从幼虫绦虫线粒体Thioredoxin-Glutathione还原酶crassiceps (Cysticerci) - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果

文摘

线粒体thioredoxin-glutathione还原酶纯化从幼虫绦虫crassiceps(cysticerci)。准备显示NADPH-dependent GSSG或硫氧还蛋白还原酶的活动,并能够执行巯基/二硫交换反应。在具体的活动μ毫克¹和μ毫克¹分别用硫氧还蛋白和GSSG。明显的值是μ米,μM和μM对硫氧还蛋白,分别GSSG和NADPH。硫氧还蛋白真核来源被接受作为衬底。酶降低H₂O₂NADPH-dependent的方式,虽然较低的催化效率。在硫氧还蛋白的存在,线粒体TGR显示硫氧还蛋白peroxidase-like活动。所有二硫化还原酶活动被金诺芬抑制,表明mTGR依赖硒代半胱氨酸。还原酶活性与GSSG显示更高的温度的依赖与DTNB还原酶的活动。GSSG, DTNB还原酶活动的变化对pH值依赖于二硫衬底。胞质同种型,mTGR显示滞后动力学行为中度或GSSG浓度高,但这是不太敏感的钙。这种酶能够防止谷氨酰胺合成酶氧化失活,这表明mTGR主管应对氧化应激。

1。介绍

线粒体是细胞细胞器的活性氧(ROS)的产生,主要作为抵押品呼吸复合物的反应(1]。过度增加这些物种的浓度会导致严重的氧化应激(2]。然而,细胞有能力应对从内部产生ROS通过酶和非酶的防御系统(3]。此外,还有其他的抗氧化保护系统能够恢复ROS产生的损害。这就是可逆thiol-disulfide交换反应的情况下,参与维护一个适当的细胞内氧化还原环境。杰出的在这个意义上是谷胱甘肽和硫氧还蛋白系统,广泛分布在生活世界和玩各种各样的生理功能(4,5]。在这两种情况下,适当的操作作为抗氧化剂取决于分子的状态。对于大多数的生物,独立和具体NADPH-dependent二硫化还原酶。因此,虽然谷胱甘肽还原酶(GR)是参与减少GSSG,硫氧还蛋白还原酶(TrxR)减少氧化硫氧还蛋白。这两个酶是homodimeric黄素蛋白二硫氧化还原酶家族的成员(6]。TrxR在特定的情况下,两个不同的主要形式是已知的。酶是由二聚的蛋白质由子单元约35 kDa的细菌,植物,和一些单细胞真核生物,7]。在哺乳动物中,TrxR存在二聚的蛋白质形成的子单元约55 kDa [7]。此外,哺乳动物的酶是活动依赖于硒代半胱氨酸残基,位于它的羧基端(8]。在这些脊椎动物,胞质和线粒体亚型TrxR已确定(9,10]。

最近,一个有趣的TrxR同种型的存在,名叫thioredoxin-glutathione还原酶(TGR),据报道在成年哺乳动物睾丸(11]。这种变体出现的融合古典哺乳动物TrxR glutaredoxin-like域的氨基端端模块。像哺乳动物TrxR, TGR的酶活性也依赖于硒代半胱氨酸。TGR是一个多功能酶,有趣的是,因为它有能力减少GSSG和硫氧还蛋白和二硫化催化硫醇/交流,属性依赖的存在glutaredoxin域(11]。TGR的存在已经证明在各种脊椎动物(12),以及寄生扁虫的代表(13- - - - - -15]。值得注意的是,在后者中,典型的GR或者TrxR缺席,并减少GSSG和氧化硫氧还蛋白是由TGR。因此,在这些生物抗氧化剂谷胱甘肽和Trx-dependent系统是基于一个还原酶。因为绦虫crassiceps线粒体有能力生产H₂O₂在大量16),抗氧化防护系统必须出现在这细胞器避免内源性氧化应激的发展。然而,没有信息本地扁虫线粒体酶保护系统可用,除了报告TGR的线粒体变异的存在棘球绦虫granulosus幼虫(14]。摘要我们报告从幼虫TGR的纯化和表征t . crassiceps线粒体。

2。材料和方法

2.1。试剂

所有缓冲区和基质,以及PMSF EDTA, EGTA, H₂O₂、德勤和BSA取自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。硫氧还蛋白从人类,大肠杆菌和螺旋藻来源也由σ公司。胞质硫氧还蛋白从t . crassiceps被净化后协议涉及离子交换色谱法、伪亲和色谱法,疏水色谱(手稿做准备)。硫氧还蛋白从恶性疟原虫是一个慷慨的礼物Katja贝克尔(传染病研究中心、德国)。金诺芬从ICN购买生物医学公司(美国)。所有的电泳所需试剂,包括分子量从BioRad标记了。所有的化学品都使用前未经纯化。

2.2。增长的t . Crassiceps Cysticerci

雌性Balb / c小鼠注射接种的约15 cysticerci的t . crassicepsHYG应变进入腹腔,如前所述[17]。六到八个月后,cysticerci从腹膜腔。在使用之前,幼虫用磷酸缓冲盐溶液彻底清洗(PBS)。

2.3。Obtention线粒体的分数

Cysticerci是悬浮在线粒体缓冲区(10毫米玫瑰,250毫米蔗糖,EGTA 2毫米,和86年PMSF)补充皂素为0.2%。后10分钟内孵化,cysticerci离心机,享年180岁g在20分钟。合成颗粒,包含tegument-free cysticerci是悬浮在同一个缓冲区没有皂素和受到以电机驱动的机械均化聚四氟乙烯杵。匀浆离心机在180年g 20分钟,最后得到的上层清液离心机在14600g 15分钟。丸,含线粒体,悬浮在线粒体缓冲和清洗三次。最后一个球是悬浮在一个2:1比例(v / w)低渗的解决方案和存储。线粒体纯度决定使用两个标记酶、乳酸脱氢酶(细胞溶质)和琥珀酸脱氢酶(线粒体)。

2.4。酶化验

TrxR活动。的决心trxR活动是由下面描述的两种方法中的任何一个。

(一)DTNB减少。这个实验是基于人工基质DTNB NADPH-dependent减少。反应混合物中,100年0.6毫升,在最后一卷在不同浓度M NADPH, DTNB, 1毫米EDTA在100毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH值7.8)。酶是孵化的DTNB 3分钟为了获得基线。然后,增加了小NADPH整除和吸光度的增加又spectrophotometrically 412海里。值为13.6毫米⁻¹厘米⁻¹TNB是用于消光系数的计算。

(b)硫氧还蛋白减少。在第二种方法中,稳态NADPH-dependent减少自然衬底Trx之后。一种酶能整除的是100年的孵化M NADPH和硫氧还蛋白(在0.35和8.8之间米)在100毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH值7.8)包含1毫米EDTA。稳定的基线后,稳态反应是180年开始在最后通过增加胰岛素浓度M和NADPH氧化后在340海里。最终的反应混合物的体积是0.12毫升。值为6.2毫米⁻¹厘米⁻¹NADPH的消光系数是用于计算。

GR活性。减少GSSG决心spectrophotometrically遵循NADPH在340纳米的氧化。反应混合物中,100年0.6毫升,在最后一卷M NADPH, GSSG在不同浓度,1毫米EDTA在100毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH值7.8)。酶是孵化的NADPH 2分钟为了获得基线和反应是通过添加GSSG开始。

氢过氧化物还原酶的活动。的能力降低氢过氧化物酶是由氧化后NADPH的变量浓度的H₂O₂。反应混合物中,100年0.6毫升,在最后一卷M NADPH, H₂O₂表示浓度,在100毫米和15纳米酶三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH值7.8)包含1毫米EDTA。

硫氧还蛋白过氧化物酶活性。线粒体TGR的催化能力Trx-dependent减少H₂O₂200年被混合测试M H₂O₂,20人类Trx M, 100NADPH在0.5毫升的100毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH值7.8)包含1毫米EDTA。反应是由添加TGR的最终浓度15 nM和NADPH消费之后在340海里。

Glutaredoxin活动。mTGR glutaredoxin活力测定的,其执行巯基/二硫交换的能力是根据Holmgren和决定Ǻslund [18]。减少谷胱甘肽(GSH)和羟乙基二硫(HED) 100毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH值7.8)包含1毫米EDTA和孵化2分钟。这时,一个小整除添加酶和反应被允许进行一个额外的分钟。GSSG产生的数量是衡量添加一个包含NADPH和酵母谷胱甘肽还原酶小整除。

抑制化验。随后的协议测试的影响金诺芬mTGR活动如下:样本孵化酶在3分钟0.1三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH值7.8)包含1毫米EDTA在100年的存在M NADPH和相应的金诺芬浓度。然后,GSSG或DTNB添加开始的反应和氧化NADPH之后spectrophotometrically 340海里。

钙TGR活动的效果是由使用GSSG还原酶测定。胞质或线粒体TGR孵化3分钟在100毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH值7.8)在100年的存在M NADPH和CaCl不同浓度₂。然后,反应开始通过添加GSSG 67年最终的浓度M。

所有活动进行化验用新鲜酶纯化后不超过十天。在所有情况下,一种酶单位被定义为氧化所需的酶量摩尔的NADPH每分钟。动力学参数得到的拟合方程Michaelis-Menten率实验数据通过σ阴谋。

谷氨酰胺合成酶保护试验。mTGR保护谷氨酰胺合成酶的能力从硫醇金属催化氧化系统本质上执行(如前所述)(19),小的修改。失活的混合物中,在最后50L体积,0.15米大肠杆菌谷氨酰胺合成酶,3M FeCl₃,100年M NADPH, 10毫米德勤在50 mM消息灵通的缓冲区(pH值7)存在或缺乏mTGR。经过15分钟的孵化谷氨酰胺合成酶的剩余活动通过添加1毫升的决心谷酰基转移酶测定混合物(0.4毫米ADP, 0.15 M谷氨酰胺,KH 10毫米₂麻生太郎₄,20毫米NH₂哦,0.4毫米MnCl₂在100毫米消息灵通的缓冲区,pH值7.4)和最终的解决方案是孵化额外30分钟,在相同的温度下。然后,通过添加0.25毫升的反应是停止停止(33 g FeCl混合物₃,20 g三氯乙酸,盐酸和21 11.6毫升每升),和的形成-glutamylhydroxamate-Fe^{3 +}复杂的测量在540海里。

2.5。电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳在变性条件下进行本质上如前所述[20.]。分子量标记是并行运行评估酶的亚基分子量。

2.6。蛋白质的测定

洛瑞的染色技术方法的一个变体是用于确定蛋白浓度(21]。牛血清白蛋白作为标准。白蛋白原液的浓度是由阅读其吸光度在278 nm (10毫克毫升⁻¹解决方案)。蛋白质浓度不同的硫氧还蛋白股票的解决方案是由阅读280海里的吸光度和使用相应的消光系数在这个波长(人类Trx: 6.8毫米⁻¹厘米⁻¹;恶性疟原虫硫氧还蛋白:11.7毫米⁻¹厘米⁻¹;和大肠杆菌硫氧还蛋白:11.7毫米⁻¹厘米⁻¹)。对于这两个螺旋藻和t . crassiceps硫氧还蛋白,它们的浓度是由微密度决定的。短暂、蛋白质变性下样品分析了越来越多的页面,减少条件。之后,凝胶染色,使退色的常规程序,和乐队的强度取决于画像。蛋白质的量螺旋藻和t . crassiceps校准曲线的样本估计的帮助下获得的大肠杆菌硫氧还蛋白样品并行地运行。

2.7。串联质谱

的蛋白带切除Coomassie彩色SDS凝胶,使退色,减少,carbamidomethylated,猪胰蛋白酶消化与修改。肽质谱分析进行了使用3200 Q陷阱混合串联质谱仪(应用生物系统公司/ MDS Sciex,康科德,加拿大),配有nanoelectrospray离子源(NanoSpray II)和MicrolonSpray二头[描述22]。光谱是在自动模式下使用信息相关的收购。产生的碎片离子捕获和质量分析的第三季度线性离子阱。蛋白质数据库搜索和识别进行了使用吉祥物从MS / MS谱软件(http://www.matrixscience.com)。质量公差为0.5的前体和0.3 Da Da的碎片离子质量分类设置为其他后生动物。

2.8。净化的TGR t Crassiceps线粒体

冰冻的线粒体悬架被解冻,受到超声波治疗。破碎的线粒体被离心机在269000g在45分钟和合成浮在表面的吸附在DEAE-sephacel列(厘米)以前的时候在50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH值7.8)包含1毫米EDTA。洗后列,酶筛选了氯化钠的线性浓度梯度(0到0.5米)准备在同一个缓冲溶液。分数包含GR和TrxR活动集中,集中在centricon管最小体积,和透析5毫米钠磷酸盐缓冲剂(pH值7)。当时滞留物吸附羟基磷灰石层析柱(厘米)以前的时候在同一个解决方案。洗后列,吸附蛋白质和磷酸钠线性浓度梯度筛选了500毫米(5)。活跃的分数集中,集中最小体积如上所述。最终的解决方案是吸附在汽巴龙蓝色色谱柱(在10毫米厘米)之前平衡三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH值7.8)。洗后列,酶是由应用200年恢复M NADPH的脉搏。活跃的分数集中,集中到一个最小的体积,透析对10毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH值7.8)。储存在滞留物。

2.9。t . Crassiceps胞质TGR的净化处理

协议是在胞质TGR的净化被描述在其他地方(15]。

3所示。结果

3.1。纯化的线粒体TGR

协议是在当下为线粒体的隔离工作t . crassicepscysticerci导致一小部分基本上是免费的从其他亚细胞的细胞器,揭示了微观分析(17]。然而,由于存在TGR胞质和线粒体隔间,有必要检查的纯度线粒体制备胞质分数。为此,标记酶乳酸脱氢酶的活动(胞质)和琥珀酸脱氢酶(线粒体)确定。结果显示,大部分的总位于线粒体琥珀酸脱氢酶活性分数(%)。在这个相同的分数,几乎没有%的乳酸脱氢酶活性检测。这被用来净化mTGR做准备。

总结的一个典型的净化过程如表所示1。GSSG或DTNB作为底物,酶活性显著增加整个净化。洗脱的概要文件从三个色谱步骤,获得的位置GSSG——和DTNB-reductase活动高峰重合(数据没有显示)。此外,通过净化过程还原酶活动的比例基本保持不变,这两个活动都位于相同的蛋白质。没有证据表明额外的GR或TrxR活动被发现。净化的产量范围内获得其他TrxRs [9,23]。电泳模式揭示了齐次准备同意一个蛋白质乐队拥有大约65 kDa的分子质量(图1)。这个值是在胞质TGRs的报道范围14,15),比典型的亚基分子量TrxR动物来源,这范围约55 kDa [7,9]。我们准备的身份被质谱证实。五个多肽的氨基酸序列片段,共51残留物,组成显示,100%身份相比,相应的片段大肠granulosus线粒体TGR(数据没有显示)。


分数	$卷_{总}$ (毫升)	蛋白(毫克)	具体活动(μ* /毫克)			活动比率	活动(亩)	Purication(折叠)	收益率(%)

			GSSG	DTNB	HED	DTNB / GSSG		DTNB

粗提物	13.0	33.5	11.7	35岁,0	128.5	3所示。0	1172.5	1.0	One hundred.
DEAE-Sephacel	3所示。3	9.37	34.0	75.2	138.0	22	704.6	2。1	60
HA-Ultrogel	3所示。2	2.23	38.7	184.0	532.1	4.7	410.3	5.3	35
Cibacron-Blue	1.72	0.186	229.0	1091.0	2242.8	4.7	202.9	31.2	17

酶μ被定义为所需的蛋白质氧化nmol NADPH的每分钟

25^{°}

C。
获得的日期在

25^{°}

C和pH值7.8。

图1

β 电泳模式获得mTGR的净化。蛋白质样品的各个步骤的净化协议被孵化的1% (p / v) SDS和3% (v / v)巯基乙醇和接受变性包含1% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳在12%。运行后,凝胶染色,使退色的常规程序。道如下:(1)粗提取液;(2)DEAE-sephacel阴离子交换色谱法;(3)羟磷灰石层析法;(4)Cibacron-Blue亲和色谱法;和(5)分子量标记。

3.2。动态属性和特异性

酶活性的纯化mTGR稳定当储存在15天。有趣的是,mTGR从t . crassiceps在存储相比,其胞质不稳定。图2显示了酶活性的依赖于二硫和硫氧还蛋白浓度,DTNB或GSSG基质。酶减少三个二硫化,尽管生理硫氧还蛋白和GSSG显然是首选的。双曲饱和动力学观察三种基质,和动力学常数的Michaelis-Menten方程拟合得到的数据(表2)。线粒体TGR从幼虫t . crassiceps达到最大催化效率与内源性硫氧还蛋白(米⁻¹年代⁻¹)。酶的能力,以减少GSSG较小(约20倍米⁻¹年代⁻¹)。与胞质TGR相比,很明显,胞质酶是在一个数量级比二硫化与线粒体对碘氧基苯甲醚更有效率。这种差异主要是由于线粒体酶的转化率较低。除了二硫化还原酶活动,mTGR还显示glutaredoxin活动。具体活动,HED作为基质,是2.24毫克⁻¹。对底物的特异性,表明真核TrxR有能力从各种各样的来源,减少硫氧还蛋白原核和真核生物,尽管与一个较小的催化效率与本机Trx相比。图2 (b)当mTGR从显示了结果t . crassiceps化验了减少外源性硫氧还蛋白的能力。显然,硫氧还蛋白的真核生物的起源(恶性疟原虫或人类)是很好的底物的酶,而细菌来源的硫氧还蛋白(大肠杆菌或螺旋藻)没有被浓度测试。mTGR的还原酶的活动t . crassiceps,GSSG或DTNB作为底物,抑制了黄金复合金诺芬(图3)。后者的摩尔浓度被要求实现一个完整的酶活性的抑制作用,表明mTGR取决于活动必不可少的硒代半胱氨酸残基。


二硫化		mTGR
	$K_{米}$	$k_{猫}$	$k_{猫}$ / $K_{米}$
	( $μ$ 米)	(年代⁻¹)	(M⁻¹年代⁻¹)

Trx-S₂t . crassiceps	0.87	0.47	5.4 x 10⁵
Trx-S₂恶性疟原虫	28.3	0.81	2.8 x 10⁴
Trx-S₂智人	21.3	0.44	2.1 x 10⁴
GSSG	41.4	0.84	2.0 x 10⁴
DTNB	34.5	0.30	8.7 x 10³

100年获得使用日期

μ

米NADPH

25^{°}

C和pH值7.8。

(一)

(b)

图2

25^{°} C

t . crassiceps

μ

Tc 绦虫crassiceps Pf 恶性疟原虫 海关智人 电子商务 大肠杆菌 螺旋藻sp 二硫化还原酶活动和特异性mTGR。酶活性进行了所述下材料和方法。(一)饱和与不同的二硫化动力学。初始速度数据安装在双曲饱和动能函数的帮助下σ阴谋。的规模横坐标代表GSSG或DTNB浓度较低,而upper-abscissa规模对应于硫氧还蛋白浓度。(▲)GSSG还原酶活性;()硫氧还蛋白还原酶活性硫氧还蛋白;与DTNB(Δ)硫氧还蛋白还原酶活性。(b) mTGR向外生硫氧还蛋白的特异性。的还原酶活动mTGR化验在多种原核和真核硫氧还蛋白的存在。最后一个50浓度使用相应的硫氧还蛋白。缩写如下。,硫氧还蛋白;:硫氧还蛋白;,硫氧还蛋白;:硫氧还蛋白;年代,硫氧还蛋白。

图3

25^{°} C

μ

μ

金诺芬对线粒体TGR的二硫还原酶的活动。酶能整除(约25 ng) preincubated在100年的存在米NADPH和抑制剂所描述的材料和方法。启动GSSG或DTNB反应补充道。最后二硫化底物的浓度是40米GSSG();和1毫米DTNB ()。

像胞质TGR从大肠granulosus和t . crassiceps(15,24),显示磁滞的线粒体酶(图4),延迟时间的外观在酶化验GSSG用作在中度或高浓度底物。延迟时间的大小是独立的预孵化酶NADPH或GSSG。然而,存在的微摩尔的硫氧还蛋白或谷胱甘肽的浓度测定混合物导致显著减少延迟时间的大小,为胞质TGR的报道t . crassiceps和大肠granulosus(15,24]。

图4

39^{°} C

μ

μ

μ

全职课程mTGR GSSG还原酶活动的。酶是孵化在40米NADPH;然后,反应开始通过添加GSSG整除。最后GSSG浓度()80米;()500米;(▲)1毫米。

3.3。酶活性的pH值和温度的依赖

pH值和温度对还原酶活动的影响mTGR如图5。有趣的是,DTNB的最佳pH值和GSSG并不重合。因此,虽然对GR活性最大值位于pH值7.8,DTNB还原酶活动的最佳pH值为7.2(图5(一个))。观察温度类似的模式(图5 (b))。值得注意的是最优值与GSSG ()几乎重合的体温的中间宿主t . crassiceps()。从酶活性对温度的依赖性的上升部分曲线,可以确定能量变化与基质的激活步骤。的值kJ摩尔⁻¹和kJ摩尔⁻¹得到的活化能和GSSG DTNB,分别从相应的阿伦尼乌斯图的斜率。

(一)

(b)

图5

25^{°} C

μ

μ

还原酶活动的依赖mTGR pH值和温度。酶化验进行描述根据不同pH值在材料和方法(一)或温度在pH值为7.8 (b)使用1毫米DTNB ()或60米GSSG()作为底物和100年米NADPH。每个点代表两个独立实验的平均值。

3.4。mTGR氢过氧化物还原酶活性

据报道,TrxR哺乳动物来源(8),以及TGR曼氏裂体吸虫(13]催化NADPH-dependent减少氢过氧化物化合物,虽然效率低。图6(一)显示的活动mTGR与H₂O₂NADPH作为衬底以恒定浓度(100米)。尽管H₂O₂被认为是一个酶底物的浓度的H₂O₂milimolar范围内需要获得可衡量的速度。80毫米以上H₂O₂观察,一个强大的抑制作用。数据拟合Michaelis-Menten方程给出了明显64毫米和2 s的催化效率价值⁻¹米⁻¹。有趣的是,当硫氧还蛋白测定混合物中,稳态周转率H₂O₂消费是观察到,即使在微摩尔的过氧化氢的含量。在实验条件下,一个特定的活动的304亩毫克⁻¹获得了。

(一)

(b)

图6

₂ ₂ ₂ ₂

25^{°} C

μ

大肠杆菌

μ

γ

抗氧化和保护mTGR活动。H (a)O还原酶活性。NADPH-dependent减少HO由mTGR化验在100年的存在米NADPH。(b)谷氨酰胺合成酶的保护。孕育了一个mTGR整除(10海里)谷氨酰胺合成酶(150海里)的混合功能氧化系统在最后一卷50l . 10分钟后2毫升谷氨酰转移酶测定混合物添加。更多细节描述在材料和方法。(一)积极控制;(b)消极的控制;(c)没有mTGR充分混合;和(d)充分混合。

3.5。mTGR对抗氧化损伤的防护能力

因为t . crassiceps线粒体有潜力产生H₂O₂在大量16),我们决定测试mTGR直接保护的能力大肠杆菌谷氨酰胺合成酶对德勤/铁酶失活^{3 +}/ O₂系统(19]。谷氨酰胺合成酶preincubated时存在的硫醇/ Fe^{3 +}/ O₂混合功能氧化酶系统,mTGR充分保护氧化失活的酶活性(图6 (b))。相比之下,当mTGR省略预培养的混合物,谷氨酰胺合成酶活性没有检测到。

3.6。抑制钙离子的

图7显示微摩尔的钙浓度的影响在GSSG还原酶活性的胞质和线粒体TGR。微分的影响显然是明显的,这样的胞质变异显示对钙离子的敏感性更高。进一步,从痕迹的斜率在过渡区,一个更高的学位的线粒体酶协同是明显。为了获得抑制剂浓度导致50%抑制(IC₅₀),以及一个协同的测量,数据拟合以下方程: ,“”表示剩余活动,“马克斯”和“最小值”分别控制和完全抑制速度数据””钙浓度和对应n是希尔系数。线粒体TGR的值 M和为集成电路₅₀和n,分别获得。胞质变量对应的值 M和。

4所示。讨论

基因融合导致多肽产品不止一个已经证明了酶活性寄生原生动物。在这些单细胞真核生物,前两个磷酸戊糖途径的酶(葡萄糖6-phosphate脱氢酶和6-phosphogluconolactonase),以及酶参与thymidylate生物合成(二氢叶酸还原酶和thymidylate合成酶)位于双功能蛋白(25- - - - - -27]。在寄生扁虫,TGR似乎代表了这一策略的一个额外的例子。在这些生物,Grx和TrxR模块的融合导致了多功能酶与GR和TrxR活动,以及执行巯基/二硫交流的能力。到目前为止,胞质TGRs血吸虫的成人阶段美国曼(13从幼虫),t . crassiceps(15纯化和表征。然而,关于酶的线粒体同种型没有信息可用,除了其潜在存在的示范大肠granulosusprotoscoleces [14]。

目前工作中所示的结果表明,线粒体的幼虫阶段t . crassiceps包含一个功能TGR,参与维护谷胱甘肽和硫氧还蛋白的简化形式。因此,像细胞溶质,一个还原酶存在于线粒体。二硫化还原酶活动的全面抑制mTGR金诺芬提出了一个关键的摩尔浓度依赖的硒代半胱氨酸残基函数。更是印证了这一观察的示范硫氧还蛋白过氧化物酶酶的活动。在这个意义上,它已经表明,硒代半胱氨酸在这样的活动中扮演着重要的角色。TrxR变异缺乏这样的残留无法展示过氧化物酶活性,但后者是通过添加硒代半胱氨酸在微摩尔的水平完全恢复8]。因此,类似于其胞质同行(13- - - - - -15),mTGR取决于硒代半胱氨酸酶活性。这样的情况形成鲜明对比,观察TrxR从双翅类昆虫昆虫和线虫。在黑腹果蝇胞质和线粒体TrxRs取决于二硫氧化还原中心位于他们的c端端28]。相比之下,在独立生存的线虫秀丽隐杆线虫一个不寻常的情况下被发现。在这个有机体,胞质变体TrxR取决于证券交易委员会的活动,而在线粒体TrxR, Sec已经取代了半胱氨酸(29日]。

它最近已被证明,金诺芬是一个不可逆的抑制剂美国曼TGR [30.]。这样的观察是一致的低浓度金化合物在当前工作需要实现一个完整的二硫还原酶活动的抑制作用t . crassicepsmTGR。有趣的是,美国曼TGR需要相对较长的培养时间(15分钟)的金诺芬和NADPH获得很大程度的抑制(30.),但mTGRt . crassiceps显然是抑制3分钟内孵化。这种不同的反应美国曼和t . crassiceps酶可以解释为不同的动能向金化合物反应活性。从这个意义上讲,硒代半胱氨酸似乎发挥催化作用的抑制过程中介从金诺芬黄金转移酶(30.]。这一点值得进一步了解。

另一方面,金诺芬的显著的抑制能力的二硫化还原酶线粒体或胞质TGR的活动,明确指出潜在的治疗使用的黄金复合囊虫病的控制。在这个意义上,我们实验室的数据显示高敏感性的t . crassiceps幼虫金诺芬。后12小时内的10观察M金诺芬,一个完整的死亡率(手稿在出版社)。

尽管TGR多功能酶,它催化效率与硫氧还蛋白高于GSSG。在表3TGR的催化效率从各种来源GSSG和硫氧还蛋白进行了比较。在所有情况下,酶对硫氧还蛋白显示明显偏好。胞质TGR除外t . crassiceps酶的催化效率,Trx至少一个数量级高于GSSG。3.3获得的低硫氧还蛋白/ GSSG比率TGR的胞质变体t . crassiceps可以使用硫氧还蛋白的结果恶性疟原虫作为衬底。另一方面,与动物TrxR相比,胞质TGR的催化效率,以内源性硫氧还蛋白为底物,在同样的范围(1年代⁻¹米⁻¹)。然而,与GSSG找到一个非常不同的情况。对于典型的GR从各种来源,催化效率值的范围1年代⁻¹米⁻¹,一个数量级高于任何TGR特征(表对应的值3)。尽管TGR的催化效率相对较低,对部分补偿了GSSG相对较低值,这样的策略是有效。因此,合并两个二硫还原酶的活动在一个多功能酶导致重大损失的催化效率二硫化底物之一。关于减少外源性硫氧还蛋白的酶的能力,有趣的是,像典型的TrxR动物来源,mTGRt . crassiceps承认硫氧还蛋白真核生物的起源。相反,细菌硫氧还蛋白是一个可怜的衬底。这种明显无法减少原核的硫氧还蛋白,然而,非常高的结果值。从这个意义上说,据报道,mTrxR线虫秀丽隐杆线虫能够减少细菌硫氧还蛋白,尽管需要高浓度的底物(29日]。


酶		$k_{猫}$ / $K_{米}$ ( $米^{- - - - - - 1} {年代}^{- - - - - - 1}$ )
	Trx-S₂	GSSG	Trx-S₂/ GSSG

${TGR}^{一个}$ - - - - - -小鼠睾丸	$1.89 \times 10^{6}$	$0.18 \times 10^{6}$	10.7
${cTGR}^{b}$ - - - - - -t . crassiceps	$1.13 \times 10^{6}$	$0.34 \times 10^{6}$	3所示。3
${TGR}^{c}$ - s。曼氏	$4.70 \times 10^{6}$	$3所示。0 \times 10^{5}$	15.7
${mTGR}^{d}$ - - - - - -t . crassiceps	$5.40 \times 10^{5}$	$2。2 \times 10^{4}$	24.5

^{一个}

从文献[11)使用硫氧还蛋白-E。杆菌。

^{b}

从文献[15)使用硫氧还蛋白恶性疟原虫。

^{C}

从文献[13)使用硫氧还蛋白(天然底物)。

^{d}

这份报告与硫氧还蛋白(天然底物)。

一个有趣的发现关于mTGR pH值依赖的还原酶的活动。虽然在这两种情况下最优的pH值是清晰,DTNB GSSG 7.8和7.2,这样的最适条件的位置不一致。这样的结果表明,在减少途径GSSG DTNB、不同酸和/或基本群体,有不同的pK_一个值,。在这个意义上,它已经表明,TGR的GSSG减少活动取决于Grx域。的缺失突变体大肠granulosusTGR,缺乏Grx领域,无法促进GSSG的减少,但是DTNB-reduction影响(24]。因此,一个可分离的组织位于glutarredoxin领域,参与绑定和/或减少GSSG, pH值的差异可以解释资料的GSSG mTGR和DTNB还原酶的活动。或者,优惠绑定GSSG或DTNB相同官能团的不同的电离状态会导致类似的pH值两个还原酶活动的依赖。进一步的工作是要为了澄清这一点。

关于温度对酶的影响mTGR的活动,也观察到不同GSSG或DTNB作为基质的最优值。然而,最有趣的发现是巧合GSSG还原酶的最适温度的活动()的中间宿主的体温t . crassiceps()。这样的观察表明,关于GSSG还原酶,mTGR体内最优热条件下工作。热力学分析显示了更高的温度依赖GSSG还原酶活性与DTNB相比还原酶的活动。不幸的是,与任何TGR没有进行类似的研究,从而防止任何比较。

另一方面,mTGR能够降低H₂O₂NADPH-dependent的方式,尽管较低的催化效率。这个观察是依照以前的报告显示H₂O₂还原酶的活动美国曼TGR和哺乳动物TrxR8,13]。虽然过氧化氢酶在哺乳动物代表的主要酶防御H₂O₂线粒体中产生,没有报告这种酶在寄生扁虫的存在。过氧化氢酶活性没有检测到美国曼(31日]。有趣的是,mTGR从t . crassicepscysticerci显示重要的硫氧还蛋白过氧化物酶活性。虽然详细的动力学研究尚未执行,具体活动获得304亩毫克⁻¹在报道范围的重组的酶类肝吸虫肝片吸虫(1200亩毫克⁻¹)[32)和哺乳动物的酶类(4000亩毫克⁻¹)[33]。因此,TGR的可能性是作为防御系统t . crassiceps线粒体是开着的。发现mTGR有重要的硫氧还蛋白过氧化物酶活动的存在微摩尔的浓度的硫氧还蛋白和H₂O₂,以及充分保护授予对氧化失活谷氨酰胺合成酶,强烈支持这样的提议。

胞质TGR的高敏感性钙,相比与线粒体TGR的t . crassiceps报道这项工作类似于观察TrxR从鼠肝34]。这样的发现是一个意想不到的人,因为在寄生扁虫两种亚型的TGR显然是由一个基因编码(14]。钙浓度的微摩尔的范围,观察抑制打开TGR的可能性可能会参与一种氧化还原调控机制,我们将在下面进行讨论。

滞回行为观察到相对高浓度的GSSG,胞质TGR的描述大肠granulosus(24),t . crassiceps(15)也出现在mTGR从后者。因此,可以得出结论,一个GSSG浓度滞后模式似乎是一个多功能TGR的共同特征。模型旨在解释这种有趣的动力学行为最近提出(24]。这样的建议是基于glutathionylation特定的半胱氨酸残基的酶位于硫氧还蛋白还原酶TGR的一部分。然而,没有详细的动力学研究。最近的三维结构的测定美国曼TGR [35)将帮助获得彻底了解这个特殊的动力学模式。人们很容易推测的滞回行为的潜在生理意义和钙TGR的抑制。硫氧还蛋白的重要作用在减少的维护状态的含巯基的群体在各种细胞内蛋白质已经证明(36,37]。这种能力显然是依赖TrxR完全活跃。因此,抑制TGR由于二硫化还原酶活动的增加钙或GSSG将导致瞬态干扰二硫化二硫酚/平衡的蛋白质。这种干扰可能会改变许多重要蛋白质的活动因素可能是关键的启动信号,控制各种细胞过程。显然,更多的工作是需要为了阐明这样的可能性。

最后,必须指出,尽管寄生扁虫胞质和线粒体TGRs都是由单个基因,编码的一些数据强烈建议其成熟的功能状态是不同的。因此,如表所示3胞质变体的催化效率,硫氧还蛋白或GSSG作为衬底,与其线粒体同行相比有显著提高。此外,两亚型存储的稳定性以及其敏感性钙显然是不同的。能找到一个合理的解释这个观察在不同的胞质间的氧化应激和线粒体隔间。如前所述在导论部分,线粒体是地方产生活性氧,导致更多的氧化环境与细胞溶质形成对比。因此,二硫化形成线粒体蛋白质可能引起轻微的氧化,导致共价修改表单与构象不同足够改变一些功能属性。这种现象已经被描述的例子(38,39]。

确认

这项工作是支持的研究资助IN207308-2和IN220710-3 Direccion一般de Asuntos del个人Academico (DGAPA),自治,和博士奖学金从Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia (CONACyT),墨西哥,阿尔贝托Guevara-Flores。

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寄生虫学研究期刊》的研究

从幼虫线粒体Thioredoxin-Glutathione还原酶绦虫crassiceps(Cysticerci)

文摘

1。介绍

2。材料和方法

2.1。试剂

2.2。增长的t . Crassiceps Cysticerci

2.3。Obtention线粒体的分数

2.4。酶化验

2.5。电泳

2.6。蛋白质的测定

2.7。串联质谱

2.8。净化的TGR t Crassiceps线粒体

2.9。t . Crassiceps胞质TGR的净化处理

3所示。结果

3.1。纯化的线粒体TGR

3.2。动态属性和特异性

3.3。酶活性的pH值和温度的依赖

3.4。mTGR氢过氧化物还原酶活性

3.5。mTGR对抗氧化损伤的防护能力

3.6。抑制钙离子的

4所示。讨论

确认

引用

版权

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