文摘

衔接着重复鲁兹锥体十三区最蛋白质是一种immunodominant抗原在恰加斯病的病人。这种重复的领域可能像T-independent抗原。然而,T细胞可以识别十三区最在HLA抗原表位类II-restricted时尚和可能提供同源T细胞帮助和提高抗体滴度。我们评估是否存在HLA二类分子能够呈现十三区最T细胞抗原表位可能影响anti-B13免疫球蛋白水平同源的方式,在慢性恰加斯病的主要临床类型。我们没有发现区别anti-B13免疫球蛋白抗体水平患者携带HLA二类分子之间关联的T细胞反应或其他等位基因。主要anti-B13免疫球蛋白子类IgG1, IgG2可以忽略不计,暗示T-dependent,非同源帮助生产抗体。此外,增加的发现anti-B13 CCC患者血清免疫球蛋白水平表明,临床表现与增加anti-B13抗体水平。

1。介绍

病原原生动物等鲁兹锥体,恰加斯病的病原体的疾病,包含地区衔接着重复的氨基酸序列嵌入在几个immunodominant蛋白质抗原(1]。这种类型的蛋白质的功能领域了解甚少。重复元素不同的数量、大小和分布与几个像他们的immunodominance共同特征,偏差在组件氨基酸,和一个不寻常的进化历史2]。是知之甚少的分子机制,导致immunodominance重复序列,除了多价,可以让他们直接和行为激活B细胞,在某些情况下,由交联hapten-specific T-independent抗原表面免疫球蛋白(3]。众所周知,各种代理的重复导致MHC类II-independent,独立T细胞激活B细胞,它已经表明,衔接着重复的碳水化合物抗原抗体反应引起IgG2子类在人类4- - - - - -6]。十三区最蛋白质是一种immunodominant重组抗原编码衔接着重复的领域的一部分t . cruzi140/116 kDa蛋白质表面位于感染性trypomastigotes从几株。十三区最Y病毒的蛋白质t . cruzi是由19个衔接着重复退化的副本12-amino酸主题P (L) P (S) (L) FGQAAA (E) G (a) D (G) K,残留在括号替换前面的残留在不同的重复(7]。十三区最蛋白质被从97%的血清免疫球蛋白抗体t . cruzi感染者在拉丁美洲,轴承两种慢性恰加斯病的疾病:慢性恰加斯病心肌病(CCC)和无症状/不定式(容易)8,9]。事实上,有证据支持,对重复的原生动物抗原抗体反应T cell-independent [10,11]。

然而,它不能被排除在外,T细胞帮助可以提高抗体滴度,促进免疫球蛋白子类开关。同源T细胞提供帮助当T细胞和B细胞的抗原特异性密切接触,直接和其中抗原T细胞与B细胞表面HLA分子II级。同源T细胞帮助只会发生在那些携带HLA分子II级,允许表示和识别抗原的T细胞。非同源T细胞的帮助,另一方面,当T细胞激活一个抗原抗体的抗原呈递细胞提供帮助生产提出的B细胞与不同抗原特异性(12,13]。重复序列在原生动物寄生虫抗原T cell-dependent引起免疫反应。据报道,外周T细胞恶性疟原虫在EB200疟疾患者识别T细胞抗原表位,重复的区域恶性疟原虫抗原Pf332 Pf155重复域ring-infected红细胞表面抗原(RESA)和重复的环子孢子CS域蛋白(14,15]。我们曾表明PBMC增殖和细胞因子反应十三区最及其合成肽之间频繁t . cruzi来华的科目(8,16]。我们还发现,T细胞反应十三区最蛋白质限制患者携带某些HLA二类等位基因(HLA-DQA1 * 0501 (DQ7)、HLA-DR1 HLA-DR2),直接绑定和现在的十三区最肽(8]。因此可以想见,B13-specific T细胞可以为生产提供同源帮助anti-B13抗体之间t . cruzi -感染病人携带HLA分子II级。为了验证这个假设,我们将评估是否至少有一个这些HLA等位基因的存在增加了十三区最抗原免疫球蛋白g级反应恰加斯病病人分为容易或CCC形式的疾病。我们还将评估B13-presenting HLA等位基因的存在是否会影响免疫球蛋白子类,因为不同的免疫球蛋白g子类概要文件相关T-dependent或T-independent免疫球蛋白反应(17,18]。

2。方法

2.1。研究人群

血清样本取自共有112名患者感染了t . cruzi,分层两种形式的恰加斯氏疾病:慢性恰加斯心肌病(CCC; = 7 2 )和不确定的/无症状的形式(容易; = 4 0 )。的患者心脏研究所(InCor),圣保罗大学医学院。慢性恰加斯心肌病(CCC)受试者完成以下诊断标准:积极的t . cruzi血清学、典型的心电图异常(左前hemiblock和/或右束支hemiblock),有或没有不同程度的心室功能障碍,与所有其他病因的心室功能障碍/心力衰竭排除在外。不确定的/无症状的受试者(容易)显示阳性t . cruzi血清学但正常心电图和二维超声心动图。研究机构审查委员会批准的协议是圣保罗大学的医学院。所有患者知情同意使用他们的血液样本的研究。

2.2。HLA二类打字

DNA是由DTAB / CTAB提取或盐析的方法(19]。打字博士是由低分辨率PCR-SSP如前所述[20.- - - - - -22]。DQA1和DQB1打字是由PCR-SSO exon-2使用通用引物扩增(23]。

2.3。直接ELISA

96孔聚苯乙烯板(美国康宁公司)被涂上一层30 ng /十三区最重组蛋白在carbonate-bicarbonate缓冲区,pH值9.6,16 h在4°C。盘子洗了PBS和阻塞PBS - 2% BSA 30′在37°C。血清样本在1/50稀释孵化了1 h 37°C。与pbs十洗涤周期后20 - 0.1%渐变(PBS-T),井与HRP-conjugated孵化反人类免疫球蛋白30′在37°C。与PBS-T十额外的洗涤周期后,样本孵化与基质溶液(4毫克门诊部当在10毫升柠檬酸缓冲,pH值5.0)30′在37°C。在490纳米波长吸光度测量使用自动板分光光度计。

2.4。免疫球蛋白子类测量

Anti-B13抗体子类测量是由ELISA遵循上述基本相同的协议,除了浓度曲线是由孵化不同浓度的免疫球蛋白g子类(IgG1 2、3和4)标准。我们也使用合共轭鼠标反IgG1, 2, 3, 4 (Pharminrgen BD)在PBS稀释含1%小牛血清PBS-T被添加到每个(1:1000稀释)。1小时孵化后37°C,盘子是孵化基质溶液(4毫克门诊部当在10毫升柠檬酸缓冲,pH值5.0)30′在37°C。在490纳米波长吸光度测量使用自动板分光光度计。截止值确定光学密度的平均值控制血清+ 3个标准差。

3所示。统计分析

组相比,nonparametrical测试(Mann-Whitney排名和测试)GraphPad InStat软件(版本5.0;GraphPad)。结果表示为中位数和四分位范围。 如果< 0.05值被认为是重要的。

4所示。结果

4.1。Anti-B13免疫球蛋白抗体在航空公司和非B13-Binding HLA分子II级

我们把112t . cruzi来华的患者分为两组,76例轴承所需的HLA等位基因中的一个或多个演示十三区最的T细胞(HLA-DQ7,根据DR1、DR2),称为HLA +,和36个科目缺乏这些等位基因HLA−。图1表明,免疫球蛋白总量没有显著差异反应之间十三区最HLA +和HLA−病人。然后我们组的主题细分成恰加斯病的不同临床表现,CCC ( = 7 2 )和容易( = 4 0 )。CCC患者血清总免疫球蛋白g anti-B13反应显著高于容易显示患者,虽然有一些重叠样品在两组(图2)。当我们进一步分层临床群体HLA +和HLA−病人,我们观察到在总免疫球蛋白g anti-B13反应无显著差异的样本HLA从CCC + HLA−病人,容易组织(图3)。


图1
直接ELISA总十三区最重组蛋白的免疫球蛋白反应固相。76名被试轴承HLA等位基因能够给T细胞HLA-DQ7十三区最肽,根据DR1、和DR2 (HLA +),和其他36个学科轴承HLA等位基因(HLA−)。单杠表明每组平均吸光度。 = 1 。 0 0 ,Mann-Whitney秩和检验。

图2
直接ELISA总十三区最重组蛋白的免疫球蛋白反应固相。对比CCC(受试者患有慢性恰加斯心肌病)和容易(与不确定的主题/无症状的疾病)。容易和CCC科目(Abs。= 0.756和0.681,分别地)。盒子情节胡须显示中间值和25 - 75%百分位;10%和90%百分位;ou tlier点上方和下方所示图。


图3
直接ELISA总十三区最重组蛋白的免疫球蛋白反应固相。HLA +集团(科目轴承HLA等位基因能够给T细胞,十三区最肽HLA-DQ7,根据DR1、和DR2);和HLA−组(科目轴承其他HLA等位基因)。单杠表明每组平均吸光度。
4.2。Anti-B13决心在航空公司和非免疫球蛋白子类B13-Binding HLA分子II级

我们评估是否相关的HLA等位基因的存在与否与差异分析分布在四个免疫球蛋白子类87受试者(HLA +; = 5 3 和HLA−; = 3 4 )。图4显示没有免疫球蛋白子类的分布差异组,与免疫球蛋白水平子类排名IgG1 > IgG3 > IgG2 > IgG4 HLA +和HLA−科目。我们在研究中进一步分层对象分离成恰加斯病的两种临床形式,CCC ( = 3 2 )和容易( = 3 9 ),在两个HLA组(HLA +和HLA−),但无显著差异(图5)。



图4
直接ELISA水平的四个子类的活性免疫球蛋白十三区最重组蛋白质在固相HLA +主题( = 5 3 )和HLA−科目( = 3 4 )。每个免疫球蛋白的水平栏显示平均浓度在每一组子类:IgG1;IgG2;IgG3;IgG4。


图5
直接ELISA水平的四个子类的活性免疫球蛋白十三区最重组蛋白质在固相容易和CCC科目;HLA +:受试者轴承HLA等位基因能够给T细胞十三区最肽(HLA-DQ7,根据DR1、DR2);HLA−:受试者轴承其他HLA等位基因。单杠表明每个子类在每个组的浓度中位数:IgG1;2:IgG2;3:IgG3;4:IgG4。

5。讨论

在这项研究中,我们进一步分析了免疫球蛋白g级反应和免疫球蛋白的子类t . cruzi衔接着重复十三区最抗原在恰加斯病的病人。我们证明了没有区别anti-B13免疫球蛋白抗体水平之间患者携带十三区最呈现HLA二类分子,与T细胞反应(HLA +)和其他等位基因携带(HLA−)。然而,我们发现增加anti-B13 CCC的血清免疫球蛋白水平相比容易的病人,但是没有差异anti-B13免疫球蛋白水平观察HLA +和HLA−患者之间在CCC和容易组织。关于免疫球蛋白子类,优势IgG1反对十三区最蛋白质抗原,在病人组(HLA +和HLA−);我们也没有发现任何的不同水平的免疫球蛋白亚型CCC和容易组织,无论其HLA类型。

的发现anti-B13免疫球蛋白抗体水平的患者携带B13-presenting HLA二类分子,T细胞反应有关,类似于其他等位基因携带反对基因的作用限制(因此,同源)T细胞帮助anti-B13抗体生产。另一方面,免疫球蛋白子类分布anti-B13 antibodies-predominantly IgG1-argues对其做一个严格T-independent (T1-2)抗原,因为,即使它没有遗传限制,不能诱发IgG2作为衔接着重复的补充碳水化合物抗原的抗体(4- - - - - -6]。抗体nonrepetitive(大概T-dependent)重组蛋白(24]或t . cruziepimastigote匀浆(25)慢性Chagasic患者血清中基本上是IgG1和IgG3子类。这确立了IgG1 / IgG3形象对nonrepetitive标准回复t . cruzi蛋白质。我们发现主要的免疫球蛋白g的子类anti-B13 IgG1响应支持下产生的免疫球蛋白抗体可能非同源T细胞的帮助。这是进一步支持的缺乏遗传限制anti-B13 IgG抗体反应。可想而知,B13-specific B细胞可能会收到非同源T细胞特定的其他的帮助t . cruzi蛋白质,cointernalized十三区最,期间t . cruzi感染。相同的机制一直在观察系统性红斑狼疮,DNA-specific B细胞可能得益于T细胞特定组蛋白或其他核蛋白质(26]。然而,由于性质的十三区最蛋白质中供B细胞内吞作用t . cruzi感染是未知的,这一观点仍然是投机。

中的显著差异anti-B13免疫球蛋白抗体水平在CCC相比容易引人注目。这也为其他一些报告重组t . cruzi抗原,如抗原JL5 JL9, c端区域t . cruziHSP70 (27]。十三区最和JL5被描述为与心肌肌凝蛋白可交叉反应的28- - - - - -30.)分别和心血管该项和胆碱能受体(31日]。可能显示的高水平的血清CCC患者这两个潜在的致病性可交叉反应的抗体系统是生物相关病理自身免疫的一代。我们的研究结果表明,尽管十三区最蛋白质是衔接着重复,TI抗原,检测免疫球蛋白反应显然取决于非同源T细胞的帮助。进一步的研究,包括评估由十三区最直接的b细胞活化,可能需要明确建立血清免疫球蛋白的性质反应在慢性十三区最发现恰加斯病的病人。