文摘
摘要vasorum是一个新兴的寄生虫相关的狗和食肉动物有一个间接的生命周期,与各种陆生、水生腹足类的中间宿主。不幸的是,之间的关系答:vasorum和他们的蜗牛主机仍然知之甚少。循环血细胞的细胞是主要的防线参与破坏寄生虫的蜗牛。旨在进一步描述血细胞的子集Biomphalaria蜗牛,我们已经进行了流量仪分析全血淋巴细胞组件使用multiparametric双颜色标签的过程。我们的研究结果表明,b . glabrata感染了答:vasorum有两个主要的循环血细胞子集,称为小型和大型血细胞。随着时间的推移发生细胞比例的差异。更好的无脊椎动物的感染控制策略的发展肯定会导致更好的控制引起的人类疾病属的其他物种摘要。这些知识将有助于建立新型控制策略旨在使用软体动物作为中间宿主的寄生虫和澄清parasite-host关系的新方面关于细胞识别和激活机制,还发现在脊椎动物的先天反应。
1。介绍
摘要vasorum是一种线虫属于总科Metastrongyloidea寄生于国内狗(犬属后裔)和野生食肉动物。摘要vasorum分布在欧洲、美洲和非洲(1]。孤立的流行焦点通常观察到,尽管这些焦点区域以外的感染的报道越来越多的记录(2]。病理学的一个决定因素犬angiostrongylosis似乎与终宿主的寄生虫的位置。存在的动脉和动脉的分支内的寄生虫宿主促进血管壁的机械和代谢作用,这可能会改变体内平衡(3,4),导致肺炎,赛车的性能损失,咳嗽,和贫血5]。严重感染的狗可能会心脏衰竭和肺纤维化,其次是减肥,出血diatheses,和死亡6,7]。
摘要vasorum有一个间接的生命周期,与各种陆生、水生腹足类的中间宿主(8- - - - - -13]。有些陆生软体动物的自然宿主答:vasorum。在实验室里,这种线虫可以保持planorbids的一些物种。Biomphalaria glabrata是一个相当重要的淡水planorbid实验中间宿主的摘要sp。种Biomphalaria能够保持其完整性主要通过其内部防御系统的活动,是由细胞和可溶性组件。循环血细胞的细胞是主要的防线参与破坏寄生虫的蜗牛作为中间宿主(14- - - - - -16]。这些细胞可以绑定传染性病原体通过吞噬合胞体皮和/或释放细胞毒性化合物(17]。
循环血细胞在b . glabrata是由至少两个细胞群:hyalinocytes和粒细胞(16,18- - - - - -21]。这些细胞群在形态上有着很大的不同,生物化学,和功能方面22,23]。成功消除潜在感染性的代理要求粒细胞吞噬颗粒,进一步消除病原体通过酶或氧化降解。相比之下,hyalinocytes被认为是主要负责伤口修复(24,25),需要聚合在一个受伤的网站。
在感染寄生虫,内部防御系统的物种Biomphalaria能够识别寄生虫分子通过一个系统类似于(可溶性或membrane-binding)模式识别受体激活吞噬细胞,导致寄生虫封装和破坏(26]。不幸的是,之间的关系答:vasorum和他们的蜗牛主机仍然知之甚少。更好的无脊椎动物的感染控制策略的发展肯定会导致更好的控制人类疾病引起的其他属的物种摘要。
本研究的目的是描述循环血细胞的概要文件b . glabrata后答:vasorum感染使用流式细胞术分析。
2。材料和方法
2.1。寄生虫的来源
的压力答:vasorum实验中使用的是孤立的从国内狗的粪便。线虫是由串行感染家犬和水生蜗牛(b . glabrata)实验室的兽医寄生虫学、寄生虫学、联邦德·米纳斯吉拉斯大学(UFMG、巴西)。
实验协议进行了符合伦理原则UFMG所采用的动物实验伦理委员会在动物实验和批准过程数量060/03。
2.2。寄生虫感染
第一阶段的幼虫答:vasorum(L1)的粪便中分离的实验感染狗使用Baermann装置,其次是用滤纸过滤,所描述的Barcante et al。27]。可行的L1幼虫的数量估计在立体显微镜(放大:40 x)。Biomphalaria glabrata蜗牛是单独接触1000 L1的幼虫答:vasorum24小时的2毫升dechlorinated水(28]。组10个人在整个试验容器,保持在室温(25 - 27°C),生菜和美联储。
2.3。血淋巴组
整个血淋巴的收集蜗牛在不同时期答:vasorum感染:30分钟,1、2、3、4、5、6、12、24、48、72 h后感染以及10、20、30、60天之后感染。使用描述的方法收集了血淋巴Martins-Souza et al。16]。每一个蜗牛壳是用70%的乙醇清洗,用吸水纸干,血淋巴是收集的心脏穿刺使用21-gauge针。为了避免细胞凝集,整个血淋巴是收集和稀释(1):1 (v / v))在宁的平衡盐溶液(cbs)(氯化钾氯化钠47.7毫米、2.0毫米、0.49毫米的无水Na2HPO4MgSO 1.8毫米4h·72CaCl啊,3.6毫米2h·22NaHCO啊,0.59毫米3,5.5毫米的葡萄糖和海藻糖的3毫米)含柠檬酸/ EDTA缓冲区(50毫米的柠檬酸钠,10毫米的EDTA,蔗糖和25毫米)在pH值7.2。
2.4。血细胞计数
每次三个蜗牛的血淋巴组划分为一式三份(1毫升)在超小型电子管和测试。残骸沉积了两分钟后,整个血淋巴转移到另一个超小型电子管(1毫升)。全血细胞计数进行使用10μL整个血淋巴的稀释(1/10)在cbs缓冲区包含0.5%中性红溶液(中性红保留试验(NRRA))。染成红色的血细胞被列为粒细胞和那些没有被认为是hyalinocytes。
2.5。流式细胞术分析
流式细胞术分析所描述的Martins-Souza et al。16]。个人收集后,血淋巴从三个蜗牛从同一实验组是汇集和三个独立池准备和测试每个实验组。
血淋巴孵化与propidium碘(π)和吖啶橙(Ao)解决方案允许可行的分离循环血细胞(积极Ao / Eb -细胞)的死细胞(Ao - / Eb阳性细胞)和小片段(Ao和Eb负面事件)。总共有150μL的汇集整个血淋巴与同等体积的混合propidium碘(25毫克的π/毫升95%酒精)和吖啶橙(Ao 7.5毫克/毫升95%酒精)稀释(1:1000)在cbs柠檬酸/ EDTA。
血细胞悬浮孵化一个h在冰没有光线。暂停使用FACScan当时分析流式细胞分析仪(美国BD-Becton Dickinson)。流式细胞术分析细胞组件执行整个血淋巴的使用仪器设置捕获从propidium碘荧光信号(FL2)和吖啶橙(FL3),使用对数放大尺度。15000事件为每个池血淋巴样例进行分析。
数据分析是使用细胞执行任务项目(美国,正欲)。FL2与FL3点阴谋分布图形构造区分活细胞和死细胞和碎片。血细胞生活选择基于规模和内部复杂性(激光散射(FSC)和散射(SSC),职责)。两个主要的选择基于FSC血细胞的细胞亚群。百分比的血细胞子集从流式细胞术分析获得进一步转化为绝对计数考虑总可行的血细胞计数(NRRA)中执行一个纽鲍尔室获得同样的血淋巴样。
2.6。统计分析
数据指循环血细胞的数量在每个单元格的子集作为平均值和标准偏差,分析了使用单向方差分析(方差分析)其次是Bonferroni发布测试。
3所示。结果
过程中感染,发生了显著减少循环血细胞的数量从4到72小时后接触答:vasorumL1幼虫()(图1(一))。这是通过五个小时后逐渐减少感染。感染后6到72个小时,蜗牛循环血细胞的数量仍然没有改变,尽管数量显著低于对照组()。从10到60天感染后,正常血淋巴总血细胞被重建的模式,与组之间无显著差异()(图1 (b))。
(一)
(b)
血淋巴孵化propidium碘和吖啶橙的解决方案允许可行的分离循环血细胞从死血细胞(图2)。可行的循环血细胞从Biomphalaria蜗牛是分为两个主要的细胞亚群主要基于大小(小(FSC频道在200年和440年之间)和大440年和840年之间(FSC通道)和粒度。血细胞的亚种是计价的小型(R1)和大型(R2)。
在控制,41%的血细胞是小,59%是大(图3)。三十分钟后感染,在小的百分比有显著减少循环血细胞。这种表型资料保持不变直到感染(图4小时后3(一个))。在随后的几个小时,小细胞的数量表现出倾向减少直到达到显著降低值比控制在48和72小时()。从10到60天之后感染,感染蜗牛的小血细胞恢复的数量仍低于对照组()(图3 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
尽管无脊椎动物占绝大多数的生物,出版物主要解决对病原体的防御机制已经限制与病原体相互作用的脊椎动物(15]。自描述的参与软体动物的进化周期中间宿主答:vasorum由Guilhon [29日),很少被发现对于生物学和parasite-host交互感染,特别是与中间宿主。研究表明不同的某些种类的软体动物感染的易感性答:vasorum(13,30.]。
软体动物对刺激反应强烈的能力取决于血细胞可行性和功能的能力。进行研究b . tenagophila证明暂时减少循环粒细胞数量的增加对感染的易感性曼氏裂体吸虫(23]。
在目前的研究中,血淋巴的循环血细胞的数量b . glabrata显著降低感染后不久答:vasorum到72小时后感染病例。软体动物的循环系统通常是开放的,血细胞可以自由行动的组织(31日]。在组织学的削减b . glabrata感染了答:vasorum,Barcante [32)发现perilarval组织细胞浸润发生在五个小时后感染。同样,Bezerra et al。33报告循环血细胞的数量的减少b . glabrata在前五小时后感染美国曼。这些观察表明,在感染的b . glabrata通过答:vasorum,perilarval组织反应的发病和典型的肉芽肿的形成,细胞迁移到组织传播,导致减少这些血淋巴细胞的数量。
的感染,细胞的趋化性幼虫感染的网站停止,由此重建细胞水平,如感染后10天开始(32]。根据Barcante [32],减少perilarval多孔性从长远来看,这解释了稳定的细胞成分血淋巴感染后10天开始。同样,佩雷拉et al。23报告增加血细胞激活没有相应的循环血细胞的数量增加b . tenagophila感染了答:vasorum由于迁移循环细胞在封装过程中感染的网站。
其他软体动物和无脊椎动物一般的血细胞,而容易定义形态和分布在已知类别的函数。相比之下,血细胞b . glabrata不提供简单的识别标准,如特定的分泌颗粒(34]。因此,流式细胞术分析被证明是一个有用的工具分析循环血细胞。特别是在b . glabrata未感染蜗牛,两个亚种群的细胞表现为:小圆细胞从5到6μm与小粒度和大细胞直径从6.5到8μ米直径更大程度的粒度(22]。
目前的研究发现两个亚种群具有类似特征的前面描述的组件以及在感染细胞轮廓的变化答:vasorum。随着时间的推移发生细胞比例的差异。许多研究证明hyalinocytes粒细胞的前身,在仪计数,小细胞hyalinocytes和小粒细胞,而大型细胞粒细胞。因此,在感染的发病a . vasorum小细胞的比例减少了由于hyalinocytes转化为粒细胞,这些粒细胞组织的后续迁移后5个小时(见组织学削减),从而解释了小血淋巴细胞的比例增加在这一点上(32]。这一发现证实了结果被Bezerra et al。33),谁解释血淋巴中的粒细胞的数量减少,粒细胞是引发感染细胞迁移到网站,所展示的组织学分析。在感染的后期,小细胞的百分比低是因为软体动物感染,引发细胞作用,即使在一个较小的强度,如组织学削减(32]。
5。结论
研究parasite-host通过评估感染的关系b . glabrata通过答:vasorum对知识有很大贡献的内部防御系统所使用的机制这些无脊椎动物。这些知识将有助于建立新型控制策略旨在使用软体动物作为中间宿主的寄生虫和澄清parasite-host关系的新方面关于细胞识别和激活机制,还发现在脊椎动物的先天反应。此外,答:vasorum线虫的兽医的重要性增加的可能性是人畜共患病的因果代理还没有丢弃,使研究软体动物和寄生虫相互作用重要的理解angiostrongylosis的生物学和流行病学。