免疫反应的Bos indicus牛反对Anti-Tick抗原Bm91来自当地扇头蜱属microplus(牛蜱属)蜱虫在自然感染及其对蜱虫繁殖的影响

文摘

抗原anti-tick疫苗更有效的与当地蜱虫株同源的挑战。Bm91当地cDNA克隆编码扇头蜱属microplus(牛蜱属)接种菌株开发Bos indicus在现场条件下牛。三组六个动物每个注射抗原Bm91,盐水,分别和辅助。动物免疫三次三星期的间隔六个月后,第四次。anti-Bm91抗体水平,以ELISA,监控7个月,自然出没的繁殖性能r . microplus (b)是确定。Bm91-immunized动物发明了一种表达了强烈的免疫反应高anti-Bm91水平保持在高水平,直到研究结束。免疫印迹分析证实Bm91免疫原性。与对照组相比,生殖效率指数和蛋生存能力分别为6%和8%,分别降低Bm91组()。总之,这是证明Bm91诱导一个持久的免疫反应。然而,对蜱虫繁殖的影响是不够的一个高效的蜱虫控制。场条件下进一步的研究是必要的,加强对蜱虫繁殖的影响通过优化免疫疗法,单独或与其他候选疫苗抗原相结合。

1。介绍

扇头蜱属microplus(牛蜱属)是世界上最普遍的蜱虫物种,为畜牧业造成巨大的经济损失在热带和亚热带地区。蜱虫感染对宿主有不良的生理影响和导致减少活体重增加(1]。除了这些直接影响,蜱虫危害宿主间接传输蜱传播的病原体,如巴贝西虫宝,巴贝西虫bigemina、焦annulata和红孢子虫属边际(2]。全球蜱及蜱传播的疾病的侵扰,损失估计超过180亿美元(3]。通过影响牛生产这样一个程度上,蜱虫控制是一个持续的全球优先级。它在很大程度上依赖化学杀螨剂的应用。根据位置和耕作制度,蜱虫的化学控制的成本估计2.50美元至25美元每动物每年(4]。然而,这些药物疗效有限在减少蜱虫感染并伴有严重的缺点包括acaricide-resistant蜱虫的选择,环境污染,污染的动物产品药物残留,对农民的高成本(5]。特别是acaricide-resistant蜱虫的选择强化需要控制蜱虫更可持续的替代方法。来自世界不同地区的r . microplus (b)人口对最常用的杀螨剂,即大环内酯伊维菌素(6- - - - - -8),有机磷二嗪农(9双甲脒[],脒10),和其他有机磷合成拟除虫菊酯(10,11已报告。

替代蜱虫控制方法包括牧场拼写,食肉动物和寄生虫,人工选择tick-resistant牛可以减少蜱虫负担(12),但通过免疫增强宿主抵抗将构成一个重大进步,以减少依赖杀螨剂。基于中肠抗原Bm86两个商业疫苗r . microplus (b)是在澳大利亚注册(TickGARD)和古巴(Gavac)在1990年代初13,14]。其他几个tick-protective抗原被孤立。其中之一是唾液和中肠糖蛋白Bm91 [15),有许多生化和酶学性质与哺乳动物的血管紧张素转换酶(16]。Anti-tick疫苗是基于“隐藏”抗原的概念。在蜱虫喂养抗原不暴露于宿主的免疫系统,因此不适合逃避宿主的免疫反应。因此他们可以调用一个保护性的免疫应答的蜱虫诱导特异性免疫球蛋白的生产(17]。这些疫苗的主要作用是通过连续减少蜱虫数量减少蜱虫生育能力。与人工免疫试验蜱虫感染数量的大幅减少充血蜱虫,蜱虫体重,发现蜱虫生育,导致整体疫苗45 - 90%的效率18- - - - - -21]。然而,strain-to-strain序列之间的抗原位点的变化r . microplus (b)隔离不同地理区域已被证明影响疫苗效果。Bm86散度在3.4%的序列氨基酸水平报道Garcia-Garcia et al。22]。作者认为,氨基酸序列的变化超过2.8%就足以导致疫苗效率低下。在南美菌株差异的6.1%和4.6%的序列Bm86 Bm95蛋白质,分别发现了Sossai et al。23]。

本研究的具体目标是(1)测量Bm91诱导的体液免疫反应Bos indicus牛在野外条件下,(2)确认抗体由Bm91绑定到调用r . microplus (b)蛋白质,和(3)来评估的有效性Bm91自然繁殖性能的出没r . microplus (b)蜱虫。

2。材料和方法

2.1。动物和农业系统

这项研究是由动物和水生科学清迈大学,泰国(18°47′N, 98°59′E;海拔312米)。气候是热带雨(6月至10月),冬季(11月至2月),夏季(3月至5月)。日平均温度和降雨量25.9°C和1197毫米。实验持续了从2009年4月到2009年10月。十八个纯种雌性的土著Bos indicus牛品种(白色Lamphun)平均年龄为3年和103±17公斤体重。动物被随机分配到三组Bm91,控制和辅助与6个动物。只有产仔的小母牛被用来减少错误,这可能是由于引入怀孕状态。动物生长在一个广泛的free-grazing系统和放牧被允许,没有补充,集中和水是可以随意。在前六个月的动物并没有杀螨剂处理。直肠温度测量每周和体重隔周去一次。

2.2。免疫接种

动物Bm91-immunized组注射疫苗配方的基础上重组Bm91抗原,这是来自一个r . microplus (b)泰国本土。抗原是由DNA重组技术如前所述,Kaewhom et al。24]。简单地说,信使rna从蜱唾液腺和孤立的cDNA Bm91序列合成的编码逆转录酶聚合酶链反应(rt - PCR)。泰国的互补脱氧核糖核酸编码Bm91蛋白质转移到压力p . pastoris质粒载体pPICZ(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。Bm91重组质粒克隆到大肠杆菌DH5 -主管细胞。抗原是adjuvated Montanide ISA 50 V包含anhydromannitoletheroctodecenoate矿物油(Seppic、法国巴黎)。免疫接种,包含200剂量的2毫升μg重组蛋白的准备有一天之前使用一个Ultra-Turrax T8高速均质器(IKA Labortechnik, Staufen,德国)。控制和辅助组2毫升剂量的磷酸缓冲盐(PBS)和Montanide ISA 50 V,分别。这些动物肌内接种剂量主要(周0)后跟两个剂量每隔三周(周3和6)和第四次免疫后6个月(26周)主要免疫(ppi)。

2.3。血液采集

从颈静脉血液收集每周到两个无菌管一段三个月ppi和第四次免疫后一个月26 - 30日(周)。管血清收集包含凝活化剂和血清分离一天后收集和储存在−20°C到进一步分析。此外,动物的健康状况监测通过确定包装细胞体积(PCV, %)和血红蛋白含量(Hb, g / dL)用常规的实验室方法。因此,血液被收集到K₃edta管(除了星期11)。

2.4。Anti-Bm91抗体ELISA

anti-Bm91抗体水平由间接酶联免疫吸附试验(ELISA)根据Jittapalapong et al。25)使用泰国Bm91重组蛋白作为抗原。简单地说,一夜之间,微量滴定板被涂在4°C 3μ在0.1 g /抗原的稀释碳酸盐岩层缓冲(pH值9.6)。洗后五次PBST (0.05% (w / v) Tween-20 PBS),盘子上的免费绑定网站被封锁牛血清白蛋白在PBS(100年为0.1%μL /)在室温下2 h (RT)。一旦板块与PBST再次清洗,100μL(样品血清1:100稀释被添加到每个好,孵化为2 h rt,洗后如上所述,100年μL对牛peroxidase-conjugated山羊免疫球蛋白免疫球蛋白(ICN、极光、美国)稀释1:5000添加到每个。板块是另一个2 h RT孵化之前另一个清洗步骤。与100年antibody-antigen复合物是可视化μL每0.05%的2,2′-azino-di——(3-thylbenzthiazoline磺酸盐)(ICN、极光、有限公司、美国)和0.03%的过氧化氢。反应是通过添加盐酸7分钟后停止。光密度(OD)测量进行使用TECAN日出ELISA读者(TECAN交易AG)、Groding、瑞士)的波长450 nm。平均OD值计算每个样本的重复。积极的和消极的控制没有抗原,主要抗体,二级抗体和底物同时测量,确保比色反应是由于抗原抗体复合物的形成和非特异性反应。

2.5。免疫印迹分析

为了确认anti-Bm91抗体免疫绑定到调用的r . microplus (b)蛋白质、血清的多屏幕免疫印迹分析获得每周从一个免疫动物。Mini-PROTEAN II多屏幕装置(Bio-Rad、大力神、钙、美国)使用。为分析Bm91抗原制备、用于免疫接种,受到10%钠dodecylsulphate聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)。蛋白质变性4分钟在95°C在加载缓冲和解决减少条件下200 V 40分钟。之后,蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜和孵化每周血清样本稀释1:100在100 V 1.5 h。Tris-HCl阻塞后ttb(50毫米,150毫米氯化钠,0.05% (w / v) TWEEN-20, pH值8.0),污点是孵化一夜之间在RT,孵化前peroxidase-conjugated antibovine免疫球蛋白(美国新泽西州Amersham生物科学,皮斯卡塔韦)在RT, PBST污点被三次。最后,污点是孵化与antibovine共轭二次抗体稀释1:5000年在ttb 1 h RT洗后作为初步步骤的描述。与二级抗体孵化后,与PBST跟着三个清洗步骤。积极的信号被添加可视化轻拍(美国σdiaminobenzidine)衬底。蛋白质标准代表15 - 250 kDa (Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

2.6。蜱虫集合和生殖蜱虫性能

所有的牛都保持在同一tick-infested牧场和自然出没了r . microplus (b)幼虫,仙女和成年人。为了评估Bm91-immunization在繁殖性能的影响,标准的女性r . microplus (b)蜱虫(4.5 8毫米)收集每日第三和第四次免疫后10周的总时间。标准的女性r . microplus (b)蜱虫是那些注定要完成以下24小时内充血(26]。记录狼吞虎咽后重量,蜱虫都分别在蜱虫室光周期12 h(光30±5°C和相对湿度70 - 80%。大约三周后蜱虫收集、产卵完工时,卵子质量每个女性排卵的重量。鸡蛋可行性是视觉上六周后收集和检查如果不到50%的蜱虫幼虫孵出这一时期的批记录是不能存活的。繁殖效率指数(REI)是通过使用下列公式计算提出的班尼特(27]:丽=[蛋质量重量(mg) /蜱虫体重(毫克)]×100。

2.7。统计分析

数据统计分析软件SAS 9.3版(28随着时间的推移,重复测量方差分析(混合程序)使用。分析提供了值差异治疗,差异随着时间的推移,和治疗和之间的交互。Akaike信息选择的标准重复措施在给定的动物被假定拥有复合对称结构。这种结构与非结构化的协方差矩阵和一阶antedependence结构。近似为分母的自由度是Kenward之后,罗杰29日]。ELISA值调整到一个OD值0开始的研究结果提出了最小二乘方法(LSM)±标准错误(SE)。与杜凯氏考验进行多重比较。不同的被视为具有统计学意义。蜱虫数量,蜱虫体重比例的蜱虫排卵,丽,鸡蛋可行性与GENMOD过程进行了分析。泊松分布和对数函数被认为链接。周是包括重复效应和组比较以及()。平均每日获得使用注册过程是由回归分析计算。体温、PCV和Hb分析重复测量方差分析使用混合过程。集团,集团*交互作为固定效应和每周重复效应对于每一个动物。lsm(±池标准错误,PSE)比较杜凯氏考验()。如果团体之间的标准误差不同,PSE给出最高的标准误差。

3所示。结果

3.1。Anti-Bm91抗体水平

之前第一次免疫血清的牛被ELISA化验anti-Bm91抗体和血清反应阴性的发现(图1)。anti-Bm91抗体水平的控制和辅助组血清反应阴性的整个观察期。相比之下,免疫动物形成了一个强大的和特定的体液免疫反应的特点是高anti-Bm91免疫球蛋白的水平。观察水平的快速增长主要免疫后,第二个和第三个治疗导致进一步上升。后达到一个稳定水平免疫剂量和维持直到第三周12 ppi。这个水平高出约2 OD单位Bm91组控制和辅助组相比,分别。直到26周anti-Bm91 ELISA值略有下降。第四次免疫后,公认的适度增长。这个水平未到最后的审判在30周。

3.2。免疫印迹分析

免疫印迹分析,作为模范地做一个Bm91-immunized动物,证明这种动物的weekly-taken免疫血清蛋白质绑定到用于Bm91抗原配方。一个乐队在86 kDa的分子量,这是符合泰国Bm91重组蛋白r . microplus (b)应变,可见(图2)。这个乐队是公认的从第2周ppi,直到研究结束。在26周的时候反应的强度降低。此外,分析表明在preimmune同一免疫动物血清这个乐队在86 kDa不是礼物。

3.3。蜱虫参数

不同的参数记录从自然感染r . microplus (b)蜱虫在表1。蜱虫的数量收集Bm91之间没有显著差异,控制和辅助组。在三组动物传动物高变异被记录。没有明显的群体差异发现蜱虫体重。相比对照组排卵蜱虫的比例降低了5%的佐剂组()。产生影响的免疫接种记录丽和鸡蛋可行性。与对照组相比,减少了6%和8%,分别观察这两个参数的免疫组()。

3.4。体重增加、体温和血参数

牛的日平均体重是203,174,和175 g / d (PSE = 10.7)的控制,辅助,分别和Bm91集团。组织之间的差异都不显著()。之间的平均体温范围(图37.8°C和39.0°C3(一个))。治疗和治疗之间的交互和周显著影响被观察到的重复测量方差分析。PCV和Hb给出数据3 (b)和3 (c)。克莱默提出的两个参数不同的参考区间内(30.]。第四次治疗后(26周)周期间的观察值高于0到12 ppi。为两个参数组的效果以及组织之间的交互和周是重要的()。相比之下,周的重复效应是重要的所有参数指示值随着时间的改变。

4所示。讨论

鉴于重组蛋白疫苗的好处比传统化学蜱虫控制,重要的是要探索潜在的免疫抗原Bm91场条件下自然蜱虫感染。r . microplus (b)是一个最重要的节肢动物损害livestock-especially cattle-production在热带和亚热带国家。商业anti-tick疫苗,Gavac和TickGARD包含Bm86重组抗原,而每个来自不同的菌株r . microplus (b)(31日- - - - - -33]。研究调查Bm86受控条件下用人工r . microplus (b)蝗虫袭击表明,免疫的减少的数量和重量充血雌蜱虫,其产蛋能力,他们的繁殖能力13,14]。隔离后Bm86其他tick-protective抗原被孤立。Bm91就是其中之一tick-protective抗原,测试在一个免疫试验结合Bm86 [34]。尽管Bm91不包括商业anti-tick疫苗,这是一个有效控制候选人牛蜱虫。然而,每当tick-protective抗原评估序列的变化r . microplus (b)压力必须考虑。依赖的蜱虫株的抗原是派生的,明显对蜱虫繁殖的影响可能不同(22]。

因此,我们研究的总体目标是评估对Bm91抗原的体液免疫反应b . indicus牛和评估疗效的繁殖性能r . microplus (b)在野外条件下的自然感染。通过推导从本土的蜱虫抗原,重组蛋白疫苗之间的分歧和本地抗原的蜱虫可以在本研究被排除在外。

抗体效价被证明是anti-tick疫苗的功效的主要决定因素14]。广泛的效价之间的相关性被发现Bm86抗体和疫苗的功效35]。这正相关的抗体效价疫苗功效不仅可以证实Bm86 [20.,21),而且对Bm91 [34],Bm95 [36]。总之,它允许评价疫苗的有效性通过免疫动物的抗体滴度的测量37]。鉴于主要免疫后跟两个升压剂与三个星期中间,本试验的时间计划是一致的与其他疫苗接种试验。免疫动物开发一个强大和高表达的特异性体液免疫应答anti-Bm91抗体水平,这第一次免疫后立即增加。与本研究的结果相反,最明显anti-Bm86和anti-Bm95浓度不是记录在第一但在第二次免疫研究Garcia-Garcia et al。38]。Bm86稳步减少,Bm95滴定度峰值后第二次免疫后2周不同意Bm91在当下研究的进程。类似与峰值是紧随其后的是一个强大的减少所示Patarroyo等的研究。39使用合成肽来源于Bm86]。低反应主要与TickGARD免疫⁺和Gavac也是衡量Andreotti [20.]。在与上述协议的研究中,抗体水平见顶两周后第二次免疫。一个独特的峰值后降低。前两个免疫低反应(周0和4)的回顾性分析使用Gavac领域(40]。受控条件下观察到的罗德里格斯et al。13),一个强大的抗体水平明显增加第三治疗后(一周7)。一个强大的后两周后峰值下降这一剂量。Anti-Bm95显示类似的抗体水平与强劲增长之后,第三次免疫的研究Kumar et al。36]。在一些动物的短期保护浓度琼森的研究et al。18)不一致的结果在这里找到。相反,anti-Bm91抗体是在观察期间保持在一个较高的水平。尤其是高水平测量第四免疫前六个月ppi对比其他研究。在六个月内抗体水平下降到预先免疫水平的研究Garcia-Garcia et al。38]。一个类似的下降被罗德里格斯et al。13),山谷et al。40Andreotti], [20.]。比较三个与Gavac免疫计划⁺巴尔加斯et al。41)发现,接种疫苗和治疗之间的时间间隔的数量并不影响抗体水平。减少免疫的可能性,因此建议。一般来说,免疫组内变异高于在这里找到发表在文献[18,20.]。在广泛共识的anti-Bm91目前的研究水平的Bm86和Bm95通过Jittapalapong et al。42]。

ELISA结果可以证实了免疫印迹分析。这一分析表明Bm91免疫原性和诱导抗体结合r . microplus (b)中肠蛋白。86 kDa的乐队,这是符合重组Bm91来自泰国r . microplus (b)压力,是公认的从第三周ppi开始。因此,糖蛋白引起特定的抗体结合r . microplus (b)蛋白质。牛的血清,免疫与合成Bm86肽(39]或糖蛋白隔绝r . microplus (b)和Hyalomma anatolicum anatolicum(43比这里介绍]显示类似的免疫印迹结果。

ELISA和免疫印迹结果证实,蜱虫,附加到Bm91-immunized动物受到anti-Bm91抗体与血的摄入。摄入含有anti-tick抗体的血液使蜱虫消化细胞的溶解导致上述影响生殖蜱虫性能(44]。在人工感染Bm86减少蜱虫和繁殖性能的56%和72%,分别为(18]。Andreotti [20.)发现了一个保护功效Gavac和TickGARD 49%和46%⁺,分别。Garcia-Garcia et al。38]接种牛和Bm86 Bm95来自阿根廷的蜱虫株。此后,动物们的挑战r . microplus (b)一个阿根廷或者澳大利亚蜱虫的幼虫的压力。对阿根廷的84%和89%计算菌株保藏Bm86 Bm95,分别。相反,保护澳大利亚Bm86和Bm95蜱虫是0%和54%,分别。在最近的一项研究中,Almazan et al。21发现Bm86减少蜱虫的数量,鸡蛋重量,产卵,和蛋生育率为51%,5%,14%,和6%,分别。类似的疫苗的功效也报道Bm86同系物Ba86, Bd86, Haa86 [19,21,45- - - - - -47]。一般来说,anti-tick疫苗的效果最为明显,而在生殖蜱虫性能比充血蜱虫的直接还原。这强调了预防性使用疫苗的最大的影响在逐渐减少蜱虫。整合值Bm91不是在文献中发现的,因为这种抗原没有测试作为一个独立的抗原在免疫试验。相比其他免疫试验,在蜱虫Bm91参数的影响,特别是在丽和鸡蛋可行性,本研究中发现低。对于蜱虫的数量,必须考虑动物自然感染r . microplus (b)。蜱虫数量之间的高变异动物表示蜱虫的偏态分布在一群先前所示(18]。研究Jittapalapong et al。48)是在可比条件下进行的。然而,蜱虫感染是相当高的。至于蜱虫数量,影响Bm91的蜱虫体重和蜱虫排卵的比例没有记录。然而,减少6%和8%的丽和蛋生存能力,分别与对照组相比,表明Bm91蜱虫繁殖性能的影响。需要解决的另一个问题,在目前的研究中,是它是在野外条件下自然进行的r . microplus (b)侵扰。一般来说,自然蜱虫感染在现场实验中不同取决于多种因素,主要是气候,是很难预测的14,49]。主要免疫是立即开始之前的雨季;然而,蜱虫感染在接下来的雨季是低于其他研究与自然感染(48]。

这里的体重增加观察反映季节的影响。持续时间的研究中,提要数量和质量改进。由于低蜱虫感染,免疫接种对体重增加的影响无法预期。降低体温的研究揭示了动物的暴露环境条件。这也可以注意到PCV和Hb表明增加健康状况由于季节性条件。免疫不影响动物的健康状况。因此,它可以建议免疫可以独立的季节,尽管的高适应性b . indicus本研究中使用的动物向当地环境条件必须提到这里。为了获得最大的效果,建议免疫发病前的雨季,确保抗体水平已经达到一个稳定水平在雨季时最高的蜱虫感染通常是观察。

总之,一个强大和持久的免疫反应可以通过重组Bm91被调用,这是来自当地r . microplus (b)压力。所有免疫牛回应,与三个主要研究免疫计划免疫接种和助推器剂量六个月后可以推荐合适的为了维持足够的抗体水平。虽然对丽一个积极的影响和观察鸡蛋生存在野外条件下,疫苗功效观察到其他研究人工蜱虫感染后都没有达到。尽管Bm91在蜱虫繁殖的影响有限,现场条件下的高免疫原性抗原所示认股权证其进一步评估。虽然使用作为一个集成的一部分Bm91蜱虫控制策略需要更加明显对蜱虫繁殖的影响。因此,评估在现场条件下的自然r . microplus (b)建议与其他抗原结合侵扰。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者承认农业生物技术中心,出租车,Kasetsart大学、泰国、提供Bm91抗原和Mea头脑农业研究和培训中心,清迈大学,泰国,谁提供的这个实验动物设施。第一作者也承认先生的支持Changrung Chantaboon在书房。

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