍然是球虫病研究的一个挑战。直到今天,在体外配子体或卵囊的发育仅在一些研究中显示艾美球虫属物种。几个哺乳动物艾美球虫属物种，部分发展可以以不同的细胞类型实现，但仍然缺乏对配子细胞或卵囊的发展。该研究将若干永久性细胞系与黑鼠的主要胎儿细胞进行比较（鼠形)关于定性的在体外鼠寄生虫的发展艾美球虫属nieschulzi．在转基因寄生虫的帮助下，发育的进展被记录下来。所选的艾美球虫属nieschulzi该菌株组成表达黄色荧光蛋白和一个macrogamont特异性上调的红色串联二聚体番茄。在所有被调查的寄主细胞中，大多数细胞的发育停止在第二个裂殖子阶段。在来自胎儿内部器官的细胞的混合培养中，在隐窝样器官结构中观察到裂殖体I-IV代、巨壳体和卵囊的发育。在供气条件下，观察不到小单核和小配子，卵囊无孢子形成。通过免疫组织学检查，我们可以确认为野生型大肠nieschulzi在小肠隐窝中可见分期。本研究的结果可能有助于自然宿主细胞的特性和发育在体外培养系统艾美球虫属物种。

1.导言

寄生虫属的寄生虫艾美球虫属在几乎所有的脊椎动物中都能发现，一些物种具有高度的经济相关性，因为它们可以在家畜中引起球虫病。

艾美球虫属已知寄生虫在宿主动物的生命周期中有严格的阶段进展。它们主要在肠道中发育，但也有一些种类在肝脏（兔子）或肾脏（鹅）中发现。研究寄生虫的各个阶段，有助于全面发育体外培养。在原代细胞中，只有少数艾美球虫属物种能够形成配子细胞或完成它们的生命周期在体外［1］.通常，这只有在分裂子用于感染时才有可能[2- - - - - -4］.

对啮齿动物艾美球虫属作为模式生物常用的物种，配子细胞或卵囊发育尚未实现。在之前对老鼠寄生虫的研究中艾美球虫属nieschulzi,阶段发展在体外没有超过第二个merozoite阶段[5- - - - - -7］.然而，在一个在活的有机体内Gamont发展发生[8，9］.在Tilley和Upton的研究中[10]，开发四个Schizont代艾美球虫属nieschulzi在还原条件下的永久细胞系中进行了描述。本文对他们的研究成果进行了讨论。

本研究的进展在体外的发展艾美球虫属nieschulzi用胎鼠的原代组织细胞进行研究，并与永久细胞系进行比较．对于更好的文档，转基因（黄色荧光蛋白; YFP表达）艾美球虫属nieschulzi具有附加雌雄同体特异性报告基因(串联二聚体番茄(TDT))表达的菌株[11使用了。TDT表达用作成功开发的指标，直到配子细胞阶段和超越。此外，我们确认了野生型的本地化大肠nieschulzi小肠隐窝寄生虫的免疫组织学研究在体外数据详细与文献中的数据。

2.材料和方法

2．1．细胞培养

孕鼠(Crl: CD (SD))于妊娠第16-18天实施安乐死。在进一步使用之前，胎儿被取出并斩首。将断头的胎儿在4°C的Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM)中清洗以去除血液。将胎儿腹部剖开，取出内脏。分别收集肝、肾和肠，用所有内脏作为胎混合(FM)进行一项检测。所有外植组织用37℃预热的DMEM洗涤2次，剁成小块，用柱塞筛(目径0.5 mm)粉碎。细胞/细胞混合悬液转移到离心管中，用完成的DMEM(37°C)洗涤一次，然后转移到预热完成的DMEM(含10%胎牛血清、2% l -谷氨酰胺、2%青霉素/链霉素、1% HEPES和1%丙酮酸钠)。将fm -悬液播种于IBIDIμ-含纤维连接蛋白(IBIDI)、明胶的载玻片[12), Matrigel-coating (60μL/well根据制造商的建议)以及无涂层幻灯片。对于原发性肝和肾细胞，使用纤维连接蛋白包被IBIDIμ-将原代肠细胞接种到IBIDI中μ-载玻片，涂有纤维连接蛋白或明胶，以及未涂玻片。寄生虫发育的质量评价在体外通过比较以下永久性细胞系:IEC6(大鼠肠道)、VERO(绿猴肾)、ST(猪睾丸)和IPEC-J2(猪小肠上皮细胞)，这些细胞系在完全DMEM中常规培养。对于寄生虫感染，将这些细胞中的100.000 - 150000接种于IBIDI中μ每口井的幻灯片。在接种寄生虫之前，在37°C和5% CO条件下培养永久细胞约3-4小时，原代细胞约24小时₂的气氛。

2．2.寄生虫和细胞感染

先前描述的转基因的通道P2和P3的卵囊艾美球虫属nieschulzi［11在本研究中使用。孢子醇源于激活并如前所述纯化[13]，在细胞培养基中重悬(DMEM，完成)。为使细胞感染，将20.000 ~ 50.000个孢子与细胞一起孵育μ-滑动在37°C和5% CO₂的气氛。每天取部分(50%)细胞培养基(DMEM)，用新鲜培养基替换两次。

２．３．活体肠寄生虫分期的免疫组织学观察

大鼠（CD）口服通过饲料口服用500.000-1.000.000孢子卵囊感染大肠nieschulzi并在接种卵囊后的不同时间点实施安乐死。具体的时间点可以在图的描述中找到3.．在大肠组织涂片中观察到活寄生虫阶段μ幻灯片。

组织学检查，将小肠切成0.5毫米的碎片 cm长，固定在4%多聚甲醛/1xPBS（pH 7.4）中24小时 在4°C条件下，在1xPBS中洗涤并在分级系列乙醇中脱水后，将组织块包埋在石蜡中 μ用旋转的切片机（Leica RM2125RT）切割m。将该部分转移到载玻片中，通过Roti-Histol（Co. Roth）除去石蜡。在90℃下用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH6.0进行抗原检索30分钟。如果使用HRP连接的二抗，则通过与1％H孵育来阻止内源过氧化物酶₂O₂在1xPBS约15分钟。在室温下，用20%正常山羊血清(NGS)和0.05% Tween在1xPBS中阻断非特异性抗原约1小时后，将切片与B1C4克隆杂交瘤上清孵育[14在室温下(1:10稀释于20% NGS/0.05% Tween/1xPBS)约2h。去除一抗后，载玻片与二抗稀释在20% NGS/0.05% Tween/1xPBS (FITC偶联抗小鼠IgG, Co Sigma Aldrich F6257 1: 100，或HRP偶联抗小鼠IgG 1: 200, Co Sigma Aldrich A9044)中室温孵育1 h。荧光探针切片冲洗后，用DAPI (1μg/mL)约10分钟，并在安装前约10分钟清洗3次。用过氧化物酶(HRP)探针标记的切片在pH 7.6的0.05 M Tris缓冲液中平衡约5分钟，然后在DAB/H中进一步孵育₂O₂染色液（5 mg 3,3′-二氨基联苯胺和5 μL H.₂O₂在10毫升H中₂O)。染色约20分钟。在去除所有染色溶液后，根据制造商的说明将切片安装在Mowiol/DABCO中。用1xPBS代替B1C4抗体进行对照实验。

2.4。显微镜

采用Zeiss Axiovert 100显微镜、Olympus F- viewii单色ccd相机和图像处理软件Cell F (Olympus)，接种24h - 270h，拍摄图像。细胞内和细胞外寄生期的荧光直接观察μ-带有FITC滤片(例如D480/30)用于黄色荧光蛋白(YFP)，带有罗丹明滤片(例如560/40)用于串联二聚体番茄(TDT)。采用DAPI滤波器组(激发365 nm，发射长通420 nm)显示卵囊壁的自荧光。根据滤光片集依赖的发射波长，图像的再现可与显微视图相比较。使用奥林巴斯C7070相机结合奥林巴斯C5060-ADU目镜适配器或单色FviewII和CellF软件捕捉过氧化物酶探针切片。

3. 后果

在永久细胞系IEC6、VERO、IPEC-J2和ST以及原发性肝、肾和肠细胞中，分别在第二次裂殖子形成后停止发育，产生裂殖子(未显示)。直到268小时每小时我们才能观察到任何进一步的发展。在这些细胞中，我们证实了前人的研究结果。

在胎儿混合物（FM）中观察到超出第二代Merozoites之外的发育阶段（FM），衍生自涂覆的载玻片上的内器官，但不在未涂覆的对照载玻片中。这些结果通过两个实验者在单独的实验中确认。我们不得不备注，仅观察到涂层载玻片的表现实验中的一半，似乎是涂层的有机胶结构。宏观美体和卵囊的发展成功与这些隐窝结构的发生直接连接。表中列出了特定的实验和寄生虫发展的结果1．

在胎儿细胞混合中，我们可以识别第一个-(未显示)，第二个-(图1(一))，第四代(图1 (e)和1 (f)）以及第二个的免费Merozoites（图1 (d))和第四代(图1 (g))，以及配子细胞和未孢子的卵囊(图1 (h)- - - - - -1 (j),2)．

(a) 145小时。

(b) 122小时。

(c) 122小时。

(d) 216 h p.i.。

(e) 164 h p.i.。

(f) 180 h p.i.。

(g) 218 h p.i.。

(h) 245 h p.i.。

（i） 245 H p、 一,。

(j) 245 h p.i.。

(k) 245 h p.i.。

(a) 145小时。
(b) 122小时。
(c) 122小时。
(d) 216 h p.i.。
(e) 164 h p.i.。
(f) 180 h p.i.。
(g) 218 h p.i.。
(h) 245 h p.i.。
（i） 245 H p、 一,。
(j) 245 h p.i.。
(k) 245 h p.i.。

图1

μ μ 9 8 μ μ μ 胎儿混合细胞试验中分裂体II和IV以及大型配子细胞簇的发育。(a)第二代裂殖体群(YFP)，在68 h早期和145 h较晚出现;(b)和(c)可能是第二代大裂殖体;(d)可能是二代(YFP)的裂殖子，长度大于20m（22 m). Marquardt 1966 [和鲁达布什1937 [，表示最大长度为16m。(e)少量核分裂后的年轻第四代分裂体(YFP)。(f)细胞多次分裂后聚集的第四代分裂体(YFP)，以及年轻分裂体。(g)第四代裂殖子(YFP)。(h)大簇约100尾伽玛(透射光显微照片)。(i)对应于(h) macrogamont特异性表达TDT信号的gammon的荧光显微图，没有显示YFP。(j)隐窝状结构细胞内有脉管炎(箭头)的透射光显微照片。(k)未感染的隐窝状结构。(a) to (g) and (j) bars = 20m;(h)， (i)和(k)杠= 100m。

(a) 206 h p.i.。， bar 20 μm

（b） 206 H p、 一、第20栏 μm

（c）206小时P.I.，BAR20μm

(d) 206 h p。， bar 20 μm

(e) 206 h p.i.。， bar 20 μm

(f) 230 h p.i.。， bar 50 μm

(g) 230 h p.i.。， bar 50 μm

（h）230h p.i.，条50μm

(i) 230小时， bar 50 μm

（j） 245 H p、 一、第10栏 μm

(k) 245 h p.i.。， bar 10 μm

(l) 245小时， bar 10 μm

（m）245小时p.i.，条10μm

(n) 230 h p.i.。， bar 10 μm

(o) 230 h p.i.。， bar 10 μm

(p) 230 h p.i。， bar 10 μm

（q）230h p.i.，条10μm

（r） 230 H p、 一、第10栏 μm

(a) 206 h p.i.。， bar 20 μm
（b） 206 H p、 一、第20栏 μm
（c）206小时P.I.，BAR20μm
(d) 206 h p。， bar 20 μm
(e) 206 h p.i.。， bar 20 μm
(f) 230 h p.i.。， bar 50 μm
(g) 230 h p.i.。， bar 50 μm
（h）230h p.i.，条50μm
(i) 230小时， bar 50 μm
（j） 245 H p、 一、第10栏 μm
(k) 245 h p.i.。， bar 10 μm
(l) 245小时， bar 10 μm
（m）245小时p.i.，条10μm
(n) 230 h p.i.。， bar 10 μm
(o) 230 h p.i.。， bar 10 μm
(p) 230 h p.i。， bar 10 μm
（q）230h p.i.，条10μm
（r） 230 H p、 一、第10栏 μm

图2

在体外 在体外 大鼠初生胎鼠细胞中巨单核细胞和卵囊的发育．(a) - (e)转基因裂殖子IV、裂殖子IV和巨壳子。(a) YFP在寄生虫各阶段均有表达。(b) TDT仅在巨gammon中表达。(c) (a)和(b)的叠加图。(d)对应的低对比度寄生虫阶段透射光显微图。(e) (a)、(b)和(d)的叠加有助于在透射光镜下识别低对比度的配子细胞，并区分无性生殖阶段和大型生殖阶段。(f) - (i)一组野猫。(f) YFP信号(g) TDT信号。(h)透射光镜显示发育的脉管炎主要分布在隐窝状结构的外围。(j) - (m) Macrogamont阶段毗邻成熟裂殖体IV, YFP (j)在所有寄生阶段表达，TDT (k)在Macrogamont中表达。 The colocalization with the corresponding transmitted light micrograph (l) is shown in (m). (n)–(r) Formation of oocysts．(n)未孢子的卵囊和配子细胞中的YFP信号。(o)相应的TDT信号。(p)在紫外线照射下发育的卵囊显示出典型的自荧光卵囊壁。(q)相应透射光显微照片。(r) (n) - (q)的叠加。

图3.

原位 μ μ μ μ μ μ 在体外 μ μ 在体外 http://dx.doi.org/10.1155/2013/591520 μ 肠道发育阶段和第三代裂殖子的定位。(a) 72小时内B1C4抗体探针切片的FITC/DAPI覆盖层。荧光信号局限于隐窝中部和上部，绒毛内无荧光信号。200酒吧m、 （b）72处B1C4抗体探测段的FITC/DAPI覆盖层 H p、 高倍镜下显示多核裂殖体。条25 m。（c）第三代MeRozoites的透射光（TL）显微照片。在这种感染时，它们的特征在于长度超过25个 m和直细胞形状，并在117 h p.i的肠道中发现。酒吧25m。(d) B1C4探针切片在120 h p.i.下的TL显微图。，the enzymatic reaction of the secondary antibody linked peroxidase can be found in the lower and middle parts of the crypts (c). Signals are absent in the villi (v). musc: muscularis; submuc: submucosa; muc: mucosa. Bar 200 m (e) TL显微照片显示第三代裂殖子在隐窝中部的抗体衍生过氧化物酶反应在120 h p.i。裂殖子含有大约12个裂殖子。50条m、 （f）TL显微照片显示120℃下不同形状和大小的裂殖体 H p、 i.星号表示包含12个以上裂殖子的裂殖体，考虑到发生的阶段，可能属于第二代裂殖体．酒吧25m。(g) FITC标记的寄生虫阶段在每小时144小时。可见于隐窝中部和上部的大簇，以及萎缩绒毛的基部。200酒吧m。（h）更高的放大倍数显示单核阶段（FITC / DAPI覆盖）。单核阶段（哈希键）可能是早期的宏观团，并且与他们相似．多核期(星号)可能是第四代分裂体，因为细胞核的定位不限于外围。相应的DAPI图像可以在补充图2中找到(参见在线补充材料))．50条m。

第三代Schizonts和Merozoites很难与第二代。考虑到文学，图中的大型Schizont1 (b)和1 (c)可能属于第二代或第三代。尽管大小，22μm长裂殖子1 (d)将属于第二代。这个问题在下面的讨论段中解释。

发现第四代裂殖体与多达15个裂殖体聚集在一起（图片细节图）1 (e)和1 (f))从164 H p、 i.观察到游离裂殖子IV（图1 (g))分开或靠近配子细胞(图2(一个)- - - - - -2 (e)，2 (j)- - - - - -2(米))．配子细胞显示额外的红色荧光串联二聚体番茄信号。tdt蛋白在小配子细胞特异性启动子下表达gam56基因中发现艾美球虫属tenella［11，15］.在206小时P.I中最早发现红色荧光信号。配子纤维通常发生在具有多达100个细胞的簇中，并且在位于皮卡氏植物的细胞中增长（图1 (h)，1(我),1 (j))．然而，在所有隐窝样结构中均未发现配子细胞(图1 (k))．

如果在25-50%的植物中发育了4个大gamonts簇μ-幻灯片，可以识别水井。在纤维连接蛋白涂层上的fm细胞的一次实验中获得了最好的结果μ幻灯片。

在细胞培养过程中，小单核或游离小配子未被确定。然而，在细胞培养片上或在空气供应下，这些卵囊不生孢子(图)2 (n)- - - - - -2（r）)．总之，fm细胞提供了发育的质量潜力艾美球虫属nieschulzi孢子体经过4代无性繁殖和配子细胞阶段达到卵囊发育的点体外培养。大配子细胞存在于类器官隐窝状结构中，表明这些细胞具有与大鼠原生宿主细胞相似的特征。

在选定的若干执行的实验中，我们本地化了野生型E. nieschulzi原位在72、120和144 h的免疫组织学检查下，小肠隐窝中有明显的免疫缺陷。(图3.).最初产生的抗体B1C4针对大肠tenella由Greif和Entzeroth于1995年描述的孢子子[14]用于免疫组织学。该抗体对大肠nieschulzi裂殖体和配子母细胞。

每小时72小时。，schizonts were detected in the middle parts of the crypts (Figures3.(一)和3.(b))。在更高的放大率下，不可能区分哪一代分裂体被标记;只有可见的多核表明裂殖。每小时117小时。，long merozoites with a length of more than 25 μm和肠中的直细胞形状（图3.(c))被确定。这些裂殖子属于第三代。每小时120小时。，parasite stages were labelled in the middle and lower part of the crypts (Figure3.(d))。绒毛中未检出寄生虫。裂缝如图所示3.(e)隐窝中部有长裂殖子，属第三代。数字3.（f）显示隐窝下部不同尺寸的Schizonts。马夸特测定法(9]描述了第二代或第三代最大有12个裂殖子的大型裂殖子。然而，对应的是观察到的在体外阶段，我们会把它们分配给第二代分裂体。

每小时144小时。，the parasite stages were found predominantly in the middle and upper part of the crypts, as well as at the base of the villi (Figure3.(g))。在较高的放大率下，可以识别单核和多核期。单核阶段可能是年轻的巨巨体，多核阶段可能是第四代裂殖体(图)3.(h))。没有一抗的对照实验没有显示二抗产生的任何特定信号(未显示)。

4.讨论

在初生胎儿细胞中在体外啮齿动物的发育艾美球虫属可以显示到卵囊期的物种。本研究及既往研究中各种细胞系均证实在体外的发展艾美球虫属nieschulzi局限于第二代裂殖子[5- - - - - -7］.蒂利和厄普顿[10直到第四代才报道了事态的发展在体外在减少的条件下。然而,艾美球虫属nieschulzi可以有在体外裂殖阶段的形态学变异。大裂殖子有20多个[11]，但也有小于10个裂殖子的小型裂殖子(图1(一))．因此，很难确定地区分第2裂体期和第3裂体期。因为在活的有机体内在美国，第一代和第二代裂殖子的发育延迟可达96小时每小时。［8，9]，发展的持续时间不能导致具体的结论。或缩小裂殖体明确可见裂殖子只有大小应征询第二（MzII）和第三代裂殖子（MzIII）之间的决心，但也有关于文献资料的解释进一步的挑战。马夸特测定法(9]描述MzIII的发生时间为48小时，平均长度为20.8小时μ25.5米,μM为每小时72小时，26.9小时μ每小时120小时。在120 h / i时，裂殖子表现出较高的运动性，而之前较小的裂殖子几乎不活动。分裂体II，由Marquardt 1966显示(比较图8在Marquardt 1966 [9)，类似于在体外每小时48小时的阶段[6，11我们把它们归入第一代分裂体阶段。图11中的分裂体III在Marquardt 1966的出版物中显示[9]与我们分配给分裂体II阶段(图1(一))，从每小时68小时开始，在永久细胞系中可见1(一))．Tilley和Upton展示的大型裂殖子II(对比Tilley和Upton 1988年的图7 [10)，我们将分配给分裂体I阶段。Tilley and Upton 1988所示的裂殖体III(与Tilley and Upton的图8相比[10)，我们称之为分裂体II阶段。Rick等人[6也描述了大型裂殖子和长裂殖子(21μm） 73岁 h p.i.，并将其分配给第二个裂殖体世代。Hanig等人描述的残余串联二聚体番茄信号[11，另外支持了我们对发生在永久细胞培养中的第一代和第二代阶段的解释。

我们的观察结果大约是每小时117小时。120小时pi。(图3.)对马夸特马夸特[9］.我们还可以鉴定出25个左右的大裂殖子μm和更长，具有高的运动性(图3.(c)，补充图3).裂殖子向前和向后移动，如Marquardt所描述[9］.此外，我们观察到裂殖子III的运动距离超过其自身细胞的长度(Supplementary Figure 3)。滑动运动的模型更倾向于向前滑动[16]，在大多数的顶复合体寄生虫中，这可以观察到与香蕉或拱形寄生虫细胞有关。反向移动也在疟原虫在类似的范围内[17］.我们认为大肠nieschulzi裂殖子通过在滑翔过程中沿着长度轴旋转来实现这一功能。否则，将与现有的滑动运动模型相矛盾。直的细胞形状支持旋转假说，我们观察到裂殖子在它们的脱位过程中几乎使用相同的路径。可以想象，通过这一阶段的高运动性，寄生虫可以实现进一步的扩张。在体外，我们无法观察到这么高的动机阶段超过25级 μ米长度体外，我们不确定是否有很大的分裂1 (b)和1 (c)属于第三代。在我们的细胞培养中，第三代分裂体的数量可能非常少，下文将对此进行讨论。马夸特测定法(9]仅在第6天观察到第4代，并描述了从裂殖子III到裂殖子IV的快速转变。预计第四代裂殖子会更早出现。因此，我们对早期裂殖子III有额外的怀疑，可能是裂殖子II。为了阐明这一问题，应该用现代分子方法进行进一步的研究。

在大小和形状上，第四代分裂体与由单个孢子产生的第一代分裂体相当。分裂子IV比分裂子I小[8，9］.与第一个Schizont阶段的孤立外观相比，第四代Schizonts在164小时P.I观察到的集群中发生。这是由靠近原始宿主细胞的Merozoites III感染引起的。Tilley和Upton所示假定的第四代Schizont [10]可能是脱层宿主细胞中的第一代或第二代分裂体。我们的实验表明，退化的环境对生物的发展不是必需的nieschulzi的体外培养。推测第三代裂殖子的发育和第二代裂殖子的入侵是裂殖子发育的关键时期在体外发展。为了入侵并进一步发育为第三代裂殖子，至少裂殖子II显然需要特殊的宿主细胞要求。在永久细胞系和原代肝、肾细胞中，未观察到第二代裂殖子的进一步发育。第二代分裂体也形成集群(图1(一))，第三代也将如此。在本研究中使用的非同质胎儿细胞混合中，只有少数裂殖子II似乎能找到合适的宿主细胞来入侵。

这将解释第三代Schizonts中的集群的非群。因此，将压抑在细胞培养中的第三代Schizont内的寄生虫膨胀。这种解释是通过仅在细胞培养窗口的一部分中发生的宏观峰的出现来支持。

然而，一旦在适当的细胞环境中(隐窝样器官)，大多数发育的裂殖子III(来自单个裂殖子III)可以感染新的宿主细胞。寄生期再次扩大，裂殖子III发育成大簇裂殖子IV(图)1 (e)和1 (f))．如果裂殖子IV感染新的合适的宿主细胞，它们会形成更大的大型单核细胞群，这在本研究中显示。

在自然宿主中艾美球虫属nieschulzi直接感染小肠隐窝细胞，也可在绒毛基底细胞中发现[8］.在上皮的其他部分则没有。我们可以证实这些原始发现(图3.)。已知大多数隐窝细胞未分化或部分分化。它们是所谓的转运扩增细胞（TA细胞），是从隐窝底部的干细胞衍生的增殖祖细胞。在绒毛内，这些以前的TA细胞完全分化为吸收细胞和杯状细胞[18］.这些细胞没有被感染艾美球虫属nieschulzi但是，ta细胞显然为这种寄生虫提供了一个吸引器。在在体外实验表明，大部分发育的巨gamons都可以在隐窝状结构中观察到。这表明这些细胞与宿主的肠隐窝细胞具有相似的特性。这些隐窝样结构仅在fm细胞实验中观察到，可能是基于上皮-间充质相互作用对隐窝细胞发育和增殖的必要性[19］.这些间充质细胞在fm细胞实验中被发现，但在仅用原代肠细胞的实验中没有发现。这可能是肠细胞单独不形成隐窝样器官的原因。涂有基质胶、纤维连接蛋白或明胶的细胞培养片可能是细胞生长和隐窝样结构形成所必需的，而细胞培养基似乎不那么重要。然而，隐窝样器官的形成并不绝对可靠1)。FM细胞是一种可变的未定义的细胞混合物，在每个制剂中具有不同的细胞含量，这可能会影响细胞生长。此外，高含量的红细胞似乎会对原代细胞的生长产生负面影响，并且这种含量在细胞制剂中也会发生变化。因此，在进一步的实验中隐窝样类器官应该以一种更明确的方式加以追求。

建立隐窝-绒毛结构的可能性在体外通过刺激外部因子的细胞增殖，通过苏托等，从单个Lgr5 +干细胞通过刺激外部因素而言，通过Sato等人显示。［20.]在小鼠模型中。他们的研究结果可以为未来的研究提供进一步的视角在体外潜在隐窝细胞仿射的培养艾美球虫属物种。

参与入侵的分子艾美球虫属寄生虫,更准确地说艾美球虫属tenella，是比较知名的[21，22]然而，对自然宿主细胞的表面分子和基因表达的描述却很少。艾美球虫属物种可以感染多个细胞系，但在一到两代分裂体后最终停止其发育。已建立的细胞系似乎只足够部分地探索宿主细胞感染所涉及的分子，因为它们仅为寄生虫的感染和发育提供了最低限度的质量。令人吃惊的是在e.n eeschulzi体内直接感染隐窝细胞并通过绒毛细胞，而在体外它们感染几种类型的上皮细胞。显然，绒毛细胞中有阻止感染的因子，隐窝细胞中有触发感染的因子在活的有机体内．寄主细胞表面的唾液酸聚糖与寄主侧的MIC3蛋白相互作用，可能在寄主细胞的趋向性中起重要作用艾美球虫属tenella［23］.然而，一种同域化大肠tenella和凝集素MAAII(一种凝集素结合α2-6或α2-3唾液酸连接聚糖)阳性细胞，以及这种唾液酸连接聚糖在原代鸡肾细胞中存在，在那里发育完全体外柔嫩肠杆菌是可能的，没有显示。因此，唾液酸化聚糖是否是宿主细胞识别最重要的介质仍不清楚。因此，必须改进自然宿主细胞的特性和分离，以指定感染和发育所需的宿主细胞配体。转基因艾美球虫属物种对这些研究很有帮助。

值得注意的是，在细胞培养中未观察到小单核细胞和小配子，而大配子细胞和卵囊发育明显。有几种可能的解释。首先，没有发育出小单核细胞，也没有进一步发育出小配子。二是小单核细胞发育，但小配子发生受到干扰，如血清干扰。也有可能通过隐窝样器官的三维特征，无法通过透射光学显微镜来检测微脉管。只有大型单核细胞有特定的标记物，而小型单核细胞只能表达yfp荧光色素。我们在小肠涂片上的观察显示小配子中只有微弱的荧光信号(未显示)，小配子的快速运动无法拍摄显微照片。Shi et al. [24报道了表达yfp的小配子的发育过程体外柔嫩艾美耳球虫，但没有透射光显微照片。他们提到，在未成熟的小单核细胞中，小配子的细胞核并不清楚。我们还可以看到表达tdt的大型单核细胞之间只有yfp的表达阶段，而没有明显的核信号(补充图1)，这在裂殖体阶段是常见的(图1)1 (e)和1 (f))．此外，巨gamont典型的中央核(图1 (f))信号缺失。问题仍然是这些阶段是否为微伽马体。

由于我们没有观察到游离的小配子和卵囊没有孢子，我们假设没有大配子受精。当卵囊壁形成时体外，壁的形成过程似乎独立于受精过程。弗格森(25假设即使受精也不是孢子形成的必要条件刚地弓形虫和其他Apicomplexa。我们的观察结果并不支持这种推测。还需要做更多的研究。用不同的转基因寄生虫进行杂交实验可以揭示这些过程。这样，属艾美球虫属甚至可以作为一个模型刚地弓形虫因为这样的实验在猫身上比在老鼠或鸡身上更难完成。转染技术已经建立艾美球虫属感染这些宿主动物的物种[7，11，26，27，并有机会加深对卵囊形成尖端复合体的性过程的认识。

信息披露

作者宣称，这些实验符合当时进行实验的德国现行法律。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

H. Chen和M. Kurth平分实验工作。

致谢

作者非常感谢Sächsische Aufbaubank通过欧洲社会基金为萨克森自由州的高等教育和研究提供的财政支持。他们还感谢Aaron Pegram和Annie Griffin(德国德累斯顿)的论文校对工作，以及Nicole Weidenbacher(德国德累斯顿理工大学)在免疫组织学实验中的帮助。

补充材料

工具书类

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