在体外活动Geldanamycin衍生品日本血吸虫和与象皮病马来

文摘

Geldanamycin (GA)是一种benzoquinone-containing ansamycin抑制热休克蛋白90。GA衍生品被评为anti-neoplastic代理,但他们的效用对寄生虫的热休克蛋白(休克)同源性与人类一半是未知的。四个活动的GA合成衍生品进行测试在体外使用成人与象皮病马来和日本血吸虫。的两个衍生品,17 -N-allyl-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG)和17 -N——(2-dimethylaminoethylamino) 17-demethoxygeldanamycin (DMAG),目前在人类临床试验作为抗癌药物。使用浓度被认为是安全这两个衍生品血浆浓度峰值,所有四个衍生品是活跃的寄生虫。更少有毒导数17-AAG在杀戮一样有效的遗传算法美国日本血吸虫,DMAG和5′-bromogeldanoxazinone比17-AAG反对更活跃马来丝虫。这项工作支持继续评估ansamycin衍生品为广谱抗寄生虫药物了。

1。介绍

热休克蛋白(休克)扮演至关重要的角色在不同的生物过程,包括细胞的发展和体内平衡。热休克蛋白90(一半)是一个丰富而重要的真核胞质磷酸腺苷蛋白作为伴侣蛋白在细胞过程包括细胞凋亡和增殖1,2]。Geldanamycin(遗传算法;1在图1)是一种天然苯醌ansamycin,原来孤立链霉菌属hygroscopicus(3]。遗传算法结合腺苷结合口袋的一半,特别是抑制腺苷三磷酸酶活性(4,5),因此,评估了其在肿瘤形成抗增殖效果在体外和在活的有机体内有前途的应用程序作为新型抗癌治疗(6,7]。有几个实验室GA对Hsp的报道活动恶性疟原虫和与象皮病pahangi;然而其他线虫等守恒等秀丽隐杆线虫不受遗传算法的影响,暗示可能构象异构Hsp物种之间的8,9]。更少的有毒的导数geldanamycin, 17 -N-allyl-17-demethoxygeldanamycin [10)(17-AAG;2在图1),现在在二期临床试验11,12在人类肿瘤疾病。第一阶段试验17-AAG显示安全概要文件与ca的血浆浓度峰值剂量时间表。10μ米(13- - - - - -15]。第二个17-amino-substituted geldanamycin导数,17 -N——(2-dimethylaminoethylamino) 17-demethoxygeldanamycin (DMAG;3在图1),正在进行第一阶段临床试验(16]。然而,这两个化合物是目前广泛使用的测试他们的活动对人类寄生虫。在菲律宾,世界卫生组织的两个十大被忽视热带寄生虫病、淋巴丝虫病(马来丝虫或w .丝虫)和血吸虫病引起的日本血吸虫,占每年成千上万的病人的疾病。因此,在研究的过程中发现杀寄生虫药化合物的新类,我们研究了在体外成人的反应马来丝虫和美国日本血吸虫17-AAG 17-DMAG。

图1

Geldanamycin (GA)和合成化学结构和结构四个衍生品。

2。材料和方法

2.1。Geldanamycin衍生品2- - - - - -5准备

17 -N-Allylamino-17-demethoxygeldanamycin [17-AAG (2),17 -N——(2-dimethylaminoethylamino) 17-demethoxygeldanamycin [17-DMAG (3),17 - (N-azetidinyl) 17-demethoxygeldanamycin (4)在本质上量化产量geldanamycin室温反应(1)与适当的初级或循环仲胺和5′-bromogeldanoxazinone (5)是在温和的收益率(60%的收益率)通过加热geldanamycin 2-amino-5-bromophenol存在乙酸(17- - - - - -20.)(见图1)。

2.2。寄生虫的材料

成人B。马来得到实验室的博士雷卡普兰(FR3设施、雅典、格鲁吉亚)和维护在12-well平底盘子包含RPMI介质penicillin-streptomycin和0.5% DMSO 37°C,湿度和5%的公司₂。成熟的男性和女性美国日本血吸虫得到后经皮感染BALB / C小鼠40 cercariae,隔绝美国日本血吸虫field-infected钉螺quadrasi在菲律宾,和随后的牺牲的老鼠35天收集成熟雄性和雌性的盐水灌注肠系膜血管使用fine-gauged蝴蝶针连接到50毫升无菌注射器充满了无菌生理盐水。

2.3。药物毒性的测定

在成人测试化合物的影响马来丝虫0.5最终浓度的监测μM, 1μ5米,μ米,0μ25米,μm .丝虫的死亡是评估通过确定所需的时间完全不可逆的戒烟的能动性。每个试验包含3成虫,化验进行了一式三份。实验在6次重复至少一式三份。负控制井包含成人寄生虫培养仅在媒体和积极控制井另外含有100μ阿苯达唑。在这种情况下,负控制寄生虫仍然积极能动的500小时(~ 20天),而阿苯达唑384小时内杀死100%的丝状虫(16天)。在统计上有显著差异的时间定义为死亡值<。01(students- - - - - -测试)。在这种情况下,不可逆的停止能动性与疟原虫死亡以MTT测定吸收。

用于测试的药物毒性美国日本血吸虫,五虫对,五男五女蠕虫被放置到每个包含5 24-well平底板μM的GA或17-AAG 2毫升完成rpmi - 1640媒体补充人体红细胞,2 g / L葡萄糖,0.3 g / L谷酰胺,2.0 g / L NaHCO3, 15%胎牛血清(热灭活),和5%笔/喉炎的症状(青霉素10000单位和10毫克/链霉素在0.9%氯化钠)。分析进行了一式三份和孵化湿润有限公司5%₂室在37°C。寄生虫的体力活动(如摄食行为,运动,和可行性)记录12后,15日,18日,24日,26日,48岁,60岁,72小时。新鲜的培养基和18 - 36小时后测试化合物添加。这些实验都是重复至少五次。实验重复使用成对的雄性和雌性蠕虫,以及个人雄性蠕虫和雌性蠕虫。GA的衍生品是高度可再生使用成对的成虫,个别女性,和个人雄性蠕虫(见图2)。每个图形的点代表了三个不同的实验。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图2

日本血吸虫 (一个)。成对的成年男性和女性的生存在人类红细胞和五个微摩尔的geldanamycin (GA、三角形)或五微摩尔的17-AAG(广场)相比,控制寄生虫补充只有人类红细胞(钻石)。在24小时时达到50% - -60%死亡率90%的控制仍然是可行的()。(b)。个人雄性蠕虫的生存。在24小时时达到50% - -60%死亡率90%的控制仍然是可行的()。(c),个人的生存雌性蠕虫。35% - -50%的死亡率在24小时95%的控制仍然是可行的()。在72小时17-AAG GA造成死亡率高50%和控制。d .雄性和雌性个体的生存一起培养。GA,男,明星。GA女,圆。17-AAG男,三角形。17-AAG女,十字架。在36小时GA在雄性蠕虫引起60%的死亡率90%的控制仍然是可行的()。72小时90% -100%的GA和17-AAG治疗蠕虫已经死了和控件(死亡率50%)。(一)——(d),一式三份的数据代表了美国南达科他州均值±决定在一个代表性的实验。

3所示。结果

GA和17-AAG成人男性和女性死亡美国日本血吸虫在一个集中的5μ(数据2(一个)- - - - - -2 (d))。这两个化合物的影响都是相同的使用成对的蠕虫,孤立的雄性,孤立的女性,孤立的幼虫(cercariae,数据未显示)。化合物都是高度可再生的影响在12 - 24小时内,即使成年的长寿美国日本血吸虫培养在最小的媒体只有40% -50% 72小时。低浓度的化合物由于缺乏成人没有测试美国日本血吸虫。

成人马来丝虫GA和17-AAG丧生更快的浓度明显低于100年μ阿苯达唑(积极控制)(图3(一个))。Macrofilaricidal 17-AAG浓度低于10 - 20倍的血浆浓度峰值(10μ米),在第一阶段临床试验报告为安全。所有四个GA衍生物macrofilaricidal在500 nM,最低浓度测试(图3 (b))。DMAG和复合4最快速macrofilaricidal效应(9天)比100年μ米阿苯达唑(16天)在这些条件下(浓度对阿苯达唑)。大多数化合物浓度大于10μM展出一些降水RPMI 0.5% DMSO溶液。

(一)

(b)

(一)
(b)

图3

与象皮病马来丝虫体外。 马来丝虫 μ μ μ 马来丝虫体外 μ 马来丝虫 μ 3 5 马来丝虫 μ μ (一)Geldanamycin和17-AAG对成人的影响17- - - - - -AAG死亡成人更快,二百倍浓度低于阿苯达唑(积极的控制)。在统计上有显著差异的杀人率观察5 - 100GA和17-AAG与100阿苯达唑(积极的控制,)。500 nM和1000 nM GA和17-AAG相当于100阿苯达唑在280 - 300小时。(b)的影响17-AAG相比其他三个GA衍生品的成年人。负控制蠕虫(即。,no drug) remain viable for 500 hours and 100 米阿苯达唑杀死寄生虫,15天。所有三个浓度的四个GA衍生品成人死亡超过100阿苯达唑(积极的控制,)。数字高于100%意味着每个酒吧小时杀死。化合物(DMAG)和(5′-bromogeldanoxazinone)更积极的反对比17-AAG 500海里()。这四个化合物在每个浓度(500 nM-10进行测试米丝虫的死亡比100要快多了阿苯达唑(积极的控制,)。(a)和(b),一式三份的数据代表了美国南达科他州均值±决定在一个代表性的实验。

4所示。讨论

人类热休克蛋白90(一半)属于“GHKL”组的atp酶(22]。这组蛋白的磷酸腺苷网站独特的影响。分子伴侣’,如热休克扮演至关重要的角色在不同的生物过程包括细胞的发展和体内平衡。高度的保护中表现出相同和相似的氨基酸残基磷酸腺苷口袋已知蛋白质序列的各种物种的一半(图4)。GA衍生品的抗效果表明,类似life-dependent ATP结合位点被影响在这样的生物。

图4

4 21 美国cerevesiae 酿酒酵母 大肠杆菌 大肠杆菌 美国日本血吸虫 日本血吸虫 马来丝虫 与象皮病马来 秀丽隐杆线虫 秀丽隐杆线虫 多序列比对(Clustal W)五个真核和原核热休克蛋白(一半)。灰色阴影区域表示残基组成geldanamycin-binding口袋,可以跨物种保存(,]。:;:;:;:;:。

热休克的重要性在人类和兽医寄生虫的生物学报告在许多属包括之前利什曼虫、锥虫属疟原虫、血吸虫和各种线虫。摘要et al .,报道macrofilaricidal活动GA对狗和猫的那种病,与象皮病pahangi,在摩尔水平(23]。同时,指出,虽然GA显然绑定b . pahangiHsp,自由生活线虫Caenorhabiditis线虫没有结合GA尽管线虫Hsp序列之间的高度保护(8]。geldanamycin-binding一半的能力的最近的一项研究中,来自许多线虫,发现与预留一些寄生虫,寄生的独立生存的物种和物种拥有独立生存的环境测试的幼虫阶段都没有绑定geldanamycin [9]。在的情况下恶性疟原虫系统分析的女伴网络实验interactome相结合,在网上和酵母两种混合化验,促进Hsp70-Hsp40交互和功能分配和预测以及Hsp100家庭(24]。在恶性疟原虫乔治亚州是抑制所有intraerythrocytic阶段和杀死寄生虫在一个发展周期25,26]。

寄生虫杀死化验工作在这些研究中所使用的略有不同的其它世卫组织合作组。例如,丝状虫杀死研究有时在猴肾细胞的存在进行支线层最多120小时,控制测试化合物的毒性(27]。然而,在大多数的情况下GA衍生品测试,(1)缺乏对人类细胞的毒性已经建立,(2)去除血清的培养基允许更长时间在体外文化指出,500小时,(3)这样的血清删除允许评估亲脂性的化合物,可以绑定到血清白蛋白或其他蛋白质和可以掩盖其固有的活动对丝状虫(28]。药物化学的最新进展包括策略利用亲脂性的药物(29日)本身可以降低血浆浓度峰值和更大容量的分布。

在血吸虫病的情况下,世卫组织合作中心通常使用5天测定红细胞没有文化媒体在评估铅化合物的活性美国曼和美国hematobium(30.]。然而,美国日本血吸虫成虫更难以维护在体外使用相同的在体外条件用于美国曼。Cercariae,不同的生命周期阶段美国日本血吸虫,也同样受到GA衍生品(数据未显示)。

物质的药物发现策略通常专注于识别分子靶点的寄生虫相信主机毒性或cross-inhibition主机通道将最小化。尽管这种方法最终可能是有效的,另一种方法是目标蛋白或通路,是常见的寄生虫和主机,但随着时间的推移,这可能演变特性,域,或替代功能是独一无二的物种。当这样的分子被公认为一个理由不止一个疾病药物发现的目标,这种方法的好处是更广泛的科学和药物化学基础设施的发展带来物质的化合物。此外,无处不在的目标蛋白质这样在寄生虫允许并行开发的治疗,可以有效治疗不同的寄生虫感染。因此接下来的步骤在GA衍生品的评价必须包括药代动力学和寄生代理在活的有机体内造成实验来确定有效在活的有机体内给药方案使用美国日本血吸虫小鼠模型,要么马来丝虫移植或L3-induced沙鼠模型b .马来语我感染Mastomys鼠coucha(31日]。此外,待定的GA及其衍生物的抗寄生物的效果取决于渗透目标,结合亲和力,独特的热休克蛋白依赖cochaperones,或可能的额外GA的目标。虽然antifilarial活动各种抗癌化合物来自美国国家癌症研究所以前一直学习的,无论是GA或其衍生品研究32]。另外一个策略对活动评价化合物美国日本血吸虫将包括一个左右比较美国曼,这是更容易维护在体外并能演示更容易在体外积极的影响控制药物如吡喹酮(33]。(美国曼然而,在菲律宾不存在。)

荧光偏振分析最近报告了一半活动Taldone et al。34]。全虫提取物与象皮病pahangi是用于修改试验之前验证一半寿命抗肿瘤抑制剂的发现,这个试验是验证使用可溶性b . pahangi提取物。虽然报道适合大规模筛选,确定化合物在体外方法不考虑化学性质,促进或抑制运输物质的化合物在成虫的角质层。溶性提取物的人体寄生虫,马来丝虫相比,没有系统地摘录b . pahangi,一个动物寄生虫。

尽管化合物4和5没有测试人类也不是他们的药代动力学参数已知,化合物17-AAG (2)和DMAG (3)在人类和被测试的优势被认为是高度活跃的反对人类肿瘤细胞在体外和相应的和被评估在人类癌症化疗的临床试验。获得人类安全和宽容数据的两种药物浓度发现致命的年代。日本血吸虫马来丝虫给一半寿命增加的原因调查这些和其他抑制剂作为抗治疗代理。此外,最近发现的降低,使质子化的对苯二酚版本17-AAG一半寿命有水溶性和等效功效作为抑制剂允许之间类似的其他17 -水溶性类似物N-alkylamino-17-demethoxygeldanamycin衍生品(35]。调制热休克蛋白越来越被认为是拥有各种演示和潜在有益的治疗效果(36]。我们的在体外研究支持的活动GA衍生品对Hsp的人类寄生虫的两个重要的新团体。

确认

这项工作是支持由美国国立卫生研究院的一部分(NIAID UO1A153877) m·a·克隆亚麻。成人与象皮病马来被慷慨地提供通过NIAID雷蒙德·卡普兰丝虫病研究资源存储库(FR3合同165283号)。距Milev和杰西卡Kopascewski都提供了技术援助与丝状虫杀死化验,和约瑟夫·阿贝德Edumar Madlangbayan都提供了技术援助与血吸虫杀死化验。

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