苏木素特异性蛋白酶的转录谱和结构保守曼氏裂体吸虫

摘要

小泛素相关修饰(Small ubitin -related modifier, SUMO)参与了许多细胞过程，包括蛋白质定位、转录和细胞周期控制。sumo修饰是一个动态过程，由三种sumo特异性酶催化，并被Sentrin/ sumo特异性蛋白酶(SENPs)逆转。在这里我们报道了这些蛋白酶的特性曼氏裂体吸虫．使用在网上通过系统发育分析，我们鉴定了两个SENPs序列，即哺乳动物SENP1和SENP7的同源性，确定了它们的同源性和保守性。此外，转录本水平Smsenp1/7在尾蚴，成虫，和在体外采用qRT-PCR方法检测培养的血吸虫。我们的数据显示Smsenp1/7在尾蚴和早期血吸虫的转录本，随后在其他分析阶段的显著差异基因表达。然而，在分析的阶段，观察到的副曲线之间的表达谱没有显著差异。此外，为了检测寄生虫粗提取物的desumoylation能力，Sm采用SUMO-1-AMC底物检测SENP1酶活性。与SUMO-1前体加工相关的内肽酶活性在尾蚴和成虫之间没有显著差异。综上所述，这些结果支持发育调节的表达的特异性蛋白酶美国曼．

1.介绍

泛素和泛素样蛋白(Ubls)的翻译后可逆修饰在蛋白质功能、命运、结合伙伴、活性和定位的动态调节中起着至关重要的作用。小泛素相关修饰剂(Small ubiin -related modifier, SUMO)是Ubls家族的一员，它共价附着在细胞中蛋白质目标的赖氨酸残基上，改变功能和亚细胞定位[1］．sumo修饰参与了许多生物过程的调节，包括转录[2]和细胞周期控制[3.］．SUMO偶联机制是一个与泛素化密切相关的动态可逆过程。E1、E2和E3酶的顺序作用催化SUMO与目标蛋白的结合，而去共轭则由SUMO特异性蛋白酶促进。此外，像其他Ubls一样，SUMO多肽是作为非活性前体合成的，它需要c末端的裂解来暴露甘氨酸残基以进行底物缀合。这一过程也被sumo特异性蛋白酶通过其水解酶活性催化。催化活性维持在蛋白酶c端高度保守的200个氨基酸区域内[4- - - - - -6］．

最近，可逆的sumo化对正常细胞生理的重要性已经被证明。过多的相扑结合使用SENP1或SENP2敲除诱导胚胎致死表型[7，8， SUMO结合或去共轭的放松都可能导致癌症进展[9］．在人类中，有六种SENP酶(SENP1， -2， -3， -5， -6和-7)可以去共轭单链SUMO化的蛋白质或分解聚合的SUMO侧链酿酒酵母只有两种酶，Ulp1和Ulp2。基于这些活性和对SUMO亚型的亲和，SENPs可分为三个独立的亚家族:SENP1和SENP2;SENP3 SENP5;SENP6和SENP7 [9］．

素酰化途径的初步分子表征美国曼显示了两个相扑模拟子SMT3C和SMT3B的存在[10]，表明这些修饰有多种靶向底物。本小组最近报道了SUMO偶联酶的保守SmUBC9通过系统发育，一级和模拟三级结构，以及mRNA转录和蛋白水平贯穿整个美国曼生命周期。我们的数据显示Smubc9在早期血吸虫中，转录水平上调，提示这种翻译后修饰机制的利用美国曼发育，特别是在脊椎动物宿主入侵的初始阶段[11］．

进一步研究中美国曼，我们首先通过假定的基于同源性的搜索进行检索Smsenp使用公共可用年代．曼氏数据库。此外，水平Smsenp1/7使用来自尾蚴、成虫和机械转化血吸虫(MTS)的mRNA，通过qRT-PCR评估转录本。在体外培养时间分别为3.5 h、1、2、3、5和7 d。我们还测定了内肽酶活性Sm尾蚴和成虫粗提取物中的SENPs。本研究揭示了基因表达谱的差异Smsenp1/7在schistosomula发展。此外,类似的SmSENP1活性在尾蚴和成虫中观察到，表明这一蛋白水解活性在寄生虫的生命周期的重要性。

2.材料和方法

２．１．道德声明

所有涉及动物的实验都得到了奥罗普雷托联邦大学动物护理伦理委员会的授权，并符合用于实验动物使用和护理的国家和国际法规。

2．2．寄生虫。美国曼

LE菌株通过常规传代维持Biomphalaria glabrata蜗牛和BALB/c小鼠。将感染钉螺置于光照下2 h诱导其脱落尾蚴，并通过冰上沉降法恢复尾蚴。感染50 d后小鼠肝脏灌注获得成虫寄生虫。机械转化的血吸虫(MTS)由Harrop和Wilson制备[12］．简单地说，尾蚴被回收，在RPMI 1640培养基(Invitrogen)中清洗，然后以最大速度涡旋90 s，在37°C、5% CO的条件下立即培养3.5 h₂．回收的血吸虫用RPMI 1640洗涤，直至无尾。在随后的孵育中，寄生虫被保存在含有10%胎牛血清、青霉素和链霉素(100)的M169培养基中μg/mL和5%施耐德介质[13]在37°C, 5% CO₂3.5小时，1,2,3,5,7天。

2．3．的识别与计算分析SmSENP1/7

Sm提取SENP1/7序列美国曼基因组数据库5.0版本可在http://www.genedb.org/genedb/smansoni/通过爆炸搜索。氨基酸序列黑腹果蝇，秀丽隐杆线虫和智人SENP同源性被用作查询。以Pfam (v26.0)为基础的BLASTp算法允许检测来自美国曼序列。的多重比对Sm采用ClustalX 2.0进行SENP1/7, MEGA 5进行系统发育分析[14］．利用Neighbor-Joining法推断出这些序列的系统发育树[15］．利用1000个重复的bootstrap一致性树来描述该类群的进化历史。与在不到50%的引导复制中复制的分区对应的分支将被折叠。在引导测试中，相关的类群聚集在一起的复制树的百分比(1000个重复)显示在分支旁边。这棵树是按比例绘制的，其分支长度与用来推断系统发育树的进化距离的单位相同。从数据集中消除所有包含间隙和缺失数据的位置。

2．4．RNA制备及表达分析Smsenp1/7的存在

从成虫、尾蚴和血吸虫中获得总RNA，使用Trizol试剂(GIBCO-BRL)和氯仿进行提取，然后使用“SV总RNA分离系统”(Promega, Belo Horizonte，巴西)进行柱纯化。用无rnase - DNase I通过降低酶浓度(RQ1 DNase;Promega)。用分光光度计和含1的等分法定量RNAμ根据制造商的描述，使用来自Thermoscript RT-PCR系统(Invitrogen São Paulo，巴西)的oligodT引物转录总RNA的g。在不添加Thermoscript酶的情况下，通过PCR扩增cDNA反应混合物来评估DNAse I处理的效率。美国曼使用GeneRunner程序设计特定的SENP1/7引物SmSENP1 (GeneDB access number Smp_033260.2)(正向5 ' -AGGAAACGGAGGCGGGATTC-3 '，反向5 ' -ACACTGGAGACACGGGATGAGC-3 'SmSENP7 (GeneDB access number Smp_159120) (forward 5 ' - tcagttacggccctttatc -3 '， reverse 5 ' -CCTGAGAAGTGGATGCGATC-3 ')。采用SYBR Green Master Mix UDG-ROX (Invitrogen)和7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems，里约热内卢de Janeiro, Brazil)作为PCR扩增模板。特定的引物美国曼α-tubulin作为内源控制因子(GenBank访问号M80214)(正向5 ' -CGTATTCGCAAGTTGGCTGACCA-3 '，反向5 ' -CCATCGAAGCGCAGTGATGCA-3 ') [16］．根据Applied Biosystems应用开发的方案(cDNA稀释度分别为1:10、1:100和1:1000)评价每对引物的效率。对所有调查的转录本进行了三个生物复制，并对其基因表达进行了标准化α-微管蛋白转录根据方法(17使用应用生物系统7300软件。

2．5．肽链内切酶活性

为了确定成虫和尾蚴粗提取物中存在的SENP蛋白酶的酶活性，我们使用了SENP1特异性的荧光底物SUMO-1-AMC (Enzo Life Sciences, São Paulo, Brazil)。在这些试验中μ总蛋白G和0,45μ在50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM MgCl中，荧光底物的M₂±0,45μM sumo -1-醛(Enzo Life Sciences)控制特异性酶抑制。每一种酶的测定都在最后的100个体积中进行μ两种提取物均取L，然后在37℃孵育60分钟。加入2ml 99.5%乙醇，反应停止。在荧光光谱仪(Turner QuantechTM Fluorometer)中，波长分别为380 nm(激发)和440 nm(发射)的荧光读数，结果以每个荧光单位表示μ总蛋白质的G。

2．6．统计分析

使用GraphPad Prism 5.0软件包(Irvine, CA, USA)进行统计分析。采用单因素方差分析(ANOVA)建立数据的正态性。Tukey后检测用于研究SUMO蛋白酶在整个研究阶段的显著差异表达。在所有情况下，差异都被认为是显著的P值< 0.05。

3.结果

3．1．相扑特异性蛋白酶的保护SmSENP1/7

在网上分析SmSENPs揭示了SUMO蛋白酶的保守假定结构域美国曼．寄生虫数据库有两个编码假定SENPs的序列:Smp_033260.2(假定SENP1)和Smp_159120(假定SENP7)。SENP1有一个注释为Smp_033260.1的替代剪接表单。我们使用系统发生方法评估了这些蛋白在整个进化过程中的保存。我们的结果显示，每个SENP被分为2个不同的分支，在13个分析的同源物中加强了它们的结构保守性(图1）.

为了确认这些预测的蛋白酶是半胱氨酸家族成员，使用Pfam蛋白结构域数据库进行了分析。对于这两个SmSENPs条目显示了一个保守的Peptidase_C48结构域。我们的在网上分析表明Sm与SENP1更密切相关海关SENP1 (GenBank访问号NP_055369.1)SmSENP7与海关SENP7 (GenBank接入号NP_065705.3)。他们的催化结构域与人类SENPs的比对显示了三个必要的催化残基(Cys-His-Asp)的存在，如图所示2．

3．2．Smsenp1/7在美国曼

基因表达谱Smsenp1和Smsenp7采用qRT-PCR检测。我们设计了特定的引物进行扩增Smsenp1和Smsenp7在尾蚴-血吸虫转化和成虫的转录本(图3.）.我们观察到,Smsenp1和Smsenp7转录本在MTS-2d至7天和成虫的基础水平上表达。与成虫和血吸虫发育期间(MTS-2、3、5和7天)相比，在MTS-3.5 h中SENPs转录水平显著升高，大约是其10倍，与尾蚴和MTS-1d相比是其3倍。我们还观察到Smsenp1和Smsenp7转录水平无显著差异()，但MTS-3.5小时除外Smsenp7水平是。的3倍Smsenp1．

3．3．SmSENP1在尾蚴和成虫中的酶活性

在体外用尾蚴和成虫的粗提物进行内肽酶测定(图4）.的Sm与成虫相比，尾蚴的SENP1酶活性略高，但水平差异不显著(）.酶的活性也被记录在有一个商业可用的存在海关SENP1抑制剂，但在分析阶段未观察到显著差异。

4.讨论

我们小组之前的报告显示了两个相扑模拟(SMT3C和SMT3B)在美国曼，表现出幼虫和成虫之间的差异表达。通过比较分析的阶段，sumo分子的电泳模式也有所不同[10］．此外，我们的研究小组证明了UBC9在整个寄生虫生命周期中的差异表达谱[11］．相扑的结构保存在美国曼通过促进寄生虫发育过程中特定靶标蛋白的泛素化，SUMO可以作为转录调控和降解信号的候选靶标。

为了理解sumo化在美国曼，我们评估了SUMO蛋白酶在尾蚴、血吸虫和成虫中的保存及其基因表达谱。首先，我们通过同源性搜索，检索到两个包含SUMO蛋白酶保守域的序列。系统发育研究发现了两种与人类SENP1和SENP7密切相关的蛋白酶。寄生虫与人类同类的序列比对也显示了这两种蛋白酶的催化三联体的保存[18］．Ulp1和Ulp2的核心结构域内的活性位点残基已经被证明是催化活性的必要组成部分在活的有机体内在酵母中的作用[19，20.］．此外，Ulp1与任何已知的去泛素化酶缺乏明显的序列相似性，因此它不太可能处理泛素连接的底物[21］．

考虑到sumo化途径决定了多种底物的功能[22，以及中存在的两个相扑类比美国曼［10]，这可能是蠕虫利用不同的SUMO蛋白酶来实现SUMO成熟和靶底物的去umoylation。SUMO-1和SUMO-2/3之间的差异也可能解释了SENP蛋白酶的不同功能美国曼．在哺乳动物细胞中，蛋白质组学研究已经确认了被SUMO-1或SUMO-2/3选择性修饰的蛋白质[23］．众所周知，SENP1对SUMO-1的反应优于SUMO-2，对SUMO-3的催化常数很低[24］．相反，最近对人类SENP7催化结构域的表征表明，对SUMO-2/3链具有更强的解耦活性[25］．正如Shen所讨论的[26SENP7作为一种SUMO-2/3特异性蛋白酶，可能调控polySUMO-2/3的代谢，而不是SUMO-1偶联在活的有机体内．

在本研究中，SUMO蛋白酶的转录谱也通过qPCR评估，使用来自不同阶段的总RNA美国曼生命周期。基因表达数据显示相似的表达谱Smsenp1和Smsenp7在任何一个阶段，但在幼虫和成虫阶段两种蛋白酶的表达均有显著差异。差异基因表达谱观察Smsenp1/7在整个美国曼生命周期证明了在寄生虫发育期间观察到的SUMO结合的独特模式[10］．据报道，在热冲击处理和应力条件下，聚sumoylation会增加，SENP7负责拆除SUMO聚合物[25，27］．考虑到Smsenp1/7在尾蚴和MTS-3.5 h中，转录本显著升高，我们认为在寄生虫的身体适应新的代谢和形态改变过程中，压力诱导的SUMOylation机制的表达[28］．我们的发现也与Pereira的观点一致[11的基因表达谱显示了类似的模式Smubc9在上述寄生虫阶段。

我们没有观察到差异转录水平之间的正相关Smsenp1使用合成的SUMO-1-AMC底物评价酶活性。酶的活性水平SmSENP1尾蚴提取物含量略高于成虫。在一种特定的抑制剂的存在下，酶活性没有明显的变化被检测到。这可能解释了有限的氨基酸序列同一性(28%)SmSENP1及其人类同源物，这是合成SUMO-1醛的基础。其他研究旨在阐明基质选择SmSENP1/7在美国曼对其酶活性的详细动力学分析，特别是在尾蚴向血吸虫过渡的过程中，可以进一步了解这些酶的生物活性和SUMO偶联在其中的作用美国曼．

致谢

作者感谢转录组倡议:São Paulo转录组联盟;米纳斯吉拉斯GenomeNetwork;惠康信托基因组计划(英国)。这项工作由以下巴西研究机构支持:FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais, CBB 0558/09)， Núcleo de Bioinformática da Universidade Federal de Ouro Preto (NuBio UFOP)和CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico)。

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