一个ELISA检测血清抗体的唾腺毒素Ixodes holocyclus诺伊曼在狗和啮齿动物

文摘

的Ixodes holocyclus蜱虫会导致瘫痪每年多达10000的同伴和家养动物在澳大利亚。治疗需要的商业蜱虫的寄生虫和政府从超免疫制备抗血清的狗。每一批的最初检测血清toxin-neutralising效力的鼠标生物测定是昂贵的,耗时的,主观的。目标是发展迅速在体外分析取代生物测定中,我们使用一个部分纯化抗原准备即holocyclus唾液腺开发ELISA检测toxin-reactive狗超免疫血清的抗体。优化ELISA可靠地检测到抗体活性即holocyclus唾腺抗原。并行测试负控制抗原的血清准备的唾液腺无毒扇头蜱属(牛蜱属)microplus提供了进一步的证据,我们检测toxin-specific抗体测定。使用ELISA,我们也可以检测抗体诱导在老鼠实验侵扰即holocyclus。这个分析显示承诺作为替代的方法评估批狗超免疫血清的效价和屏幕toxin-reactive单克隆抗体生产从接种啮齿动物。

1。介绍

Ixodid或硬蜱虫导致大多数toxicoses [1),影响世界各地的人类和动物(2,3]。最严重的中毒导致被感染主机的瘫痪。在全球范围内,不到70种蜱虫被描述为能够诱导瘫痪(2),最重要的是Ixodes holocyclus在澳大利亚,安氏革蜱,d .摘要和Argas(Persicargas)辐状在北美,即rubicundus在南非,扇头蜱属evertsi evertsi和一个。(P。)walkerae在埃塞俄比亚,一个。(P。)辐状在北美的新北区4]。

在澳大利亚,即holocyclus可能会导致瘫痪的家养动物和家畜(5),影响10000同伴动物和100000牲畜每年(6]。它被认为是剧毒一个女性能够杀死一只狗(1)或羊7]。

即holocyclus发现沿澳大利亚东海岸,是最丰富的从早春到夏末。麻痹被传播的一种神经毒素诱导宿主唾液的女性即holocyclus当蜱虫血。在喂养,唾液腺中毒性增加,峰值充血(4 - 5天后8]。

主机瘫痪的治疗需要去除的寄生虫和管理商业蜱虫anti-serum(助教)准备从超免疫狗9]。标准化的toxin-neutralising活动每一批助教,传统上用鼠标生物测定。然而,生物测定是昂贵的,耗费时间,和主观,依靠观察新生儿麻痹症状的小鼠在24小时内(10]。开发一个合适的在体外免疫分析法量化toxin-specific抗体在商业助教可以取代在活的有机体内测试。

一个在体外试验也可以方便及时的诊断和治疗选择。知识的免疫状态治疗之前和之后的狗蜱瘫痪将有助于评估最小,有效剂量的助教,避免可能的不良反应,使治疗更便宜。

在本文中,我们描述了开发的酶联免疫吸附试验(ELISA)测定对蜱唾液腺抗原的血清抗体水平的狗和啮齿动物在自然或实验室蜱虫感染。

2。材料和方法

2.1。准备从蜱唾液腺抗原

十个成人得不到支持的女性即holocyclus被允许以10 - 11-week-old女性Wistar鼠方法后石等。11]。5天之后,塞得满满的蜱虫用镊子,很仔细,唾液腺切除并存储在−80°C。Ixodes holocyclus唾液腺处理方法后石等。10]。一百冻唾腺对单一化(Dounce 7毫升)与3毫升无菌PBS和匀浆澄清1500 g 30分钟在4°C。颗粒被三次为0.5毫升PBS和离心机。池上层清液是用进一步破坏剩余的颗粒物Soniprep 150 MSE超声发生器使用30秒脉冲之后2分钟冷却在冰上总共10分钟。用的匀浆颗粒状在109000克1小时在4°C,以及由此产生的上层清液储存在整除−80°C。蛋白质浓度与BCA蛋白质抗原准备估计按协议分析工具。所有批次的即holocyclus毒素在新生儿鼠标测试生物测定,以确定瘫痪活动水平(10]。

2.2。准备控制从牛蜱虫抗原扇头蜱属(牛蜱属)microplus

从牛蜱唾液腺抗原,Rh。(B。)microplus,5天喂牛,准备以同样的方式和用作nontoxin控制在所有化验。这些提取生物测定中还测试了,没有观察到新生儿老鼠瘫痪的迹象。

2.3。狗血清样本

标准化参考血清由池几个批次的商用助教准备从十超免疫(HI)狗和确认toxin-neutralising活动鼠标生物测定。十个不反应的狗血清得到来自澳大利亚西部珀斯的一个领域即holocyclus不自然地发生。血清也从狗,在获得男子气概的道路兽医医院,布里斯班,对蜱瘫痪的治疗。样本收集的时候承认,在治疗之前,再一次大约16天之后。

2.4。酶联免疫吸附试验(ELISA)

一种间接ELISA格式是用于分析血清。各种参数被实证试验系统的优化。基本协议如下:蜱唾液腺抗原在涂料稀释缓冲碳酸(0.05米/ bi-carbonate pH值9.6)和50μL添加到井ELISA板(猎鹰灵活,96口井,U,正欲)一夜之间在4°C。洗后(磷酸盐含0.05%渐变20)板两次去除游离抗原,100μL阻断缓冲区(0.05米三,0.001 M EDTA, 0.15 M氯化钠,0.2% w / v酪蛋白,0.05% 20 v / v渐变,pH值8.0)是应用于所有井一小时37°C。删除后阻断缓冲区,50μL的狗血清稀释阻断缓冲区添加每1 h在37°C。4洗后,兔子antidog免疫球蛋白结合辣根过氧化物酶(整个分子,HRPO,σ)稀释在阻止缓冲区,添加(50μL /),并允许绑定到被狗免疫球蛋白进一步小时37°C。额外的6洗后,绑定共轭与100年发现的μL (abt衬底(2%的σ-Azino-bis (3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic酸)联胺盐;2%的1.26% H₂O₂在底物缓冲:2.8% Na₂HPO₄和2.1%的柠檬酸,pH值4.2)。在37°C, 1小时反应后的光谱吸光度测量在一个自动化板读者(MULTISKAN)波长405纳米。

2.5。优化的ELISA检测Toxin-Reactive鼠血清抗体

改良ELISA用于测试血清实验老鼠出没即holocyclus蜱虫。从大鼠血清收集之前和在不同时期在蜱虫喂养的动物为5天。预处理和蜱虫感染后血清ELISA被测试。在缺乏大鼠血清已知蜱虫毒素活性,狗血清采用优化协议,除了,辣根peroxidase-conjugated antirat免疫球蛋白稀释1:1000年是用于第二抗体的一步。

3所示。结果

3.1。ELISA参数的优化

初步分析嗨的狗血清显示,高水平的非特异性结合的塑料在井ELISA板发生在稀释低于1/50(结果未显示)。因此,所有狗血清随后被稀释的1/50或更大的考验。

确定的最佳稀释即holocyclus唾腺抗原,汇集你好狗血清和抗原在棋盘滴定格式。血清稀释1/50-1/200证明最大的绑定Ixodes抗原6.25μ与光学密度g / mL在1.5和2.3之间(图1(一))。微不足道的绑定每个稀释的负面观察控制狗血清抗原浓度检查。因此,6.25μg / mL被选为所有后续检测抗原的浓度。

嗨和消极的狗血清也对类似的唾腺抗原浓度化验准备从牛蜱虫,Rh。(B。)microplus(图1 (b))。所有血清稀释显示显著降低或微不足道的绑定类似的浓度相比,这种抗原的抗原准备Ixodes唾液腺表明大部分ELISA-reactive抗体血清是特定的Ixodes抗原。观察一些大的最低稀释(1/50和1/100)嗨,狗(ODs在0.5和1.0之间)Rh。(B。)microplus抗原的两个抗原浓度最高(3.12和6.25μg / mL)一致认可的唾腺共同抗原即holocyclus和Rh。(B。)microplus。总之,这些结果说明部分纯化蜱唾液腺抗原含有即holocyclus毒素是专门被狗超免疫血清中抗体ELISA。

确定抗原adsorbtion可以改善涂料的各种组合的缓冲区,孵化温度、和时间,即holocyclus或Rh。(B。)microplus抗原被稀释在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲(pH值9.6)或PBS (pH值7.2)和孵化ELISA板井在4°C隔夜或37°C 3 h。ELISA板测试时对你好和消极的狗血清滴定阻断缓冲区,1/50的抗原吸附在涂层缓冲37°C导致更高的约束力嗨和负控制血清抗体即holocyclus和Rh。(B。)microplus抗原与吸附在4°C(结果未显示)。最好的微分之间的绑定嗨和消极的血清即holocyclus抗原和血清对你好即holocyclus和Rh。(B。)microplus抗原是通过吸附抗原在碳酸盐岩层缓冲区4°C(结果未显示)。

3.2。建立一个截止OD值区分正面和负面反应狗血清

十嗨和十小组在1/50测试阴性血清ELISA使用上面描述的最优条件。这项研究的结果发表在一盒须图(图2),说明数据的传播。数据集被分成四个相等的部分,四分位数,分别代表25%的数据。下四分位数(q1)包含最低25%的反应堆和上四分位数(q3)最高25%的反应堆。中位数是中间值低于和高于50%的数据。最小(最小值)的最低价值,和最大(max)是最高价值的数据集。

截止值-血清测试Ixodes抗原是计算平均10 -血清(0.525)+标准差的两倍。

3.3。分析狗自然感染的血清即holocyclus和痛苦蜱瘫痪

八只狗(H)给了男子汉的道路兽医医院蜱瘫痪的迹象。0天(在演讲和治疗前)只能从狗血清C, D和H反应强烈Ixodes抗原ELISA检测时(表1)。只狗的第0天血清C显示反应更少扇头蜱属抗原,而相应的样本的狗D和H与抗原反应类似。抗体水平Ixodes抗原的其他五个狗跌破截断值决定。检测血清样本从16天(助教)显示抗体水平的急剧增加Ixodes在狗C和H抗原,而类似的抗体水平的增加扇头蜱属抗原也观察到狗狗c .抗体的血清G没有反应Ixodes抗原天入院,但增长略高于截止阀值16天,治疗后与助教。抗体水平与其他狗不超过0天的水平。这些结果列于表1。

3.4。优化的ELISA检测免疫鼠血清

从七大鼠血清和蜱虫感染后21天前拍的测试在一个修改ELISA检测大鼠免疫球蛋白蜱虫毒素。所有样品测试Ixodes抗原的ELISA显示略有增加抗体水平postinfestation preinfestation相比血清样品,尽管OD水平仍远低于值与嗨狗血清。ODs为扇头蜱属抗原在三只老鼠没有增加,而在剩下的四个老鼠只有少量增加(见表2)。这些初步数据表明,我们可以发现,虽然弱,toxin-associated抗原抗体在单个与多个蜱虫感染后大鼠血清。

进一步分析后大鼠的血清转化顺序的侵扰,与多个蜱虫也。从这个动物血清收集后两轮的侵扰,表现出强烈的超过248天,具体的反应Ixodes抗原当相比,ELISA检测血清感染之前(见图3)。

总的来说,这些结果表明,可以使用ELISA检测血清抗体特定Ixodes单个或多个接触抗原,诱导即holocyclus蜱虫。

4所示。讨论

部分纯化的抗原制备唾液腺的女性即holocyclus蜱虫是评估ELISA测定作为诊断试剂的蜱虫toxin-specific狗血清抗体。这些分析的结果表明,血清你好狗反应强烈Ixodes抗原,相比可以忽略不计的血清反应狗不暴露即holocyclus蜱虫。此外,一个控制抗原牛蜱唾液腺的准备Rh。(B。)microplus不会产生麻痹毒素,显示相对较弱的反应都嗨(正面)和控制(负面)血清。一些狗血清抗原的反应Rh。(B。)microplus看到常见抗原的ELISA是预期在蜱唾液腺的物种。事实上,氨基酸序列之间Ixodes和扇头蜱属(牛蜱属)渐渐表现出高度的同源性,> 85%12]表明抗原关系密切。这些数据表明,ELISA检测到特定于toxin-associated抗原的抗体在体外分析商业准备助教可能是一个可行的替代昂贵的和主观的鼠标生物测定。

以前,澳大利亚农药和兽医药物(APVMA)宣布,一个权威在体外免疫测定来评估商业助教只会批准如果使用一个高度特异性抗原(b .石头,珀耳斯通讯)。事实上,莫里森(未发表的数据)13]部分纯化抗原提取使用即holocyclus唾液腺ELISA和声称与生物测定的良好相关性。然而,在缺乏控制抗原(类似的提取物无毒蜱虫),作者不能证明toxinspecific反应抗原。

形成鲜明对比的强烈反应嗨狗血清ELISA,明显缺乏在血清抗体反应观察狗自然上爬满了虱子和呈现瘫痪在布里斯班兽医诊所迹象。这些血清进行ELISA评估toxin-specific抗体水平开始的迹象,大约16天之后。根据ELISA OD数据,三,八狗显示显著的蜱虫毒素抗原抗体在演讲的时候,但只有两个七表现出显著升高antitick抗体16天后。第四个血清是负面的Ixodes抗原表达但有治疗后略高于阈值水平。在没有额外的信息的一般健康状况狗之前和之后的治疗,包括体重、品种、性别、年龄、以前的蜱虫接触史,和使用的剂量和批助教,解释数据是有限的。然而,根据观察,至少一半(4/7)的动物没有显示出增加的血清抗体水平Ixodes抗原与助教治疗之后,我们可以得出这样的结论:增加这种抗原ELISA反应中发现一些动物更有可能由于蜱虫感染免疫反应而不是通过助教抗体的被动转移治疗。

基于低toxin-specific抗原的血清转化狗自然接触即holocyclus与助教,即使治疗,它是不可能的,临床医生的分析将是一个有用的工具来监控动物的免疫状态或治疗的疗效。这是符合发现石头和赖特(14)观察缓慢而罕见的中和抗体反应(以鼠标生物测定)狗超过14周的重复蜱虫感染对超免疫在启动阶段。缺乏免疫反应可能是由于宿主免疫力之间的均衡实现的蜱虫和蜱虫的抑制宿主的免疫系统。喂养蜱虫调节宿主的止血,炎症和免疫(15使不间断充血。这是支持的事实即holocyclus蜱虫并不是拒绝了(没有减肥)和狗显示皮肤过敏症,尽管很少重复曝光(16]。

总之,我们成立了ELISA之间分化强烈嗨从狗狗血清和血清,没有被感染即holocyclus蜱虫。自Ixodes唾腺抗原只有部分纯化,ELISA是支持并行测试的特异性抗原的血清准备以同样的方式从无毒扇头蜱属蜱虫。嗨,不反应的血清大幅弱的约束扇头蜱属抗原,这表明嗨血清的反应Ixodes抗原是特定的。从狗血清实验或自然与数量有限的蜱虫出没,然而,只产生微弱的反应Ixodes抗原的ELISA,表明抗体水平为低频蜱虫没有检测到的侵扰,在这个试验。

在缺乏高纯度毒素抗原,分析可能的特异性增强通过蜱虫toxin-reactive单克隆抗体捕捉toxin-specific抗原固相的一种改良ELISA格式。为此,上述ELISA检测抗体的成功改编老鼠接触蜱虫感染。的确,强大的抗体反应的检测大鼠两接触蜱虫后表明,该动物模型将用于生产杂种细胞即holocyclus毒素抗原的ELISA筛选结果单克隆抗体的有效手段。

确认

这项工作是支持的资金从梅里亚澳大利亚和澳大利亚研究理事会。Blood-fed扇头蜱属蜱虫被博士请提供c .零售的蜱传热单元,QDPI Wacol。消极的狗血清罗素博士的礼物霍布斯,健康科学分工,兽医和生物医学科学学院,默多克大学。你好狗血清样本的礼物博士后期伯尼石头。血清与瘫痪后自然蜱虫狗接触被男子气概的道路提供的兽医医院。

引用

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