抑制的增长恶性疟原虫在文化Stearylamine-Phosphatidylcholine脂质体

文摘

我们有检查的影响stearylamine (SA)在脂质体的可行性恶性疟原虫在文化研究整合的抑制(³H]次黄嘌呤核酸的寄生虫。Stearylamine脂质体显著抑制寄生虫的生长取决于磷脂成分。观察最大抑制SA时通过大豆磷脂酰胆碱(SPC)脂质体。SA的烷基链长度和密度脂质体扮演了一个重要的角色在抑制寄生虫的生长。将胆固醇或Distearylphosphatidylethanolamine−Methoxy-Polyethylene乙二醇- 2000 (dspe - mpeg - 2000)大豆phosphatidylcholine-stearylamine (SPC-SA)脂质体提高了疗效。Intraerythrocytic完整SPC-SA脂质体进入感染红细胞是可视化使用荧光显微镜。没有观察到未感染的红细胞溶血,轻微的溶血是指出在高浓度的SPC-SA感染红细胞脂质体。总的来说,我们的数据表明SA在疟疾化疗SPC-liposomes可能有潜在的应用。

1。介绍

原生动物寄生虫感染疟疾,被认为是最常见的寄生虫病之一,困扰的亚热带国家1]。喹啉的抗疟药氯喹等(CQ),甲氟喹合成,和伯氨喹直到最近,证明是最有效的疟疾药物化疗,因为他们迅速开始行动,最重要的是,他们的成本效益,鼓励他们的广泛使用2]。CQ-resistant寄生虫的出现,已经由几个调查人员试图通过脂质体交付氯喹治疗疟疾仍然(3- - - - - -6]。重点也转向开发新颖的化学疗法或新模式的抗疟药克服耐药机制的寄生虫7]。戏剧性的功能和结构特征的变化受感染的红细胞(红血球)观察疟原虫感染和成熟。脂质和蛋白质的变化composition-resulting在膜结构和功能障碍,最终导致膜流动性(8]。“新透水通路”的形成(npp)允许的低分子量以及红细胞表面纳米尺度的分子选择性寄生(9,10]。

它已经被许多调查人员,之前报道stearylamine组成的脂质体(SA)和磷脂酰胆碱(PC)对多种病原原生动物寄生虫antiprotozoan活动鲁兹锥体(11],t . brucei gambiense(12],刚地弓形虫(13),而杜氏利什曼虫(14]。本研究的目的是评估的抗疟效果SA-intercalated PC脂质体在文化感染红细胞。不同脂质体的影响组件/成分磷脂、胆固醇的密度,密度和烷基链长SA和dspe - mpeg - 2000显著影响脂质体药物的功效,是前后一致地研究。荧光模拟的SA (octadecylrhodamine)作为标记用于SA夹层以及跟踪分子可视化的SPC-SA(大豆phosphatidylcholine-Stearylamine)脂质体到被感染的红细胞。

2。方法

2.1。化学物质

所有化学品都从西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国或GIBCO BRL盖瑟斯堡,医学博士,美国,除非另有指示。大豆磷脂酰胆碱(SPC)获得了作为礼物的口吻创新经纪有限公司Gurgoan,印度。dspe - mpeg - 2000 (Distearoyl ethanolamine-Methoxy-Polyethy-lene醇磷脂- 2000)购买从两代情极性脂质,Inc .)、雪花石膏,阿拉巴马州,美国。次黄嘌呤Monohydrochloride, (³H (G))从美国购买放射性标记的化学物质,Inc .,圣路易斯,密苏里州,美国。人类啊⁺血清是来自创新研究,Inc .,培利法院诺美国密歇根州。

荧光胺类似物,octadecylrhodamine从英杰公司购买公司,大岛,纽约,美国。股票的解决方案是由溶解的化合物在乙醇和存储在−1.25毫米20°C受光照。

2.2。在体外的文化恶性疟原虫

的压力恶性疟原虫研究中使用3 d7从国家疟疾研究所的获得,新德里,印度。这个压力是维护(修改方法的载体和詹森(15串行通道)的人类红细胞培养4%比容rpmi - 1640年媒体补充10%人类血清和孵化37°C的气氛下混合气体(包含5%的股份有限公司₂,5%的人啊₂,90% N₂)在一个塑料箱。肝素化全啊⁺从旋转血库血液收集,新德里和红细胞表面分离在无菌条件下通过离心去除血清和淡黄色的外套。寄生虫血症的水平被定期监测血涂片染色azure B型染色用5%磷酸缓冲(20毫米,pH值7.2)。对于每一个实验,样本股票文化进一步稀释培养基比容和寄生虫血症2% 1%准备添加微量滴定板。

2.3。脂质体的制备

脂质体是由hand-shak方法如前所述[16]。短暂、程控或EPC(蛋磷脂酰胆碱)单独或与SA或PA(磷脂酸)的摩尔比80:20 (40μ摩尔的总脂质)和微量octadecylrhodamine (R₁₈)(41 nmol / 40 nmol总脂质),估计SA夹层的标志,是溶解在氯仿(2 - 3毫升)在100毫升圆底烧瓶。氯仿是蒸发干燥30°C,在减压下,用旋转蒸发器。薄膜,因此形成,是干燥1 h,其次是水化1毫升磷酸缓冲盐(PBS 20毫米,pH值7.2)一夜之间在4°C。第二天,脂质体在25°C用30分钟在浴式超声发生器(布兰森1510)40 kHz,通过100海里聚碳酸酯膜挤压。脂质体SA被超速离心法分离自由SA(贝克曼库尔特超离心机,300000×g, 40分钟,4°C)。颗粒悬浮在1毫升PBS(20毫米,pH值7.2),最后透过0.22μm Millex问微孔膜。包含stearylalcohol脂质体,硬脂酸和不同链长度脂肪酸是准备使用SPC的摩尔比率:如上所述其他组件80:20。脂质体的复苏是通过测量监控磷脂使用斯图尔特的方法(17)和SA评估fluorimetrically(励磁560海里/发射590海里)。复苏的脂质体被发现与90年60 - 65% - 95% SA插入所有的脂质体配方。Stearically稳定脂质体准备如上所述通过添加各种dspe摩尔%(1 - 5摩尔%)- mpeg - 2000在脂质膜的制备。脂质体的大小是衡量使用莫尔文Zetasizer, Nano z模型,发现在90 - 110海里(图1)。荧光显微镜荧光labeled-liposomes的准备,octadecylrhodamine (R₁₈总脂质(6 nmole / 200 nmol)添加在SA-SPC脂质体悬浮液和孵化在室温下15分钟。多余的R₁₈是由超速离心法去除(300000×g, 40分钟,4°C),和获得的颗粒在20毫米resuspended PBS(最终浓度1毫克/毫升的磷脂)。

2.4。评价脂质体抗疟活性

不同脂质体配方的抗疟效果监测通过研究整合的抑制³H]次黄嘌呤核酸的寄生虫(18]。总之,脂质体制剂连续稀释,添加到恶性疟原虫感染红细胞悬液(2%最终比容和寄生虫血症1%)96孔细胞培养板。经过24小时的潜伏期在37°C, 0.2μCi (³H]次黄嘌呤是添加到每个细胞收获18 H后通过使用Skatron半自动的细胞收割机。(³H]次黄嘌呤核酸结合是用液体闪烁计数器(模型:Tri-Carb 2900 TR,珀金埃尔默),和抑制增长的计算与控制(控制由完全培养基代替测试分子。)收集所有的数据点为每个实验一式三份。的集成电路₅₀(所需的SA浓度抑制50%的增长寄生虫以整合的³H]次黄嘌呤)生成的数据是使用起源卡尔软件(版本3)。

2.5。胞内积累SA-Liposomes

SA)脂质体的交互感染的红细胞被执行时间可视化研究使用octadecylrhodamine (R₁₈)-SPC-SA脂质体。红细胞培养在2%比容和高寄生虫血症(8 - 10%)暴露在脂质体的IC的标签₅₀15、30、45、120分钟保持在37°C下混合气体的气氛如前所述。孵化,年底的脂质体被短暂旋转冲洗掉,细胞被固定的2%多聚甲醛和2.5%戊二醛2 h在4°C 0.1 PBS。用DAPI染色剂染色的寄生虫是由(1μg / mL)为30分钟37°C和随后的细胞被洗后显示在荧光显微镜(2000年尼康Eclipse TE)使用罗丹明过滤器96312 / G2EC(励磁540 - 525 nm /排放620 - 660 nm)和DAPI过滤器(励磁359海里/发射461海里)。未受感染的红细胞被控制。

2.6。溶血性的评估活动

溶血测定SPC-SA-liposome-treated集培养感染和未感染的红细胞通过测量吸光度的Hb 405海里(俗的血红蛋白(Hb))所描述的(19]。简单地说,增加的脂质体制剂添加浓度恶性疟原虫感染寄生虫血症红细胞容积(2%和1%)和未受感染的红细胞比容(2%)在96孔板为42小时37°C。孵化后,板旋转短暂和上层清液的吸光度测量在405海里。混合1%的红细胞Triton-X 100获得完整的溶血。细胞在PBS作为消极的控制。

3所示。结果

3.1。各种影响脂质体的可行性恶性疟原虫体外

不同脂质体的生存能力的影响恶性疟原虫应变(表3 d7文化测试1)。程控脂质体单独或带负电荷脂质,磷脂酸(PA),对寄生虫的可行性没有影响。然而,SPC脂质体有带正电的脂质,stearylamine (SA),显著抑制寄生虫的生长(IC₅₀= 6.87μM(图3)& 24.08μM磷脂在表1)。进一步剖析烷基的作用和氨基酸群SA plasmocidal活动,SPC脂质体含有硬脂醇或硬脂酸没有胺组准备和测试。影响spermidine-a聚胺有多个氨基酸组和烷基组还研究了。硬脂基独自硬脂醇、硬脂酸没有任何缺乏抗疟效果得出结论的活动。甚至多个氨基酸组和亚精胺对寄生虫的增长(表没有影响1)。不同烷基链长度脂肪酸和醇从十四到十八基(硬脂)没有任何抑制作用(表1)。这些结果清楚地表明,烷基和氨基酸组SA的抑制增长至关重要恶性疟原虫在文化stearylalcohol没有氨基和亚精胺烷基三个氨基酸组没有抗疟活性。

3.2。SA密度脂质体膜规定Plasmocidal活动

孵化后脂质体的细胞含有各种摩尔%的SA,观察抗疟活动一个线性增加到20 mol % (IC₅₀= 6.87μ米)之后没有进一步增强。组成的脂质体5摩尔% SA显示非常弱的抗疟活性(IC₅₀= 41.15μ米)(图2)。这表明SA在脂质体的最佳摩尔%带来最大杀害活动20 mol %。所有后续实验使用20 mol % SA在脂质体。

3.3。角色的链长烷基胺的抑制增长恶性疟原虫在文化

恶性疟原虫感染红细胞悬浮液孵化80%大豆PC组成的脂质体和20%烷基胺的不同链长,和他们的可行性研究。结果描述在表二世建议的脂族胺的烷基链长度成正比的抗疟活性。含有癸胺脂质体IC₅₀43.45μ米比十八胺(SA)集成电路₅₀6.87μM(表2)表明烷基胺的疏水部分起着协同作用的氨基plasmocidal活动。

3.4。SA)脂质体的抗疟活性磷脂依赖

磷脂脂质体的主要成分和脂质体的磷脂成分显著影响封装药物的生物功效[20.]。为了确定是否合并不同磷脂SA的有影响的抑制增长恶性疟原虫在人类红细胞在文化中,我们已经将SA在牛脑鞘磷脂等三种不同的磷脂,蛋磷脂酰胆碱,大豆磷脂酰胆碱的抗疟疗效并研究其影响SA在文化。SA在SPC和EPC与IC脂质体₅₀6.87μM和7.30μM,分别作为抗疟剂(图也同样有效3)。另一方面,它没有效果纳入鞘磷脂脂质体;清楚地表明,SA在脂质体的抗疟疗效显著依赖于脂质体的磷脂成分。

3.5。合并SPC-SA脂质体的稳定剂

众所周知,胆固醇增加脂质体的稳定性在生理环境中,和dspe - mpeg - 2000增加脂质体的表面亲水性,因此提高脂质体在血液循环寿命和改善治疗效果的药物(21,22]。在我们的例子中,将胆固醇和dspe - mpeg - 2000在SA脂质体略微增加有效性(数据4(一)和4 (b))表明这些脂质体可作为SA的运载工具用于治疗疟疾在活的有机体内条件。

3.6。直接进入SPC-SA脂质体专门到受感染的红细胞

起始的时间研究了探针SA之间的相互作用与受感染的红细胞表面脂质体。45分钟后暴露在SPC-SA脂质体,脂质体的内化成感染红细胞表面开始,成为孵化(图2 h后完全明显5),这表明SPC-SA脂质体能找到通过宿主细胞膜。然而,未受感染的红细胞显示堆积的脂质体表面甚至2 h后孵化的条目清楚地表明SPC-SA脂质体是而且仅局限于感染红细胞。

3.7。Plasmocidal SPC-SA活性脂质体不溶血

调查SA)脂质体的抗疟活性机理,诱发感染细胞的溶血能力调查。没有观察到未感染的红细胞溶血。然而,在高剂量感染红细胞(60 - 1.88μ米),观察溶血约5%的IC下沉的影响₅₀价值SPC-SA脂质体(表3),这表明这些脂质体的抗疟效果是独立于溶血。

4所示。讨论

几项研究已经报道,SA在脂质体杀死病原原生动物寄生虫数量的文化以及在动物模型11,13,14,23,24]。当前的研究结果首次表明增长和增殖的抑制作用恶性疟原虫通过这些脂质体。据报道,脂质体与哺乳动物细胞之间的相互作用显著依赖于组成、电荷,大小、硬度,和亲水性表面的脂质体的细胞类型(25]。因此,研究这些参数的作用在SA)脂质体的抗疟活动,修饰符被纳入SPC-SA脂质体。观察最大抑制SA时通过soya-PC紧随其后egg-PC脂质体没有抑制SA时通过SM脂质体。独自egg-PC soya-PC脂质体或SPC-PA脂质体不能引起任何plasmocidal活动。

如前所述,磷脂成分在决定中起着重要作用的生物功效封装在脂质体药物。众所周知,鞘磷脂(SM)形式非常严格的脂质体相比,脂质体由EPC或程控。它还与哺乳动物细胞(据报道,脂质体的融合26),把个人的脂质分子从脂质体哺乳动物细胞的质膜或脂蛋白(27,28和内吞作用的脂质体29日)明显依赖于脂质成分和脂质体的流动性。SA的功效在抑制增长的SM脂质体恶性疟原虫与EPC和SPC脂质体可能是由于减少了融合/交互的SM与感染红细胞脂质体相比,流体EPC或程控脂质体。

增加SA在脂质体膜的表面密度导致进步抑制寄生虫的生长,增加脂质体,包含< 5摩尔%可能不活跃虽然SA 90 - 95%间所有的脂质体配方。解释这个观察被调查人员早些时候归因于polycationic SA的性质(13]。然而,还没有报告在文献中关于SA的疏水领域的依赖。为了回答这个问题,80%的大豆PC和20%的烷基胺组成的脂质体不同链长,和他们plasmocidal检查活动。发现增加脂族胺的链长增加抗疟活性(表2)表明不仅polycationic表面的疏水部分烷基胺和参与抗疟的活动是很重要的。这也许可以解释为什么polycationic分子,像亚精胺,赖氨酸,polyhistidine,和多粘菌素B缺乏疏水领域,无法杀死寄生虫。

SPC-SA脂质体杀死疟原虫的机制目前还不是很清楚。但报告表明,这些脂质体杀死其他原生动物寄生虫通过直接与带负电荷的表面分子的寄生虫24]。现在,问题是如何疟原虫感染成熟的红细胞,这是一种终末分化细胞,缺乏内吞作用的活动,内化带正电的SA纳入程控脂质体?感染人类疟原虫的红细胞,恶性疟原虫膜,导致复杂的排序和信号事件的成熟红细胞(30.]。Host-signaling组件结合寄生虫蛋白质使intraerythrocytic环境有利于诱导形成围绕疟疾的膜泡(31日]。红血球膜包含detergent-resistant膜(DRM)筏,含有很多蛋白质,这些蛋白质(蛋白质小DRM)中丰富parasitophorous液泡膜形成的疟疾寄生虫,因为它进入红细胞(32]。这些结果表明,红细胞膜蛋白进入细胞溶质通过膜内陷发生在感染疟疾的红细胞。还报道说,一旦进入红细胞,疟原虫整编了红血球膜创建一个数量的运输途径导入营养分子发行量呈现更宽容的疟原虫生存(33- - - - - -35]。报告表明,通道称为“新渗透途径”或npp 12到16 h后出现疟原虫入侵和小分子(MW < 200 Da)获得这种寄生虫通过它(9,10]。也被报道,寄生虫有直接进入细胞外纳米乳胶珠粒子(80海里)(36]。理解SPC-SA脂质体的内化机制,我们跟踪条目octadecylrhodamine-SA脂质体(有大小90 - 110 nm)到受感染的红细胞表面荧光显微镜。发现十二烷基罗丹明探针进入胞液感染红细胞(图5)。然而,条目的确切机制的探讨胞质和胞质感染红细胞parasitophorous泡是不清楚。

调查的自发转移十二烷基罗丹明未标记的膜被报道(37]。此外,Grellier等人已经证明了的存在单向通量从高密度脂蛋白的脂质胞内寄生虫通过红细胞质膜没有内化的脂蛋白颗粒38]。他们还表明,细胞质被感染的红细胞含有大量的囊泡和管状结构。管状结构作为连接器之间parasitophorous空泡的膜系统和红血球膜脂类的运输。我们的研究结果表明,SPC和SA都转移到膜疟原虫-感染红细胞后融合SPC-SA脂质体和感染的红细胞。然后,SA被从感染红细胞的膜寄生虫可能通过横向扩散之后,融合复杂网络的膜细胞溶质的发生疟原虫来华的红细胞据Grellier et al。38]。这也许可以解释感染红细胞与十二烷基罗丹明标记的探针。除此之外,各种报告表明,寄生虫占据红细胞的血红蛋白从细胞溶质的途径。特征明显的水泡宿主细胞质的内化途径是通过cytostome-derived内陷类似内吞作用[39,40]。最近,艾略特et al。41]表明,四种不同但重叠路径中存在恶性疟原虫在红细胞的血红蛋白从细胞溶质。他们已经表明,早期ring-stage寄生虫形态发生深刻变化的褶皱像一杯到自己和在这个过程(称为“大杯”)吞噬大量的胞质。此外,不同的过程像通过入口孔内吞作用,cytosomal管因入口孔和类似吞噬作用发生在后期的吞噬41]。cytostome-mediated但vesicle-independent血红蛋白吸收的过程模型恶性疟原虫也被证明(42]。因此,它很容易推测寄生虫使用一个或所有上述途径从胞质膜结合SA。SA之间的相互作用与疟原虫在红细胞parasitophorous液泡可能通过其高负表面电荷(43]。

在目前的研究中,它显然是第一次证明SA纳入程控脂质体进入疟疾感染的红细胞表面和非常有效的抑制生长和增殖恶性疟原虫在红细胞内。这些脂质体(表的低毒性3)宿主红细胞可能发现SA-bearing脂质体化疗和控制的有效手段恶性疟原虫感染人类。

作者的贡献

g·h·穆斯塔法和n加戈的贡献同样的纸。

利益冲突

作者报告没有利益冲突。

确认

这些研究支持的部分由格兰特科技(DST)和特殊援助计划(SAP)从大学拨款委员会,印度政府。Gulam Mustafa哈桑Neha Garg Enna多格拉人,和Ranu Surolia支持的“科学与工业研究理事会”研究奖学金。作者要感谢c·r·皮拉伊博士(国家疟疾研究所的,新德里,印度)提供恶性疟原虫(3 d7)和扶轮血库,新德里,印度连续供应的O⁺血。德比p . Sarkar博士和Prashant摩尼承认在荧光显微镜的帮助。

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