文摘

维生素D信号调节各种各样的免疫反应。在这里,我们评估了维生素D在免疫中的作用在缺少维生素D受体的老鼠们注入实验感染利什曼病(VDRKO)。我们观察到VDRKO老鼠基因耐药背景了利什曼虫主要全身的病变发展相对于野生型小鼠(WT);此外,在感染寄生虫加载真皮在感染的高度明显降低。活性形式的维生素D模拟酶损耗的消融,导致增加阻力l .主要。相反,VDRKO或维生素d缺乏的老鼠在易感Th2-biased背景没有敏感性的变化。这些研究表明维生素D缺乏,通过论述的消融或消除它的配体,1、25 d3,导致增加阻力l .主要感染,但只有在一个主机是th)免疫反应的倾向。

1。介绍

最初的维生素D代谢₃发生在皮肤7-dehydrocholesterol转化为前维生素D₃在暴露于UVB辐射。异构化后,维生素D₃由肝脏代谢25-hydroxylase (CYP2R1)形成人体内25 -羟维生素D₃(25 ohd3)的主要传播形式的维生素D₃。25 ohd₃代谢是1α羟化酶(CYP27B1)存在于肾脏组织,包括皮肤和许多其他目标。活动形式的维生素D₃,1α25 dihydroxyvitamin D3 (1,25 D3)把目标细胞的细胞核,它结合维生素D受体(VDR),表生的核受体家族的一员。VDR与视黄素X受体二聚化和这个复杂的认识到维生素D响应元素在许多基因的启动子转录调节。

1,25 d3也为其特征函数在保持适当的血清钙浓度以及合适的骨形成的关键需求。除了这些角色,1,25 d3免疫反应的调节是很重要的。维生素D在白细胞分化具有重要作用,辅助细胞的树突状细胞成熟,调制二分法(1- - - - - -5]。Th-1-mediated自身免疫性疾病的症状可以减少或消除治疗1、25 d3 (6- - - - - -8]。除了它在自身免疫性疾病中的作用,最近的研究探讨维生素D-mediated信号在传染病阻力的作用[9]。例如,结核分枝杆菌感染导致船舶和1 -α羟化酶,这是必要的对于生产的抗菌肽的抗菌肽反应的结核分枝杆菌体外感染(10]。在这里,我们调查的角色VDR在免疫小鼠实验皮肤利什曼病(CL),典型的在活的有机体内th1 / th2二分法的模型。寄生虫的属利什曼虫负责一个光谱的疾病从自我修复皮肤的疾病可能致命的内脏疾病。免疫l .主要负责皮肤利什曼病的寄生虫,是高度依赖于一个强大的干扰素γ介导辅助1 (th))的反应。这种th1反应诱发产生一氧化氮(NO)在消除寄生虫是至关重要的。

我们报告,VDRKO老鼠表现出减少病变发展以及减少寄生虫加载的l .主要感染。此外,我们表明,抗小鼠所呈现的维生素d缺乏的1 -的消融α羟化酶酶CYP27B1 KO小鼠模拟VDRKO老鼠对于减少病变发展,表明效果依赖于配体的存在。令人惊讶的是,基因易感小鼠缺乏维生素D的信号没有影响l .主要感染。

2。材料和方法

2.1。老鼠

VDRKO [11],CYP27B1KO [12)、WT老鼠BALB / c和C57BL / 6的背景,是维持在Friemann圣母大学的生命科学中心(美国印第安纳州圣母)。生成BALB / c VDRKO应变,女C57BL / 6 VDRKO老鼠繁殖与WT雄性BALB / c小鼠。这个交配的雌性后代基因分型的PCR (11)和小鼠确定为VDRKO等位基因的杂合的backcrossed WT雄性BALB / c小鼠。这个过程重复了7次结果大于99.2% BALB / c小鼠的背景。男性和女性的杂合的老鼠培育彼此产生纯合的后代为WT VDRKO等位基因或等位基因。这些纯合子小鼠被用于建立育种群VDRKO和WT在BALB / c小鼠的背景。VDRKO,从断奶WT老鼠维持钙,high-lactose救援饮食(TD96348;美国威斯康星州麦迪逊Teklad),以防止低血钙症与VDR不足(13]。所有动物协议被圣母大学的批准和审查制度动物保健和使用委员会(IACUC)。下面描述的实验中使用的所有老鼠是女性1到4个月大的时候。所有实验WT雌性老鼠的同龄。

2.2。寄生虫和感染

l .主要NIH Friedlin V1应变(MHOM / IL / 80 / FN)被用于这项研究。寄生虫是培养和感染性阶段,metacyclic promastigotes生成如前所述[14]。感染,1×10⁵metacyclic promastigotes 20L PBS的皮内注入耳朵的外表面。病变直径和厚度和溃疡直径测量每周数字游标卡尺。病变“得分”是通过添加值计算获得病变直径、溃疡直径和病灶厚度。相对寄生虫感染的耳朵组织均质来确定负载通过执行限制稀释试验(如前所述)(15]。

2.3。组织学

段的耳朵组织嵌入Tissue-Tek 10月冻结媒体(费舍尔科学、匹兹堡、PA)、分段和梅耶的苏木精和伊红染色区分细胞质和细胞核,分别。获得的图像使用尼康竞走光学显微镜(美国纽约尼康,梅尔维尔)。

2.4。免疫球蛋白子类的决心

收集使用血清可溶性利什曼虫特定ELISA抗原(SLA)。免疫球蛋白子类具体的二级抗体(南方生物技术,伯明翰,阿拉巴马州,美国)被用来确定免疫球蛋白子类的水平。吸光度记录使用SpectraMax M2板读者(美国加利福尼亚州的分子装置)。从小鼠感染后12周后血清池,每个板上作为正常化运行示例。对于每一个同形像,每个正常化的吸光度样品被用来生成一个意味着吸光度(ABS)。板板变化是取消使用方程(意思是ABS /板ABS)×(板ABS) =规范化ABS。

2.5。定量rt - pcr分析

总RNA分离出粉耳朵使用RNeasy迷你包(美国加州试剂盒,瓦伦西亚)根据制造商的指示和污染通过DNase DNA被我治疗(表达载体,加州卡尔斯巴德,美国)。使用1逆转录执行g已经没有dna的细胞总RNA, 250 ng随机引物(表达载体),上标三世工具包(表达载体)。实时PCR进行ABI 7900 ht序列检测分析仪(美国应用生物系统公司,加州福斯特城)使用2 x SYBR绿色装备(应用生物系统公司)。引物(300海里;美国Iolua IDT,珊瑚镇)产生HPRT,干扰素γil - 4, IL-12p40 [16],__arg1 [17],伊诺[18甘氨胆酸,il - 10: 5′cac AAA GCC TTG CAG AA-3′/ 5′ctg GCC有条件现金援助GCT手枪CCT-3′, TNFα:5′棉酚ACA CAA手枪GCT GGG ACA GT-3′5′/猫TCG gg CTC CAG TGA ATT颈- 3′。为FoxP3基因表达决心使用预制基因表达分析(应用生物系统公司)根据制造商的指示。相对拷贝数确定使用比较CT方法(19]。

2.6。引发刺激试验

淋巴结受感染老鼠中断使用注射器柱塞和细胞过滤器(美国BD生物科学,加州圣何塞)和细胞从4老鼠每50条件汇集和刺激克的SLA。细胞上清液在治疗后120小时收获,分析Luminex 200仪器使用多路复用生物标记免疫测定(微孔、Billerica的质量,美国)。两个生物复制评估,第一个在四倍的两个独立Luminex盘子和第二个在复制一个盘子。

2.7。流式细胞术

FcReceptors被封锁10%正常小鼠血清和染色使用1% BSA在PBS。细胞表面标记进行使用以下antimouse抗体:α-CD45,α-CD11b,α-CD11c,α-LY-6C / G,αcd4细胞,αcd8,α细胞受体(BD生物科学),α-F4/80(表达载体)αfoxp3 (eBioscience,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。适当的同形像控制作为消极的控制。流式细胞仪进行使用fc - 500流式细胞分析仪(贝克曼库尔特,富勒顿,CA)和分析MXP分析软件(贝克曼库尔特)。

2.8。饮食的研究

维生素D缺乏实验中,老鼠TD.04179,维生素D缺乏饮食(哈伦Teklad)从出生之前交配的雄性老鼠相同的背景。断奶后,这些老鼠的后代仅仅使用在整个研究维生素d缺乏的饮食。老鼠的耳朵和感染病灶,测量如前所述。维生素D的血清进行分析使用25 (OH) D3 ELISA和1,25 D3 ELISA (id、泉山、阿兹,美国)后,制造商的指示。

2.9。代的骨髓中巨噬细胞和骨骨髓来源树突状细胞(DC)

骨髓是刷新与RPMI-C股骨。红血球细胞溶解使用冰冷的无菌ACK裂解缓冲Nh(0.15米₄KHCO Cl, 10毫米₃,0.1毫米Na₂EDTA)。巨噬细胞生成如前所述[14]。代的直流,祖细胞数和resuspended 2×10⁵包含20 ng / mL /毫升RPMI-C粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm - csf) (Peprotech,落基山,新泽西,美国)。细胞补充了新鲜RPMI-C包含20 ng / mL gm - csf天3、6、8、10。12天,被转移到24孔板的细胞实验的持续时间。

2.10。吞噬作用分析

巨噬细胞或直流与干扰素治疗γ(500 U /毫升)和/或1,25 d3(美国宾夕法尼亚州Biomol,普利茅斯会议)(40 nM) 24小时或不及时治疗。细胞被感染的比例5:1 V1应变l .主要metacyclic promastigotes。寄生虫与5%的正常小鼠血清调理的30分钟,水洗,然后coincubated巨噬细胞和树突细胞1,2,4,24小时。盖玻片是沾Diff-Quick(费舍尔科学)。

2.11。白介素ELISA /一氧化氮(NO)化验

il - 12水平进行了分析使用anti-IL-12p40 ELISA(皮尔斯,罗克福德,生病,美国)。没有生产评估格里斯反应根据制造商的指示(美国威斯康星州麦迪逊Promega)。

2.12。统计分析

病灶大小的统计分析,方差分析(方差分析)WT - KO菌株和后续利用Bonferonni检测后确定在什么时间点的压力是不同的。配对t进行测试来确定差异WT为寄生虫和KO人口负担,免疫球蛋白水平,细胞因子调控,所有在体外分析。所有使用GraphPad Prism 4.0软件进行统计分析。在所有情况下,价值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。VDRKO在C57BL / 6小鼠背景表现出增强抵抗原虫感染

探讨VDR在免疫力的作用l .主要感染C57BL / 6 VDRKO在耳朵真皮和WT老鼠感染10⁵l .主要metacyclic promastigotes。两组的老鼠最终发达病变愈合;然而,VDRKO老鼠发达病变明显小,愈合速度比WT同行(图3周1(一))。再感染,VDRKO老鼠没有出现病变继发感染而WT老鼠的网站开发小病变(图3周内解决1 (b))。这些结果表明,VDRKO老鼠增加阻力l .主要感染WT老鼠相比,减少损伤的发展。此外,VDRKO老鼠有一个完整的和可能提高内存对继发感染。

因为VDRKO小鼠减少病变发展,我们比较了寄生虫感染部位的负载VDRKO和WT老鼠之间使用限制稀释测定。在感染后4周,两组小鼠类似的寄生虫感染部位的水平,而在第八周,VDRKO鼠体内寄生虫WT相比明显减少小鼠(图1 (c))。然而,通过在感染后12周,VDRKO老鼠存在寄生虫负荷显著升高,这表明伤口愈合和寄生虫杀死可能发生通过不同的机制(20.]。

3.2。1 -αHydroxylase-Deficient老鼠表现出高度抵抗原虫感染

缺少1 - CYP27B1KO老鼠α羟化酶酶所需1,25 d3,显示典型的病变发展中观察到抗(C57BL / 6)菌株的老鼠;几周后,病变发展,并最终解决。类似于VDRKO老鼠,CYP27B1KO老鼠发达WT同行相比小得多的病变在感染前6周(图2(一个))。CYP27B1KO老鼠解决他们的感染以相似的速度WT老鼠和两组被感染后一周11完全愈合。寄生虫量化的耳朵感染组老鼠证明CYP27B1KO和WT老鼠拥有类似的寄生虫感染(图中负担2 (b))。

3.3。VDR消融不影响l .主要感染BALB / c小鼠

C57BL / 6小鼠完全愈合后的倾向利什曼虫感染,而BALB / c小鼠无法治愈或解决l .主要引起病变。与C57BL / 6小鼠VDRKO, VDRKO在易感BALB / c小鼠背景没有出现较小的病变与WT同行相比(图3)。

3.4。VDRKO老鼠表现出减少感染部位的炎症

调查的原因减少损伤和寄生虫C57BL / 6小鼠VDRKO负担,我们对病变进行了进一步的分析和免疫反应l .主要感染。VDRKO小鼠出现脱发、皮肤囊肿发展和不回收正常表皮层(21,22]。评估如果这些皮肤差异参与微分病变发展,我们进行了组织学研究探索损伤架构。未感染C57BL / 6 VDRKO和WT小鼠没有任何差异,他们的皮肤结构和显示没有特征表明炎症(图4)。在感染后4周,VDRKO和WT的老鼠表现出类似水平的炎症感染的网站。虽然浸润细胞的数量相似的两个老鼠感染菌株通过8周(数据未显示),VDRKO老鼠似乎显示减少炎症感染(图8周后4)。炎症继续减少两组的老鼠,在感染后12周病变从VDRKO老鼠表现出小炎症的迹象。炎症还观察到在WT小鼠感染后12周虽然大大减少。

WT之间没有明显差异,VDRKO小鼠的巨噬细胞(CD11b + / F480 +),中性粒细胞(Ly-6C / G + / F480 -), T细胞(CD4 +和CD8 +),或树突细胞(CD11c +)细胞浸润(数据没有显示)。

WT老鼠产生干扰素γ和il - 10 mRNA感染网站2周后l .主要感染(图5)。此外,il - 4和il - 12 mRNA在WT升高小鼠相比VDRKO老鼠。诱导一氧化氮合酶(间接宾语)调节l .主要感染,但是未发现WT和VDRKO之间的差异。正如之前报道的(17)、WT老鼠精氨酸酶mRNA表达比VDRKO老鼠(图5)。

3.5。系统性免疫反应在VDR KO和WT老鼠

引流淋巴结的流式细胞术分析表明,辅助细胞(CD4 +)细胞毒性t细胞(CD8 +)和FoxP3 + Treg (CD4 + CD25 +)细胞升高VDRKO老鼠最多时间点相对于WT动物(增刊。图1是网上http://dx.doi.org/10.1155/2012/134645)。每一种类型的细胞数量的增加随着病变的进展,然后在治疗有所下降。没有明显的差异在其他细胞如巨噬细胞(CD11b + / F480 +),树突状细胞(CD11c +),或中性粒细胞(LY-6C / G + / F480)观察引流淋巴结中(数据没有显示)。

VDRKO淋巴结细胞显著降低大量的炎性细胞因子产生干扰素γ肿瘤坏死因子-α、gm - csf和MIP-1α在感染细胞的高度从WT老鼠(增刊。图2)。相反,更从VDRKO MCP-1由淋巴结细胞小鼠细胞相比WT老鼠。早期感染(2周)后,细胞从老鼠监管il - 4株,IL-5 IL-13、生产,减少了12个星期感染后(增刊。图2)。此外,VDRKO和WT淋巴结生成等量的il - 1β、il - 6、il - 10,咆哮,KC时间点。

总血清免疫球蛋白水平增加了两组小鼠的损伤发展进步,即使在升高小鼠医治(图6)。IgG2a / c含量严重超标检测VDRKO老鼠开始在感染后4周,仍然在感染显著升高(图6)。没有差异IgG1浓度观察VDRKO和WT老鼠之间的任何时间点(数据没有显示)。

3.6。不增加直流和白介素生产从VDRKO C57BL / 6小鼠

生产所使用的是一种强有力的机制消除抗原呈递细胞l .主要寄生虫。直流的两组老鼠不及时治疗或preincubated干扰素-组合γ和/或1,25 d3之前l .主要感染和感染后48小时内,分析了细胞培养上清液的生产水平。直流从VDRKO生成更没有与干扰素刺激γ或干扰素γ和1,25 d3(图7(一))。预培养的干扰素γ或干扰素的组合γ和1,25 d3导致更多生产比未经处理的细胞在两种细胞类型。我们没有观察到一个抑制生产的直流在治疗1、25 d3 VDRKO或WT衍生细胞。此外,没有效果的论述或1,25 d3没有生产在巨噬细胞(增刊。图3 (a))。

不管干扰素γ和/或1,25 d3治疗,IL-12p40生产VDRKO直流WT DC相比显著增加,表明VDR可能导致监管IL-12p40生产的直流(图7 (b))。

4所示。讨论

利什曼虫是专性细胞内寄生虫,被一个强大的th)主机响应。维生素D治疗可以减少不恰当的th1反应从而减少或消除自身免疫性疾病的症状6- - - - - -8,23]。通过船舶作为维生素D对这些影响,我们假设消融的VDR将使th1 / th2平衡朝着th)偏差,导致增强的阻力l .主要感染。使用小鼠模型的皮肤利什曼病,寄生虫注入耳朵真皮,我们观察到VDRKO老鼠发达明显较小的病变和更少的寄生虫感染部位的感染比WT同行的高度。这些结果与以前的研究观察到使用脚垫模型皮肤利什曼病(17]。VDRKO老鼠比WT老鼠早医治,我们预期VDRKO小鼠会表现出减少寄生负载与WT老鼠相比,因为VDRKO老鼠比WT老鼠更快地解决他们的病变。然而,在感染后12周,VDRKO小鼠水平升高感染寄生虫的网站即使他们减少损伤的大小。这种差异可能表明不同的过程是导致伤口愈合和寄生虫杀死。VDRKO老鼠的能力生产真皮口供的增加胶原蛋白可能导致我们观察到的治疗增加表型VDRKO小鼠,研究表明,有序胶原纤维沉积在皮肤治疗可能有助于增加的一个因素l .主要受感染的老鼠(20.]。

成功清关l .主要感染取决于启动一个健壮的th1反应导致寄生虫通过生产没有杀害。VDRKO老鼠产生炎性细胞因子的含量明显低于本地感染部位和后引发刺激体外表明VDRKO老鼠th1反应生成减少l .主要感染。我们将检测调节转录的伊诺VDRKO老鼠的这种酶会导致生产没有必要杀死l .主要;然而,伊诺不是调节在任何时候l .主要感染VDRKO相比WT老鼠。相反,精氨酸酶转录水平高WT VDRKO老鼠相比,支持他人建议upregulation精氨酸酶的对抗没有的代谢与伊诺争夺共同的衬底,精氨酸(17]。缺乏这样的竞争将使VDRKO比WT老鼠,老鼠产生更多不导致增加寄生虫杀死。这个假说是进一步支持的研究证明N-hydroxy-L-arginine精氨酸酶的抑制,没有前兆,导致增加巨噬细胞的死亡l .主要寄生虫在体外,而诱导精氨酸酶导致的增长l .主要通过提供复制所需的寄生虫与多胺(24,25]。

Toll样受体激活启动upregulation VDR和CYP27B1导致抗菌肽反应的反对分枝杆菌(10,26),导致杀害结核分枝杆菌在人类巨噬细胞(27]。这个途径不太可能在抵抗中发挥作用l .主要在杀害抗菌肽有什么影响利什曼虫(28,29日]。VDR表达式,使用干扰素进行治疗γ和/或维生素D不影响巨噬细胞和直流吞噬的能力l .主要(数据没有显示,17])。此外,1,25 d3对干扰素治疗就没有影响γ全身被感染的巨噬细胞和DC在体外没有生产。这与其他发表的数据显示,没有生产l .主要被感染的巨噬细胞抑制了1,25 d3 (17]。这些作者表明,增强生产的精氨酸酶与伊诺竞争常见的基质,最终导致生产下降的巨噬细胞。与干扰素刺激VDRKO巨噬细胞γ没有和有限合伙人导致显著低于同样的待遇WT巨噬细胞(数据未显示)表明VDR可能发挥作用在调制在巨噬细胞的生产。相反,干扰素γ全身没有生产感染VDRKO DC明显高于WT直流暗示VDR消融没有生产增加而不是减少。我们的数据表明,维生素D和VDR在巨噬细胞和特区不同调节生产。

除了制造出不,VDRKO直流过度生产IL-12p40 WT。其他研究表明1相比,25 d3抑制干扰素γ信号在两种T细胞,巨噬细胞和直流17,30.- - - - - -33]。间接抑制直流产生没有然后通过船舶可能会抑制干扰素γSTAT1信号激活。VDR结果的消融在消除抑制导致upregulation IL-12p40生产。类似增加IL-12p40 VDRKO生产并没有观察到巨噬细胞这意味着巨噬细胞不同于直流干扰素γ诱导IL-12p40的生产。

VDRKO老鼠产生更多的抗体抗原特异性IgG2a / c,作为th)有偏见的免疫反应的指标(34,35比WT老鼠)。高架IgG2a / c生产VDRKO老鼠并不奇怪,治疗1、25 d3抑制小鼠IgG2a生产(36),在牛37),在猪(38]。这些数据表明,消除抑制的影响1、25 d3倾斜向IgG2a / c生产抗体反应。更高水平的IgG2a / c可能解释增加抗继发感染l .主要VDRKO老鼠(图中观察到1 (b))。事实上,高架抗原特异性和非特异性诱导IgG2a / c一直在观察老VDRKO老鼠感染单核细胞增多性李斯特氏菌(39]。然而,确切的生产IgG2a / c和维生素D信号之间的关系仍有待阐明。

我们证明基因切除VDR或损耗的维生素D的饮食(数据未显示)在BALB / c小鼠背景不会改变易感性l .主要感染。易感性WT BALB / c小鼠是由于他们无法挂载th1反应对抗感染。我们的研究结果表明,船舶的影响可能取决于宿主的免疫反应的本质。其他机制,如伤口愈合和遗传背景,也被证明是重要的阻力l .主要感染(20.,40]。我们的数据清楚地表明,缺乏维生素D的磁化率特征信号无法克服BALB / c小鼠。

相反结果中观察到VDRKO或CYP27B1KO老鼠,饮食缺乏维生素D的耐C57BL / 6小鼠没有减少的严重程度l .主要病变(数据没有显示)。类似的差距一直在观察研究调查VDR删除的角色与膳食维生素D缺乏在糖尿病的发展23,41]和[女士8,42]。我们的数据可能表明一些VDR的过程的影响l .主要感染是配体独立,已被证明在脱发的情况下(43),或者足够的1,25 d3坚持老鼠缺乏饮食保持激活受体。

总之,我们已经表明,VDRKO在C57BL / 6小鼠背景病变发展小于WT小鼠感染l .主要,但这种表型不是观察BALB / c基因背景。酶的消耗1,25 d3也增强了抵抗l .主要C57BL / 6小鼠感染。数据进一步表明IL-12p40和没有生产增加了VDRKO树突细胞可能导致增加阻力l .主要。这些研究表明,消融的VDR或消除其配体,1、25 d3,能够增加阻力l .主要感染,但只有在主机是th)免疫反应的倾向。我们的数据证实维生素D调节免疫反应的一个重要作用,取决于th1细胞。

确认

作者感谢Freimann圣母大学的生命科学中心优秀的动物保健。这项工作是由国家卫生研究院的基金支持的部分没有。R01AI056242 (m·a·麦克道尔)和美国心脏协会。0435333 z (m·a·麦克道尔)。

补充材料