吹蝇的形态和发育速度，萱草属植物(双翅目:丽蝇科)法医昆虫学应用

抽象的

萱草属植物(双翅目:丽蝇科)是一种重要的法医蝇种，在许多国家都有发现。在本研究中，我们测定了各发育阶段的形态和发育速度H. Higurriens.在泰国北部植物植物省的自然环境条件下饲养。描述并证明了基于光学显微镜下观察的所有阶段的形态学特征，以用于鉴定目的。此外，给出了每个阶段的开发时间。发展时间H. Higurriens.完成蜕变;从卵、幼虫、蛹到成虫，发育周期为270.71 h。研究结果不仅对法医学的研究有一定的指导意义，而且对今后的生物学研究也有一定的指导意义。

1.介绍

蝇类(双翅目:蝇科)标本，特别是在尸体和/或死亡现场发现的蝇幼虫，可作为法医调查的昆虫学证据，即估计死后间隔时间(PMI)和确定有毒物质、死前创伤和是否有尸体转移[1]，如已记载[2-4.］．昆虫标本的精确形态鉴定从应用的角度来看是一个非常重要的因素，因为它们为法医调查提供了相关证据[1］．

吹蝇种，萱草属植物（Wiedemann）是一种对泰国案例报告的一种取证重要的吹蝇物种[4.]及马来西亚[3.］．这种飞行物种广泛分布，覆盖韩国，台湾，老挝，新加坡，巴布亚新几内亚，澳大利亚，印度，中国，菲律宾，斯里兰卡，马来西亚，印度尼西亚和泰国[5.-7.］．除了在法庭上的重要性，H．ligurriens在市场和花园可能是一个讨厌的东西，成年人也是病原体的机械传播媒介，因为他们会被人类居住的环境附近的人类排泄物所吸引[7.］．以前，一些未成熟阶段(卵，3龄幼虫和蛹)的形态H. Higurriens.只在扫描电子显微镜和光学显微镜下进行观察研究[8.-13］．由于这个原因，可以得到的信息H. Higurriens.是不完整的识别所有不成熟的证据，可以在死亡场景中找到。此外，作为估算PMI的重要数据的发育速率在文献中也未见报道。此外，当地特定种群的发育数据对于估算幼虫年龄以确定PMI非常重要[14］．为了提高在法医调查中应用此信息时的准确性和精度，对所有未成熟阶段和发育速率的研究具有很大的兴趣，因为每个人的形态可以提供对适当识别和增长数据变得重要的特定功能特别条件可以为PMI估计提供基本数据。因此，本研究旨在通过在光学显微镜下观察来研究所有未成熟阶段的独特特征，以提供一些重要细节，以确定其发育率，特别是泰国北部植物植物省的发育率，特别是在植物植物省的病情。

2。材料和方法

２.１.维护H. Higurriens.在实验室

的殖民地H. Higurriens.在本研究中使用的是最初通过收集成人在泰国彭南诺省彭素村（Phitsanulok），泰国宫村（Muang Phitsanuk区）的扫描（16°44'18N; 100°13'44e）中收集成人苍蝇。所有成年人H. Higurriens.，利用Tumrasvin et al.等人的分类钥匙，在野外采集并根据形态进行鉴定[5.，然后在实验室里进一步饲养。根据Sukontason等人的方法，苍蝇在开放式饲养室内的自然环境条件下饲养[8.］．简单地说，成虫饲养在饲养笼(30 × 30 × 30 cm)中，并饲喂2种食物:(1)10% (w/v)糖溶液和1.5% (v/v)复合维生素糖浆溶液的混合物(SEVEN SEA，英格兰)和(2)新鲜猪肝。提供新鲜猪肝作为幼虫食物和产卵场所。每天观察猪肝上是否有鸡蛋。发现虫卵后，用钳子轻轻地将含有蝇卵的猪肝放入幼虫饲养箱中，然后取出2 ~ 3块(≈添加鲜猪肝50 g/d)作为幼虫饲料。每天加入一些新鲜猪肝片，直至箱内幼虫停止进食和移动或进入包皮期(3龄后期)。所有留在饲养箱中的猪肝块都从饲养箱中取出。只有蛹被保存在饲养箱中并密封，直到发现成虫出现。在那之后，盒子被放置在一个饲养笼中并打开，以便将成虫从盒子中释放出来生活在饲养笼中。按上述方法连续饲养新蝇代。

２.２.形态

蛋
在这项研究中，鸡蛋标本H. Higurriens.根据先前的Sukontason等人的描述，从实验室菌落获得以研究型高锰酸钾染色技术的不同特征。[9.］．在连接数码相机(韩国三星S700)的光学显微镜(日本奥林巴斯)下观察和拍摄珠孔周围中位区形态和绒毛膜雕刻等主要特征。在校准的光学显微镜下测量了30个蝇卵的宽度和长度。使用Excel软件(Microsoft office Enterprise 2007)对宽度和长度进行均值和标准差分析。

幼虫
该研究确定了所有幼虫阶段（第1，第2和第3龄）的形态和发育率。通过使用氢氧化物清除方法研究所有龄的形态。简而言之，每个仪器的30个幼虫从实验室菌群中获得，并通过将它们放入包含热水（80℃）的烧杯中以30秒来牺牲，以防止它们收缩[15］．之后，它们被保存在一个小玻璃瓶中，其中含有70%的乙醇。根据Sukontason等人所描述的方法，保存下来的幼虫分别在两个地点被解剖，在立体显微镜下使用锋利的刀片获得三个身体部分。[8.］．第一个切口位于第二胸段的中间，用于观察头咽内部骨骼和前外侧气道。第二切口位于第11体段，以观察后气道的特征。将每对前后部分置于含10% (w/v)氢氧化钾溶液的玻璃板中1天(1龄)或2天(2龄和3龄)，作为清理方法。随后,标本洗两次蒸馏水和中和安置在玻璃板上含有35%的乙醇和1%冰醋酸30分钟。之后,标本脱水连续在50%,70%,80%,95%,绝对乙醇(RCI LABSCAN、泰国)30分钟/酒精浓度。将脱水后的标本转移到含二甲苯的玻璃板上(PROLAB，法国)，放置1分钟后，用2-3滴安装介质(Permount)安装在玻片上。在每个标本上放置一个盖片。永久载玻片在室温下放置2天，在光学显微镜下观察。在连接数码相机的光学显微镜下拍摄各龄期的头咽骨骼和后气孔。此外，对所有龄期的体长和体宽进行了测定。 Thirty of the first instar larvae were measured by using a calibrated microscope, while the second and third instars (N在解剖显微镜下用Vernier卡尺测量= 30幼虫/每龄量。通过使用Excel程序分析其体宽和长度的平均值和标准偏差。

蛹
在这一阶段，研究前后部分的形态和颜色变化。使用氢氧化钾清除技术测定蛹的前部和后部，Sukontason等人之前曾描述过[10］．蛹期前部为蝇羽化后缩头至第四节的残体。他们是从已经出现苍蝇的饲养箱中招募的。对于每个后肢，在立体显微镜下用锋利的刀片切开蛹尾段，然后用镊子转移到与前部相同的玻璃板上。之后，将它们浸泡在1% (v/v)的洗碗剂中，以去除表面的伪影和/或猪肝组织。作为一种清理方法，将前后部分置于含有10% (w/v)氢氧化钾溶液的试管中，将试管转移到设定温度为80°C的水浴中1 h。然后，按照幼虫阶段的步骤进行标本制作。连接数码相机，在光学显微镜下观察和拍照前后部分的重要特征。统计30个前部每个后气门内乳头的数目，计算其范围。用游标卡尺测量了30只蛹的宽度和长度。 Mean and standard deviation of their width and length were analyzed by using the Excel program. For observation of coloration change, only one puparium which represented the color of the puparia in the rearing box was selected and photographed at 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, and 24 h by using the digital camera. Before taking photographs, puparium was washed in distilled water to remove surface artifacts.

成人
用试管饲养笼养5 ~ 7日龄的成虫。将其置于冰箱(−4°C)中2h处死。在那之后，它们被轻轻钉住，解剖排列良好。在连接到数码相机的立体显微镜下，对识别的重要特征进行检查和拍照。用游标卡尺测量30例成人的体长和体宽。在本研究中，体宽是指第二胸节的宽度，体长是全身的长度，从复眼中部到腹部的最后一节。通过使用Excel程序分析其体宽和长度的平均值和标准偏差。

2.3。发展利率评估

为了评估发育率，实验在泰国北部植物植物省的自然环境温度下进行了开放式系统饲养室。每天使用温度计和湿度计（Thermo-Hygro TM870，中国）每天记录温度和相对湿度。记录温度和相对湿度的范围（平均值±SD）分别为26.7±0.61°C和74±3％。对于每次实验，发育率开始寻找新孵化的幼虫（或第1龄）;预备阶段表示端点。新孵出的幼虫被认为是0 H老幼虫。通过将新孵化的幼虫与将相同的成人蝇菌落分成3组来研究该研究的发育率评估。每组由150-200个新孵化的幼虫组成。通过使用湿涂料刷（第4号），将它们从饲养箱轻轻转移到新的盒子。新鲜猪肝（≈每天作为每次饲养箱中的幼虫的食物来源每天提供50克。每3小时从饲养箱中取出五大幼虫。通过放置在热水中牺牲了它们（≈80°C) 30秒，以防止幼虫收缩[15并保存在一个小玻璃瓶中，其中含有70%的乙醇。根据幼虫的大小，在解剖显微镜下用校准的显微镜或游标卡尺测量所有保存的幼虫的体长。利用Excel软件分析了幼虫体长与发育时间的关系。此外，使用Excel程序记录和分析其他阶段的寿命。

结果

３.１.形态

蛋
蛋的H. Higurriens.前后两端被拉长和变细(图1(a))。测量长度为1.44±0.11 mm，宽度为0.47±0.04 mm1）.这一阶段的蜕皮至幼虫期需要10.3±0.30 h1）.未沾污的鸡蛋呈乳白色;1%高锰酸钾染色后为浅棕色。正中区域位于背侧，呈y形，从前端几乎延伸到后端(图)1(b))。孵化线是直立的，因此显示沿中间区域的深色增厚(图)1(a))。绒毛膜雕塑以六角形图案出现，网状边界像网一样稍稍抬高(图)1(c))。

幼虫
在立体显微镜下观察H. Higurriens.典型蝇蛆状幼虫，前尖后钝。尾节有一对后气门。1龄幼虫相对较小，长2.62±0.70 mm，宽0.75±0.35 mm，发育时间为12±0.1 h(表1)1）.头颅骨骼骨骼没有发达（图2(a))，而后气门有2个气门狭缝腹侧合并(图2(e))。2龄幼虫长6.24±1.67 mm，宽1.37±0.19 mm，持续时间12±3 h(表2)1）.头咽骨骼几乎完整(图)2(b))，而后气门有2条分离的气门狭缝，且气门周缘色素较弱且不完整(图)2（F））。3RD Instar的尺寸最大，长度为12.18±1.31 mm，宽度为2.32±0.19毫米。发展时间也是在这个阶段最长的，是84±3小时（表1）.3龄早期和晚期的头咽骨骼相似(图)2(c)和2(d),职责)。早期的后气门(图2(g))和晚3龄(图2（h））类似，具有3分离的刺瓣和完整的刺激性，除了后者显示高度色素的颌骨（图2（H））。所有三个龄的特征都总结在表格中2．

蛹
的蛹壳H. Higurriens.是典型的常规形式（图3.)，长度为6.82±0.27 mm，宽度为2.76±0.11 mm1）.观察到的颜色变化表明，早期的蛹是乳白色的颜色（0h），后端仍截断（图3（a））.但蛹的颜色在蛹期3 h内逐渐变为浅黄棕色(图)3 (b))，然后在大约15小时后变成棕色(图3 (f)）.经过18 h左右的观察，蛹的颜色变为深褐色(图)3 (g)）.在24 h时，蛹呈深棕色(图)3(我)）.整个蛹期持续时间为152.5±30.7 h1）.

用10％氢氧化钾处理后，蛹的前部和后部的观察出现为浅黄色棕色。用盖板压制的前板是梯形形状，位于两个顶端的2前螺旋状物（图4(一)）.每个前气道由5 - 7个乳头组成(图)4 (b)）.在第三段中观察到的脊柱显示单尖尖提示的行（图4 (c)）.每个后气门出现三个高度着色的深棕色气门狭缝，纽扣着色高，晶周着色弱(图)4 (d)）.

成人
成人H. Higurriens.长12.23±0.61 mm，宽2.85±0.25 mm(表1）和金属铜绿的外观，胸部前部的灰白花糖（图5(一个)和5 (b)）.女性的头部是dichoptic，但男性是亚霍多奇（图5 (c)和5 (d)）.在两性中都发现灰色的面部授粉(图5 (c)和5 (d)），整个第三个触发部分是深棕色或橙色的腹部（图5 (c)和5 (d)）.鳞片发白(图5 (e)）.Gena身上长满了黑色的毛发(图5 (f)）.茎静脉无栓子(图5 (g)）.在胸部发现两具体位性背联体刚毛(图)5 (h)）.supraconvexity被发现是毛发的头发（图5(我)）.以上特征对该蝇成虫的鉴定具有重要意义。

３．２．发展利率评估

的发展速度的评估H.ligurriens在调查期间确定，基于Phitsanulok省的自然环境。幼虫阶段的生长曲线显示乙状体形式（图6.）.饲养发育速率的数据显示，从幼虫初孵到羽化开始的发育时间在108 h内增长迅速。幼虫的最大中位长度在≈42 h, 108h发生蛹化。表中也总结了各阶段的寿命1．

4.讨论

与昆虫重要特征相关的数据，以快速和可靠的鉴定和发展在实验室是关键的先决条件，适当地应用于法医调查。H. Higurriens.是一种重要的法证苍蝇品种，在马来西亚和泰国的法证案件中均有记录[3.那4.］．本研究的重点是识别各阶段的重要特征h . ligurriens在平均温度为26.7±0.61°C、相对湿度为74±3%的自然环境条件下，观察各发育阶段的发育时间。虽然形态学在某些阶段H. Higurriens.已经用扫描电子显微镜和光学显微镜进行了研究[8.-13]，本研究通过简单的技术，提供了更详细的特征信息和新的线索，以提高鉴定的准确性和精密度。此外，本研究提供了发育数据H. Higurriens.，可用于估计这种蝇类曾在其上居住的尸体的PMI。

绒毛膜雕刻以及中位面积的宽度和长度以前曾被报道为鉴定蝇卵的重要特征[9.那13］．形态学的H. Higurriens.在本研究中观察到通过用1％高锰酸钾和在光学显微镜观察的研究中观察到的蛋，类似于先前的工作中，通过使用扫描电子显微镜研究[11］．因此，本研究结果证实了Sukontason等人发起的染色方法的有效性。[9.]，以识别蝇卵。在光镜下可以清楚地观察到染色的卵。当将数据与以前的研究进行比较时H. Higurriens.本研究中的鸡蛋大于其他打击苍蝇的蛋，如Lucilia Cuprina那锡林义菊（=Chrysomya）nigripes.,Aldrichina grahami;然而，它的尺寸与大小不同Chrysomya Megacephala.和Achoetandrus（=  Chrysomya）rufifacies[9.］．然而，根据Erzinclioglu的信息，不能用作捕获卵的大小作为识别的主要特征[16他报告说，苍蝇卵的大小取决于饮食水平。因此，对蝇卵的鉴定应以卵瓣宽度特征、珠孔周围卵瓣区域的形态特征为主要标准，以卵瓣大小为辅助特征[9.］．

根据我们的文献，本研究是首次在光镜下观察所有龄期幼虫的头咽骨骼和后气孔形态。不同龄期幼虫的头咽骨骼和后气门明显不同。这项研究的结果与之前的报告一致[11-13］．此外，本研究还显示了各龄期的晶状体周围色素沉着程度。这可能是区分幼虫年龄，特别是早期和晚期龄期的新线索。由于不同龄期和色素沉积程度的差异，本研究的数据可能有助于对上述蝇类幼虫的阶段和年龄进行详细的鉴定。

蛹期形态研究的结果与以前的报告相似[10］．通过观察颜色随时间变化的结果H. Higurriens.本研究首次报道了蛹期，这可能是另一个新的支持证据，以确定至少近似的蛹期，提高PMI值的准确性。

本研究展示了一些具有鲜明特征的照片，可用于成人的识别H. Higurriens.．这些从本研究中得到的特殊特征的照片可能对那些不熟悉分类学关键字术语的人有用。Kurahashi和Bunchu提供了目前在泰国鉴定吹蝇种类的分类学关键字[17］．由非眼部学家的肉眼，成人H. Higurriens.看起来类似于答:rufifacies在外表上。因此，这两种物种都有可能发生错误鉴定的机会，特别是在泰国，因为答:rufifacies是泰国的第二大优势蝇种，在该国部分省份发现两种蝇种重合[18］．

这项研究是第一个提供发育时间的报告H. Higurriens.在所有的阶段。结果表明，发育时间H. Higurriens.在本研究的自然条件下（平均温度为26.7±0.61°C，相对湿度为74±3％）速度快于C. Megacephala.和  一种．rufifacies,研究的平均温度为27.4°C [19］．此外，各发育阶段的发育时间H. Higurriens.与之不同C. Megacephala.和  一种．rufifacies．规定了每种物种的发育率，尽管它们在相同或相关条件下增长[18］．此外，在地理上不同的种群中发现了果蝇种发育时间的差异[14］．估计幼虫年龄需要局部种群特异性发展数据来确定PMI。因此，本研究的数据对于进一步的应用非常重要，特别是在Phitsanulok省。

从形态特征和发育时间两方面获得的数据，填补了以往的信息，为该蝇种的鉴定和在法医调查中的应用提供了新的支持证据，特别是当H. Higurriens.存在于人类尸体中此外，在未来的生物学研究中，它们可能会成为有用的基线数据。

致谢

这项研究主要由Naresuan大学医学院N. Bunchu和泰国研究基金(MRG5280194)提供的资金支持。作者还感谢Naresuan大学医学科学学院医学生物技术卓越中心和Naresuan大学研究管理处的支持和支付出版费用。

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