获得Antiplasmodial属性和乙酸乙酯提取物的分离番木瓜叶子

文摘

我们调查了antiplasmodial粗提取物的属性番木瓜叶子跟踪活动获得通过分馏。最伟大的antiplasmodial活动观察乙酸乙酯粗提物。c .木瓜显示高选择性恶性疟原虫对CHO细胞的选择性指数249.25和185.37 chloroquine-sensitive D10,仍然DD2菌株,分别。番木瓜乙酸乙酯提取获得受到分馏确定最活跃的一部分,纯化和鉴定使用高压液相色谱(HPLC)和gc - ms(气相色谱-光谱法)方法。亚麻油酸和亚麻酸乙酸乙酯部分显示集成电路识别₅₀6.88μ和3.58克/毫升μ分别g / ml。研究表明大antiplasmodial原油乙酸乙酯提取物的活动番木瓜叶子和一个集成电路₅₀的μg / ml的活动相比,分数和孤立的化合物。

1。介绍

番木瓜l .家庭的番木瓜科是一个soft-stemmed多年生植物。它通常是无支链的和可以长到约20米的高度(1]。据信来自中美洲和加勒比海岸多年来发现在许多热带和亚热带气候(2]。c .木瓜能生长在男性、女性或雌雄同体的形式。发现野生在热带地区的许多地方种植,因为它甜多汁的水果作为营养食品丰富的药用价值也因为的消化。它在早餐一般特性,用多样化的方式,原料在果冻饮料和果汁3]。水果、树叶和乳胶的物种在世界不同地区传统上用于治疗不同疾病的条件。使用在各种地方治疗哮喘、风湿病、发烧、腹泻、沸腾,高血压和增加牛奶的产量在哺乳期个人4]。先前的研究表明,这个物种有前途的抗真菌(5),抗菌6),和驱虫剂7]属性。然而,研究在体外antiplasmodial原油和细胞毒性特性提取顺序提取不同极性的溶剂中不存在的文学。在这项研究中,番木瓜树叶顺序提取,石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇和水的秩序。antiplasmodial和细胞毒性的活动从每个溶剂进行了提取,获得和分馏最活跃的提取进行了。

2。材料和方法

2.1。植物材料

番木瓜树叶收集2008年6月,由植物科学和生物技术部门的分类学者,名为Abia州立大学Uturu,尼日利亚。凭证标本PM / ABSU / 06 - 63的植物的标本存放在名为Abia州立大学Uturu,尼日利亚。开普敦大学药理学分工要求这些植物从尼日利亚进口的。尼日利亚的需求定制服务授予名为Abia州立大学将这些材料出口到南非开普敦大学,南非为研究目的。

2.2。提取

风干的叶子被减少成小块使用植物搅拌机(美国康涅狄格州华林)。植物提取的顺序。这个顺序与石油醚提取开始,这有助于减少这些绿色的树叶中的叶绿素色素其次是二氯甲烷提取,乙酸乙酯,甲醇和水。每个溶剂反复用于提取植物4 - 5次。植物提取24小时,在这一过程中植物材料和混合溶剂不断动摇了足够的水平轨道上瓶(美国加州Labcon)。合成的混合物过滤,滤液浓缩在压力下在Buchi Rotavapor r - 205 (Buchi Labortechnik AG)、瑞士),在24°C。集中提取被转移到preweighed瓶,罩在室温下干燥,并存储在−20°C到使用。水提取物被冷冻干燥集中使用DURA-DRY II仪器(美国纽约FTS系统)一个减压−82°C。冷冻干燥提取存储在−20°C。萃取值(% w / w)的干燥提取物为23.4%。

2.3。寄生虫

chloroquine-sensitive应变(D10)是用于这个实验是捐赠的牧场主人,博士沃尔特和伊莱扎霍尔医学研究所的,墨尔本,澳大利亚,氯喹耐药菌株(DD2)是来自印度支那。这些寄生虫的无性红血球的阶段维护使用的方法在一个连续的文化载体和詹森(8]。

2.4。在体外实验板设置和Antiplasmodial试验过程

每个提取的antiplasmodial活动评估对chloroquine-sensitive (CQS D10)和仍然(CQR)株恶性疟原虫使用疟原虫乳酸脱氢酶(pLDH)化验所描述的Makler et al。9]。股票的解决方案2毫克/毫升的提取制备10%甲醇(甲醇)(去离子水)。这是进一步稀释介质达到最终的浓度200年完成μ克/毫升甲醇1%。股票的解决方案分析天就做好了准备。氯喹(CQ)(σ)作为标准参考药物(积极的控制)。2毫克/毫升的CQ(σ)是构成在去离子水和进一步在200年完全培养基浓度的稀释μ克/毫升。提取物在完全培养基连续稀释双重的0.195μ使用平底的g / mL, 96孔microtitre板(他一一Bio-One)。CQ测试在100 ng / mL的起始浓度或1000 ng / mL的敏感(D10)和耐药(DD2)株P。恶性疟原虫,分别。Unparasitised红细胞(RBC)添加到第一列(空白),没有药物,而寄生的红细胞(pRBCs)被添加到2列。板被毒气毒死2分钟(93% N₂,4%的公司₂,3%的人啊₂)和孵化48小时。最后的比容和寄生虫血症2%被用于实验。的集成电路₅₀记录在本研究除了筛查试验的意思是三个独立的实验。使用微型板块的吸光度是读读者在590海里。寄生虫生存和百分比浓度抑制寄生虫的生长,50%是由测量电视台的转换恶性疟原虫。这是通过分析微型板块读者的阅读使用Microsoft Excel 2002和IC₅₀值的浓度是寄生虫的生长抑制50%确定使用非线性剂量反应曲线拟合分析图表垫棱镜版本4。

2.5。在体外细胞毒性试验

本研究中使用的细胞毒性试验方法描述Mosmann et al。10]。这是一个快速比色测定方法确定细胞生长和化学敏感性。它利用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴盐(MTT)。哺乳动物的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞线被用来研究细胞毒性的活动。吐根碱(σ)作为标准参考药物(控制)建立样本对CHO细胞株的细胞毒性。两个毫克/毫升的吐根碱是构成在去离子水和储存在4°C。原液稀释10%在CM是在完全培养基给200年的最高浓度μ0.002 g / mL和最低浓度μ克/毫升。这些浓度测试,以确定测试样本对CHO细胞的细胞毒性,以及集成电路₅₀通过比较与参考药物吐根碱。细胞生存决定使用一个微型板块读者在波长540纳米。数据分析使用Microsoft Excel 2002和图垫棱镜;版本4用于非线性剂量反应曲线分析。的集成电路₅₀值给出的意思是两个或更多独立的实验。选择性指数(SI),细胞毒性:antiplasmodial比率,计算来确定记录的活动是由于antiplasmodial活动测试样品或CHO细胞由于细胞毒性。阻力指数(RI)药物是集成电路之间的比例₅₀的抗性值应变敏感菌株。选择性指数(SI)和阻力指数(RI)计算如下所示:如果=集成电路₅₀细胞毒性/集成电路₅₀antiplasmodial活动,国际扶轮=集成电路₅₀耐药菌株(DD2) / IC₅₀敏感的菌株(D10)。

2.6。获得分离的c .木瓜乙酸乙酯部分

2.6.1。固相萃取(SPE)的过程

乙酸乙酯提取物使最antiplasmodial活动分级使用固相萃取(SPE)的过程。这是进行反相十八基C₁₈Isolute墨盒(2.6×13.0厘米,10 g吸附剂,坚持有限公司Anatech,南非)。样品的乙酸乙酯提取物的叶子C。木瓜被溶解在甲醇。这种混合的浓度稀释5毫克/毫升60%的乙腈浓度在水中mH (ACN 60%: 40%₂O)。C₁₈isolute墨盒是premoistened mH 20毫升₂O和预先处理20毫升的60%乙腈。卷3毫升的这个解决方案是分层的这盒。样品保留在吸附剂床与20毫升的mH冲洗₂O洗提unretained材料。样品保留在吸附剂床被筛选了真空通过步进式梯度与40毫升ACN: H₂O(20% - -100%)浓度的增加20%。洗出液收集在一个装瓶。真空压力将控制流15毫升/分钟的速度。每次运行结束时,墨盒是用100毫升丙酮洗掉剩余的材料。收集到的分数被旋转蒸发压力集中在40°C和冻干。冻干样本被放置在瓶和存储−20°C。100% ACN分数被转移到preweighed瓶,干燥通风橱,并存储在−20°C。的在体外antiplasmodial活动这些分数是决定在部分使用前面描述的方法2。4。

2.6.2。高压液相色谱法(HPLC)

SPE分数选择进一步净化分离在日本岛津公司LC 10高压梯度系统。这是配备台式电脑,日本岛津公司运行控制软件通过一个日本岛津公司CBM10A通信总线模块。高效液相色谱仪器的其他组件包括一个自动注射器样品,两种溶剂输送系统(LC10AS泵),和一个二极管阵列检测器(日本岛津公司SPDM10A)。化合物被紫外光谱在210 nm,所获得的240 nm和260 nm二极管阵列检测器。使用的溶剂包括总经理(沙劳打电话)能够允甲醇和乙腈总经理(沙劳打电话)能够允,每个分析级。纯去离子水(微孔,milli-Q水系统)也使用。节中提到的条件2.6。3。

2.6.3。半制备高效液相色谱条件

C半制备高效液相色谱₁₈列(发现,25厘米×10毫米,5μ米,56924 - u Supelco)使用。样本选择基于他们在体外antiplasmodial活动,以及他们的细胞毒性值。在微型离心机离心样品(雅培、德国)在1000 rpm 5分钟。注射量是50μL 2毫升/分钟的流量超过30分钟运行时间和溶剂梯度20 - 100%的乙腈在水里。的洗脱时间观察,指出,并设置多个注射后进一步收集。收集到的分数是集中使用旋转蒸发器和冻干。干燥的样品进行测试在体外对疟原虫寄生虫和活性高峰使用分析高效液相色谱法和gc - ms进行纯度检测系统中指定的部分2.6。4。

2.6.4。分析高效液相色谱法和gc - ms条件

山峰被监控的纯度分析高效液相色谱使用十二烷基硅(安捷伦Eclipse, XDB-C列₁₈,4.6×150毫米,5μ美国米)。分离有29.7°C,溶剂梯度20 - 100%的乙腈在水中30分钟1毫升/分钟的流量。这些山峰的纯度和身份使用gc - ms谱进一步证实。载气是氦的恒流1毫升/分钟。注射分裂是1:5;注射器和转移温度的温度为280°C。EI电离能是70 eV,扫描质量范围m / z40到400 (perfluoro-tri -N丁胺作为质量的参考),溶剂的6分钟。

3所示。结果

3.1。在体外分析

筛查试验的结果表明,最高的antiplasmodial活动被发现乙酸乙酯(EA)分数使用chloroquine-sensitive D10应变,IC₅₀值为2.6μg / mL相比其他溶剂(表1)。在这项研究中,在体外活动≤10μg / mL被认为是积极的;因此,与其他提取没有采取进一步的工作。氯喹期间使用这检查显示一个集成电路₅₀8.55±2.81 ng / mL的CQS D10的压力。寄生虫的生长与乙酸乙酯提取物治疗显著抑制。水提取物对寄生虫的生长没有影响。

的在体外antiplasmodial乙酸乙酯提取物和细胞毒性活动如表所示2。乙酸乙酯部分c .木瓜显示高选择性恶性疟原虫选择性指数的249.25和185.37对D10 DD2菌株,分别(表2)。D10应变实验中使用被发现CQ-sensitive 50%抑制浓度(IC₅₀9.21±3.01 ng / mL)值,而DD2应变显示集成电路₅₀值为98.5±26.1 ng / mL。吐根碱记录集成电路₅₀0.045μ克/毫升。

3.2。固相萃取(SPE)

乙酸乙酯部分的分离c .木瓜通过固相萃取进行了分离和鉴定活性成分(部分2.6。1)。900毫克的乙酸乙酯提取使用固相萃取(SPE)是分馏过程。重量不同的分数及其活动的D10应变恶性疟原虫如表所示3。更多的疏水的活动是最大的分数。

3.3。高压液相色谱法(HPLC)

的高效液相色谱法简介c .木瓜乙酸乙酯SPE分数(100% ACN)显示两个主要山峰。这些都是独立使用半制备高效液相色谱柱。ACN分数100%进一步分离使用高效液相色谱分析系统,揭示了色谱图所示1。

记录活动的100% ACN分数非常接近的活动家长乙酸乙酯粗提物为2.96μg / mL反对恶性疟原虫(表2)。100%的进一步净化ACN分数使用分析高效液相色谱柱产生了两个主要的山峰。峰1有集成电路₅₀年代的3.58μ和4.40克/毫升μg / mL CQS D10和CQR DD2恶性疟原虫分别,而峰2记录IC₅₀值为6.88μ和6.80克/毫升μ克/毫升的CQS和CQR菌株恶性疟原虫分别为(表4)。这两个峰值比SPE分数(2.2不活跃μg / mL)表所示3以及乙酸乙酯提取物IC₅₀2.96μ对CQS应变和3.98 g / mLμg / mL CQR应变(表2)。

3.4。gc - ms分析

峰1和2被确定为必需脂肪酸9日12日15-octadecatrienoic酸(亚麻酸)和9日12-octadecadienoic酸(亚油酸),分别(数字2和3使用gc - ms谱)。这些必需脂肪酸属于C₁₈脂肪酸结构在不同位置和程度的不饱和现象。

试图描述和阐明了化合物1和2的结构使用1 d和2 d核磁共振光谱测定方法。的¹H和¹³C光谱在这项研究中的应用是最广泛使用的1 d NMR技术。¹核磁共振光谱可以识别分子的质子。的数量¹³C信号确定化合物1和2为不饱和脂肪族脂肪酸。一般来说,1 d NMR有助于脂肪的识别系统和决心的未饱和的程度,以及官能团的识别。进一步表征化合物1和2使用二维核磁共振技术包括HSQC、HMQC, gCOSY遇到困难由于相似的化学位移的亚甲基组和烯双键。然而,两组可以明确确定。CH的₂在位置2给一个三联体δ2.30,耦合常数为7.50赫兹。同样的CH₃在18了三个一组的位置δ0.90的耦合常数3.6赫兹。化合物1的多个峰值,¹5.27 - -5.38 H (9、12、15 H),是连接到碳信号¹³C HSQC范围131.0 - -127.0,而在化合物2的多个峰值¹在H峰δ5.30 - -5.39 H(9日12 H)与碳信号¹³C 129.0 -130.6 HSQC频谱。由于为烯质子共振的复杂性在类似的化学环境中,这些化合物的纯度进一步使用gc - ms谱证实。经常使用气相色谱法分析脂肪酸由于其高分辨率,速度和灵敏度。化合物1的gc - ms谱显示了分子离子m / z278年。在化合物1 CH的两个损失₂组明显(m / z135 -m / z121;m / z93 - 79年),而在化合物2的分子离子在m / z280年。两个CH的损失₂组也明显(m / z96 -m / z82;m / z82 - 67年)的频谱化合物2。

4所示。讨论

在这项研究中antiplasmodial≤10活动μg / mL被认为是积极的。据阿尔托等。11很好的提取应该显示集成电路₅₀s≤10μ克/毫升。水提取与集成电路无活动₅₀值> 50μ克/毫升。Irungu et al。12)展示了类似的结果在拥有14家工厂的工作。Bhat和Surolia13记录水提取的任何活动木瓜。的石油醚提取物的生果的果皮和果肉c .木瓜证明与IC antiplasmodial活动₅₀值为15.19μ和18.09克/毫升μg / mL,分别13]。他们的观察使用FCK 2(当地的应变恶性疟原虫卡纳塔克邦,印度)类似于IC₅₀值为16.36μ石油醚提取物的g / mL的叶子c .木瓜在这项研究中使用D10的调查恶性疟原虫。

在目前的研究中,c .木瓜乙酸乙酯提取249年和185年显示出高选择性恶性疟原虫敏感(D10)和恶性疟原虫防(DD2)菌株,分别。这表明良好的特异性恶性疟原虫同时显示的记录活动c .木瓜提取并不是由于特异性的细胞毒性效应。一般来说,如果≥10意味着生物功效的结果在体外细胞毒性(14,15]。乙酸乙酯提取物对chloroquine-sensitive的活动(D10)和仍然(DD2)株恶性疟原虫没有显著差异。控制药物在体外antiplasmodial实验氯喹,而对细胞毒性实验是吐根碱(15- - - - - -17]。以前的研究已经表明c .木瓜改善阴道由于干扰阴道毛滴虫(18]。据报道显示抗炎作用[19]。的驱肠虫的活动c .木瓜可追溯到carpain的存在(生物碱),carpasemine (benzylthiourea)和benzylisothiocyanate20.]。乳胶的c .木瓜8 g / kg的剂量已被发现是84.5%有效的反对Heligmosomoides polygyrus(老鼠)和蛔虫suum在猪7]。这些研究人员发现了一个木瓜乳胶和剂量反应活动表示,计算_{One hundred.}针对成人的木瓜乳胶Heligmosomoides polygyrus使用概率单位分析[12克/公斤7]。一项研究证明了效能和成本的有效性c .木瓜水果当局部使用在治疗慢性溃疡在牙买加21]。在最近的一项研究中,c .木瓜被列为植物用于治疗利什曼病(22]。据报道,访问、无毒和预防性和是一个有前途的单药治疗肠道寄生虫病在热带国家23]。

的乙酸乙酯提取物的活性c .木瓜是比孤立的化合物在这项研究。这个观察表明,各种化合物的混合物可能协同作用。无论是峰值显示明显的细胞毒性。在这项研究中,在体外活动有三个双键的亚麻酸高于两个双键的亚油酸。没有显著差异在这些化合物的活性D10和DD2菌株用于这项研究。antiplasmodial活动不饱和脂肪酸的报道增加未饱和的程度(24,25]。这些研究人员报道了明显在体外生长抑制作用恶性疟原虫二十二碳六烯酸()、二十二碳六烯酸甲酯(甲酯)、二十碳五烯酸()、花生四烯酸()和亚油酸()。他们报告说,油酸()和二十二烷酸()对寄生虫的影响很少生长抑制(24]。在工作中,不饱和脂肪酸和显示重要在体外但antiplasmodial活动是不活跃的。

引入一个双键的单不饱和脂肪酸大大增强的antiplasmodial影响分子(24]。进一步的工作在一个C₁₈脂肪酸(scleropyric酸)孤立的树枝Scleropyrum wallichianum在攻击。家庭的檀香科Suksamrarn et al。26]报道antiplasmodial活动集成电路₅₀值为7.2μg / mL K1 (CQR)应变恶性疟原虫,类似于亚油酸的antiplasmodial活动集成电路₅₀6.80μ对DD2 g / mL (CQR)应变在这项研究。进一步研究记录了与IC antiplasmodial活动₅₀< 5μg / mL显示脂肪酸隔绝巴豆lobatus对恶性疟原虫K1 (CQR)应变14]。他们孤立的脂肪酸包括(Z。,Z。,Z12)。9日,15-octadecatrienoic酸甲酯、8、11、17日21-tetramethyl - (E。,E。,E。,E17)。8日,10日,21-tetraentetracosanoic酸(E()3)- 4-methoxy-phenyl 2-phenyl-acrylic酸,和桦木酸(14]。一项研究报道,无性的neutrophil-mediated杀死血液的形式恶性疟原虫可以增强脂肪酸(25]。最近这些必需脂肪酸作为保健品由于与他们相关的健康益处27,28]。这些酸的亲脂性的本质是活性成分分离c .木瓜乙酸乙酯提取物在目前的研究可能有助于解释这个可怜的活动表现出的水提物在最近的一项研究[29日]。

总之,乙酸乙酯部分c .木瓜展示了最大antiplasmodial活动相比,SPE的活动分数和孤立的化合物。这表明一个增强的活动由其他化学成分提取中这可能是表现为协同作用。使用的热水提取这些植物传统治疗师可以提取低浓度的这些活跃的亲脂性的组件,但在治疗剂量可能不可用。这个结果可能有助于解释增加的寄生虫生存尽管连续用草药治疗。热水提取的植物很难评估antiplasmodial活动,因为它们可以包含大量的皂甙具有非特异性antiplasmodial活动。的一个调查在活的有机体内schizontocidal活动以来的分数是必要的在体外活动并不意味着化合物同样活跃在活的有机体内(30.]。这是因为一些生理因素和免疫反应,是不可避免的在活的有机体内系统中不适用在体外实验。

利益冲突

作者报告没有利益冲突。

确认

开普敦大学的金融支持和南非医学研究理事会。

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