真菌培养滤液防治成虫的研究这种致倦库蚊(双翅目:库蚊科)丝虫病的媒介

摘要

昆虫病原真菌在控制蚊虫数量方面具有重要的潜力。培养滤液尖孢镰刀菌，巨大Lagenidium giganteum，胶状毛癣菌，和Culicinomyces clavisporus对残雪。quinquefasciatus．培养滤液通过Whatman-1滤纸过滤得到。这些培养滤液c . clavisporus发现LC₅₀-2.5、信用证₉₀-7.24,信用证₉₉-8.7 ML。然而，培养滤液混合时，比例为1:1:1尖孢镰刀菌，巨大镰孢菌，凝胶状毛癣菌死亡率显著增加。LC₅₀-3.71、信用证₉₀-8.12,信用证₉₉-11.48在暴露10小时后显著。同样，培养滤液凝胶T.，棒状库霉菌，和l .位置以1:1:1的比例组合。同样的信用证₅₀-1.94、信用证₉₀4、信用证₉₉-6.16 ML。目前的研究结果表明，有希望使用选定的真菌代谢物来控制残雪。quinquefasciatus在实验室里。

1.介绍

真菌昆虫病原有潜力作为防治蚊虫的替代生物药剂，并用作目前开发的快速化学杀虫剂[1］．以蚊幼虫为目标的病原真菌有壶菌Coelomomyces［2，3.］．只有少数研究评估了这些病原体对热带病媒介的成人阶段的影响。在成年人中Ochlerotatus sierrensis被后菌类感染的Tolypocladium cylindrosporum， 10天后死亡率为100% [4］．Scholte等[5也报道了成年人一个．冈比亚按蚊是容易B．单独使用，镰刀菌素spp。,绿僵菌属anisopliae．

目前已筛选出350种真菌和94种放线菌的胞外次级代谢物具有杀幼虫活性残雪．quinquefasciatus，一个．stephensi,和Ae．蚊［6］．的代谢产物Chrysosporium tropicum已被发现是高致病性的成虫一个。stephensi，残雪．quinquefasciatus,和Ae．蚊［7］．因此，真菌在蚊虫病媒控制方面具有很大潜力[8］．最近，Paula等人[9的综合效应m . anisopliae杀虫剂吡虫啉增加了真菌对登革热病媒的毒力Ae。蚊，而在受管制的实验室条件下，使用昆虫病原真菌对付蚊子的结果令人鼓舞[10，11]和在实地[12］．

丝虫病是一个全球性的公共卫生问题。目前有1.2亿人受到感染，约有13亿人面临感染风险[13，14］．然而，据估计，日本脑炎在印度135个地区流行[15］．因此，真菌代谢产物的开发将为减少真菌种群提供新的选择残雪．quinquefasciatus作为这些疾病的传播媒介本研究的目的是评价真菌培养滤液的致死活性病圃，l .位置，t . ajelloi和c . clavisporus单独和结合上成人残雪．quinquefasciatus。

2.材料和方法

2．1．真菌菌株

的尖孢镰刀菌(mtcc - 2485),Lagenidium位置(mtcc - 719),毛癣菌属ajelloi(mtcc - 4878)Culicinomyces clavisporus(MTCC-987)来自印度昌迪加尔市微生物技术研究所的微生物类型培养和基因库(MTCC)。

2．2.肉汤和培养物的准备

2.2.1。尖孢镰刀菌(Schlecht Endahl)和毛癣菌属ajelloi(Ajelloi)

采用Gardner and Pillai方法制备了Subouraud葡萄糖肉汤(SDB) [16］．4个250 mL锥形瓶，每个瓶含有100 mL Suboraud葡萄糖肉汤(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，去离子水1000 mL)，在20 psi下高压灭菌20分钟。在肉汤中加入50μg/mL氯霉素作为抑菌剂。F．孢菌用接种针将在Suboraud葡萄糖琼脂平板上生长的菌落转移到每个烧瓶上。在锥形瓶中接种F．孢菌24±2°C孵育15天(图1(一)和1 (b))．

2．2．2．Lagenidium位置(沙发)

5个250 mL的锥形瓶，每个瓶含有100 mL PYG(蛋白胨1.25 g，酵母提取物1.25 g，葡萄糖3.0 g，去离子水1.0 L)，在20 psi下进行高压灭菌20分钟。肉汤后来被补充了50μg/mL氯霉素作为抑菌剂。的殖民地l .位置用接种针将在PYGA平板上生长的细菌转移到每个烧瓶上。锥形瓶，接种l .位置，在25°C孵育15天(图1 (c))．

2.2.3。Culicinomyces clavisporus(库奇、罗姆尼和拉奥)

准备EmYPss培养基培养c . clavisporus．5个250 mL锥形瓶，每个瓶含有100 mL EmYPss(酵母提取物4 g，可溶性淀粉15 g，磷酸氢二钾1 g，硫酸镁0.5，去离子水1 L)，在20 psi下高压灭菌20分钟。肉汤补充50μg/mL氯霉素作为抑菌剂。的殖民地c . clavisporus在EmYPss(酵母膏2 g，可溶性淀粉7.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，琼脂10 g，蒸馏水500 mL)固体培养基板上培养，用接种针移入每个烧瓶。锥形的烧瓶，接种c . clavisporus在25°C孵育10天(图1 (d))．

2．3.细胞外代谢产物的过滤和生物测定

细胞外代谢产物通过Whatman-1滤纸过滤肉汤获得。根据世界卫生组织的标准方法和规程，对这些代谢物进行生物分析[17］．共50只2 - 5日龄的含糖母鼠残雪．quinquefasciatus在每种浓度下暴露24小时。将选定浓度的代谢物喷洒于笼子(长25 cm ×宽15 cm ×深5 cm)中。每次接触都是在成年人中分批进行的。同样地，对照组使用去离子水来测试自然死亡率。每项生物测定包括对照，在不同的天数内进行3个重复。

2．4．统计分析

采用probit回归分析剂量与死亡率的关系[18］．LC₅₀,信用证_90年,和信用证₉₉以95%的基准限度计算值。如果对照组的死亡率高于5%，则使用雅培公式对处理样本的结果进行校正[19]： 在哪里治疗样本中死亡率的百分比对照组的死亡率百分比。

3.结果与讨论

真菌及其产品毒性强，有望替代化学方法控制蚊子幼虫和成虫[12］．第一份报告米．anisopliaeIP在成人中的致病性一个．冈比亚按蚊和一个．arabiensis有可能成为非洲疟疾病媒物种的生物控制剂[11］．在坦桑尼亚一个农村进行的实地研究结果显示，野生蚊子已被感染，在停留在3米后寿命缩短²米．anisopliae悬挂在传统房屋天花板上的浸渍黑色棉片[12］．

然而，目前的研究表明，真菌代谢物直接喷洒在种群上残雪．quinquefasciatus．的代谢产物F．孢菌和T．ajelloi被发现在高浓度下有效(LC₉₉-52.48和信用证₉₉-66.06 mL)。然而，代谢物l．位置和C．clavisporus在较低浓度(LC₉₉-11.3和信用证₉₉-8.7 mL)1,图2)．一种新的方法，K条包衣，作为真菌孢子悬浮液应用于纸基，并发现准确有效孢子浓度的包衣层对成蚊有效[20.］．可加强生物杀虫剂和杀虫剂处理过的蚊帐的组合，以控制疟疾[21］．Paula等人[9首次报道了一种杀虫剂和昆虫病原真菌的组合已被测试Ae．蚊．这项研究显示了IMI作为目前使用的拟除虫菊酯类成虫杀虫剂的替代品的潜力。这项研究强烈建议Ae．蚊可通过表面施用真菌来控制，并可通过与超低浓度杀虫剂联合施用来提高真菌的效率，在短时间内造成较高的死亡率。

在本研究中，应促进联合代谢物的作用，以控制残雪．quinquefasciatus．的代谢产物F．孢菌，l．位置,和T．ajelloi以1:1的比例混合;死亡率在短时间内显著增加。LC₉₉暴露10小时后，有11.48例。此外，代谢产物T．ajelloi，C．clavisporus,和l．位置比例为1:1:1;死亡率在10小时内大幅上升(见表)1,图3.)．我们目前对成蚊控制工作的了解集中在现有的产品和程序，以减少死亡率和发病率。然而，真菌代谢物可以实现蚊虫控制。因此，目前的研究结果正在加速专门针对丝虫病媒介的新一代工具和知识的开发。这种结合不同真菌代谢产物的新策略可能是控制某些蚊种的重要途径。此外，还成功地研究了复方杀虫剂和昆虫病原真菌对疟蚊的防治效果。最近，Paula等人[9]研究了一种杀虫剂与一种昆虫病原真菌联合使用的可能性，通过这两种药剂的联合作用降低了媒介能力。Mnyone等[22研究发现，真菌感染降低了蚊子的存活率，而不管它们的年龄和吸血状态如何。的配方米．anisopliae和B．单独使用可以同样影响不同年龄级的蚊子，它们在非吸血时相对更容易受到真菌感染。

的应用F．pallidoroseum对库蚊品种可减轻热带国家丝虫病和日本脑炎的负担[23］．真菌的功效一直被发现依赖于用于感染蚊子的分生孢子浓度。目前的方法控制成蚊的能力有限。昆虫病原真菌本身就是活的有机体;重要的是要测试它们是否能在温度和湿度波动的野外条件下存活和有效[24］．在实验室研究的培养滤液l．位置和Culicinomyces clavisporus显著发现对一个．stephensi，残雪．quinquefasciatus,和Ae．蚊［25，26］．本研究结果清楚地表明，结合真菌代谢物比单独使用这些控制药物对蚊子的生存产生更高的影响。记录的功效显示了综合真菌防治措施的潜力，以显著减少丝虫病媒介。

病原真菌产生各种各样的有毒代谢物，从次级代谢的低分子量产物到复杂的环状肽和蛋白水解酶[27］．在了解与宿主表皮渗透和杀蚊毒素作用有关的酶方面取得了重大进展。通过多种毒素和酶的共同作用，真菌代谢物的结合更加有效。

致谢

作者感谢达亚尔巴格教育研究所所长V. G. Das教授的鼓励。他们亦感谢印度大学教育资助委员会(UGC New Delhi of Major Research Project) 2010-2012年的财政支持，以及DST-FIST计划(2003-2008)提供的实验室设施。辛格(G. Singh)感谢印度大学教育委员会(UGC)颁发博士后奖学金(2009-2011)。

参考文献

1. R. H. Ffrench-Constant，“用一些旧的，转基因的，还是用真菌来控制蚊子?”生态学和进化趋势，第20卷，第2期。11，页577-579,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. M. A. Shoulkamy和C. J. Lucarotti， "病理学Coelomomyces stegomyiae在幼虫埃及伊蚊”,Mycologia，第90卷，第5期。4、1998年。视图:谷歌学术搜索
3. C. J. Lucarotti，“入侵埃及伊蚊卵巢的Coelomomyces stegomyiae”,无脊椎动物病理学杂志，第60卷，第2期2，第176-184页，1992。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. 小G. G. Soares，《丝菌类真菌感染的发病机制》，Tolypocladium cylindrosporum在伊蚊sierrensis和库蚊tarsalis[下降。:蚊科)Entomophaga第27卷第2期3，页283-300,1982。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. E. J. Scholte, W. Takken，和B. G. J. Knols，“六种东非昆虫病原真菌对成虫的致病性冈比亚疟蚊轮上。(双翅目:蚊科)蚊子实验与应用昆虫学论文集NEV，阿姆斯特丹，荷兰，2033。视图:谷歌学术搜索
6. V. Vijayan和K. Balaraman，“真菌和放线菌的代谢物对蚊子幼虫有活性，”印度医学研究杂志，第93卷，115-117页，1991。视图:谷歌学术搜索
7. P. Verma和S. Prakash，“功效Chrysosporium tropicum针对混合成蚊种群的代谢物(致倦库蚊，斯蒂芬按蚊,埃及伊蚊)经快速色谱纯化后，寄生虫学研究，第107卷，第2期1，页163-166,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. E. J. Scholte, B. G. Knols, R. a . Samson，和W. Takken，“昆虫病原真菌控制蚊子:综述”，昆虫科学杂志， 2004年第4卷第19页。视图:谷歌学术搜索
9. A. R. Paula, A. T. Carolino, C. O. Paula，和R. I. Samuels，“昆虫病原真菌的组合绿僵菌属anisopliae使用杀虫剂吡虫啉可增加对登革热病媒的毒力埃及伊蚊(双翅目蚊科)。”寄生虫和向量，第4卷，第4期。1, p. 8, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. S. Blanford, B. H. K. Chan, N. Jenkins等人，“真菌病原体降低了疟疾传播的可能性，”科学，第308卷，第2期第2页，第2 - 3页，2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. L. L. Mnyone, T. L. Russell, I. N. Lyimo, D. W. Lwetoijera, M. J. Kirby, and C. Luz， "第一次报告绿僵菌属anisopliaeip46在成人中的致病性冈比亚疟蚊轮上。和一个。arabiensis(双翅目;蚊科),“寄生虫和向量，第2卷，第2期1，第59页，2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. E. J. Scholte, K. Ng'Habi, J. Kihonda等人，“一种用于控制非洲疟疾成虫的昆虫病原真菌”，科学，第308卷，第2期第2页，第2 - 3页，2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. 世界卫生组织，" 2008-2015年防治被忽视热带病全球计划"，WHO/CDS/NTD/40, 2007年。视图:谷歌学术搜索
14. 世界卫生组织"每周流行病学记录"谁，第84卷，第437-444页，2009。视图:谷歌学术搜索
15. 世界卫生组织，“印度的病媒传播疾病”，头脑风暴会议报告，2006年。视图:谷歌学术搜索
16. J. M.加德纳和J. S.皮莱，"Tolypocladium cylindrosporum(后真菌纲:单目)，是蚊子的一种真菌病原体伊蚊austarlis”,Mycopathologia，第97卷，第83-88页，1987。视图:谷歌学术搜索
17. 世界卫生组织，"室内滞留喷洒和蚊帐处理用杀蚊剂试验准则"，WHO/CDS/NTD/WHOPES/GCDPP/2006.3, 2006。视图:谷歌学术搜索
18. d·j·芬尼概率单位分析，英国剑桥大学出版社，第三版，1971年。
19. w·s·阿伯特，《计算杀虫剂效力的方法》，经济昆虫学杂志， 1925年，第18卷，265-267页。视图:谷歌学术搜索
20. M. Farenhorst和B. G. Knols，“用于蚊虫暴露生物测定的真菌孢子涂层标准化应用的新方法”，《疟疾杂志》上，第9卷，第5期。1, p. 27, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. P. A. Hancock，“结合真菌生物杀虫剂和经杀虫剂处理的蚊帐以加强疟疾控制”，PLoS计算生物学，第5卷，第5期。10、Article ID e1000525, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. L. L. Mnyone, M. J. Kirby, M. W. Mpingwa et al.， "感染冈比亚疟蚊携带昆虫病原真菌的蚊子:寄主年龄和吸血状况的影响寄生虫学研究，第108卷，第108号2，页317-322,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. B. G. Knols, T. Bukhari和M. Farenhorst，“昆虫病原真菌作为对付疟疾蚊子的下一代控制剂”，未来的微生物学，第5卷，第5期。3，页339-341,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. A. F. V. Howard, R. N’guessan, C. J. M. Koenraadt等人，“在野外条件下，抗杀虫剂疟疾病媒蚊子感染昆虫病原真菌的首次报告，”《疟疾杂志》上，第10卷，第24页，2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. 辛格(G. Singh)和普拉卡什(S. Prakash)的《药效》(Efficacy ofLagenidium位置(沙发)代谢物控制按蚊stephensi(里斯顿)疟疾病媒，”《疟疾杂志》上， 2010年，第9卷，增刊2，第46页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. G. Singh和S. Prakash，“文化滤液的评估Culicinomyces clavisporus: mycoadulticide致倦库蚊，埃及伊蚊和按蚊stephensi”,寄生虫学研究．在出版社。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. A. L. Demain和A. Fang，“次生代谢物的自然功能”，刊于现代生物技术史， T. Scheper, Ed.，第69卷生物化学工程及生物技术进展，第1-39页，施普林格，柏林，海德堡，德国，2000。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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