CYP4G19表达水平与拟除虫菊酯抗性有关Blattella蠊

文摘

德国蟑螂已成为深圳地区的一个大问题,因为他们的杀虫剂耐药性,尤其是对拟除虫菊酯。拟除虫菊酯称为“贾重庆”,以防止害虫很长一段时间被发现是抵抗”贾重庆“3.88阻力指数测量使用rt - pcr和免疫组织化学分析表明,CYP4G19 mRNA和CYP4G19野生菌株的蛋白表达水平显著高于敏感菌株。dsRNA片段来自目标基因CYP4G19准备使用体外转录和microinjected到腹部的野生菌株。2 - 8天注射后,结果表明,CYP4G19 mRNA表达组注射极显著降低。

1。介绍

德国小蠊(Blattella蠊)是常见的害虫,可以通过携带细菌和病毒,传播疾病,它可以导致人类哮喘等过敏反应(1]。德国蟑螂对不同的环境有很好的适应性,可以迅速传播。他们很容易产生抗药性化学杀虫剂,是城市害虫防治的主要障碍。这是表示,拟除虫菊酯抗性的机制包括代谢酶细胞色素P450 (2]。CYP450 hemoprotein,单氧酶系统中充当终端氧化酶。体内,它催化氧化反应的内源性和外源性物质,并扮演着重要的角色在农药解毒3]。

核糖核酸干扰(RNAi)是一种技术,可以用来抑制基因表达的增加gene-specific双链RNA(极)。它最初的特点秀丽隐杆线虫(4),已经被应用于各种各样的生物研究基因功能,包括原生动物、昆虫和哺乳动物(5- - - - - -7]。所需的分子过程和组件功能RNAi途径都进行了广泛的调查秀丽隐杆线虫(8]。

b .蠊已被用来作为模型来研究核受体家族参与20-hydroxyecdysone (20 e)——基因层次结构(9]。b .蠊E75的成员20 e-triggered基因层次,RNAi实验体内在倒数第二和最后的若虫龄b .蠊显示,BgE75需要成功地完成nymphal-nymphal和nymphal-adult转换。注入dsRNA进入血腔的仙女和成人的蟑螂b .蠊被用来沉默基因功能体内和停止adult-specific卵黄蛋白基因的表达。相同的技术被用来沉默的表情b .蠊RXR-homologue ultraspiracle (USP)基因体内过去若虫龄。结果提高发育基因的可能性可以通过系统功能上分析了RNAi在这个物种10]。

研究昆虫P450在杀虫剂抗性的作用可能为开发新农药提供重要信息,监测农药抵抗,和农药的rational application。然而,研究杀虫剂耐药性的机制涉及P450在德国蟑螂是稀疏的。只有七个德国小蠊P450基因在NCBI沉积,生物的角色仍然照亮。德国小蠊CYP4G19 P450基因家族的新成员,都有不同的表达模式之间的拟除虫菊酯敏感株和耐药的。它是由Pridgeon等人发现使用的方法选择减法杂交(SSH) 2003年(11]。进一步的研究做了进一步研究CYP4G19的生物特征和拟除虫菊酯分子CYP4G19的耐药机制12]。

2。材料和方法

2.1。德国蟑螂

敏感菌株GC209b .蠊获得了来自广东疾病控制和预防中心和野生菌株收集在深圳农贸市场。

2.2。农药抵抗的决心b .蠊

“贾重庆”8%股票的解决方案是用丙酮稀释到0.005%工作的解决方案在一个广口瓶500毫升根据敏感分层的方法(13]。2.5毫升工作的解决方案是添加到一个瓶子,瓶子是旋转缓慢,直到液体分布在内壁均匀。瓶子准备干燥后使用。液体石蜡被放置在瓶颈阻止蟑螂逃离。十个男性成年人选择进瓶里,混战的数量记录每隔几分钟。实验重复3次。半消磨时间和95%可信区间是记录和计算。阻力指数(R) =野生菌株/敏感菌株。执行的测试与(605)%相对湿度。丙酮作为空白控制。

3所示。之间的微分CYP4G19 mRNA的表达检测敏感使用rt - pcr和野生菌株

总RNA从b .蠊是孤立的使用PUREscript试剂(Gibco)根据制造商的指示。RNA样本存储在直到使用。第一链DNA合成进行了1在20 g RNAL使用RNA-PCR反应解决方案工具包(Branchburg珀金埃尔默,CA)。引物序列CYP4G19使用和PCR反应条件是12.5L 2Taq PCR主结构,1L底漆(100.5 mol / L)L cDNA模板,和10去离子水。PCR循环:30年代,35周期。CYP4G19引物都有意义acattttacatcttcgccactcc -和反义-tctccttcttgttcttgatgacctt -这些引物扩增423个基点从CYP4G19信使rna片段。该基因编码肌动蛋白被用作控制和引物都有意义-atggaatcatcaccaactgg -和反义-ccttgatgtcacgaacgatt -rt - pcr产品1%琼脂糖凝胶上分离。凝胶进行扫描使用紫外线指数凝胶扫描系统和相关软件估计带强度和mRNA水平。

4所示。重组CYP4G19 rCYP4G19 Anti-rCYP4G19抗体的蛋白质和制备

互补脱氧核糖核酸编码氨基酸残基从1到273的b .蠊CYP4G19放大使用逆转录pcr (RT)。产品与新人道我消化和EcoR我和结扎pET-28a (Pharmacis,乌普萨拉,瑞典)。向量是转染大肠杆菌BL21细胞(Pharmacis), rCYP4G19蛋白质被添加IPTG诱导。纯化rCYP4G19蛋白被确认在sds - page和用于BALB / c小鼠进行免疫接种。用免疫印迹anti-rCYP4G19的存在被证实

5。检测CYP4G19蛋白表达之间的敏感和野生菌株使用免疫组织化学

5.1。组织切片的b .蠊

德国小蠊放在10分钟前翅膀和脚很快被削减。尸体被剪切和被放置在2 - 3部分过夜。固定和脱水后,组织被切成6米的部分

5.2。免疫组织化学(包含IHC)

deparaffinization后,部分接受0.5%过氧化氢甲醇30分钟和孵化磷酸盐5%的脱脂牛奶(PBS) 1小时。多克隆抗体的部分被孵化2小时(稀释1:200)对CYP4G19重组蛋白,与PBS洗了三次,孵化与山羊antimouse免疫球蛋白合二次抗体(1:200)在室温1小时,和洗了三次PBS之前显色试剂轻拍。用蒸馏水清洗后停止反应。样本与苏木精染色12分钟后,用蒸馏水冲洗,脱水,透明,安装在显微镜下检查。

免疫组织化学分析后,我们使用了IPP软件(image-pro + 5.1)来分析图像的光密度。具体操作如下:设置记录图像反模式,选择和衡量棕色阳性染色的地区信号,并计算平均光密度(平均密度= IOD /区域)。计算平均值和标准差在同一实验小组,和大量的分析实验组之间的平均密度与Statistica完成。

6。合成的CYP4G19 dsRNA

6.1。合成的CYP4G19 dsRNA

两段CYP4G19基因(基因银行加入号码:AY176056.1)被选为dsRNA合成。模板1长590个基点(包括T7启动子序列)位于目标基因的300个基点,至864基点。模板2 696个基点(包括T7启动子序列)坐落在目标基因930个基点至1598个基点。具体的引物如下:有意义的-taatacgactcactatagggcatgccaagggatattgag -和反义-taatacgactcactatagggcatggccttctcttcttgt -模板1和意义-gaattaatacgactcactatagggagagccagaagaaacgattgg -和反义-gaattaatacgactcactatagggagatgaagccatcagccctct -模板2。

6.2。dsRNA体外转录

一个20包含1 L转录反应混合物2g DNA模板(或控件模板),2L 10T7反应缓冲区,2L核苷酸,2L T7酶,nuclease-free水(20L)是在冰上准备的。解决方案是完全混合,受到短暂离心。0.5确定最佳培养时间L样本已被删除的反应混合物在2小时,3小时,4小时,产品在不同的时间使用电泳测定。转录在是当时最好的培养时间。如果模板DNA是少于800个基点,dsRNA合成是没有退火步骤。

6.3。净化的极

DNA和ssRNA消化混合物中21L nuclease-free水,5L 10消化缓冲区,和2L DNase我混合1小时ssRNA(15分钟)。消化DNA或ssRNA纯化使用滤芯(Promega)根据制造商的指示。样本的筛选了DNA和dsRNA在分光光度计测量和运行在1%琼脂糖凝胶评估dsRNA的正直和纯洁。在存储的净化产品

7所示。CYP4G19基因的RNA干扰

250年一群野生德国蟑螂(大约各占一半男性和女性)分为五组,三个实验的组(实验组I, II, III),另两组是对照组包括无关的对照组(沉默Ambion公司提供的负控制序列,与任何的基因没有明显的相似之处b .蠊)和一个与林格氏生理盐水对照组。我被注射的实验组dsRNA1解决方案体外转录模板我;实验组二世被注射dsRNA2溶液体外转录模板二世;实验组三世被注射dsRNA1和dsRNA2的混合物同时,组织5和6没有收到任何试剂空白的控制。dsRNA解决方案迅速注入到腹部使用DEPC-treated micro-syringe包含1每只蟑螂最终浓度为0.5 L1克/l

注射后,样品被放置在单独的广口瓶500毫升提供食物和湿棉花。瓶颈是涂在液体石蜡和用纱布覆盖,防止蟑螂逃跑。观察每组存活率,注入和收集样本2 - 8天后在液态氮冷冻。

8。观察Pyrethroid-Resistance RNAi之后

dsRNA的腹腔注入野生德国蟑螂和未经处理的野生株作为控制,实验重复3次。阻力指数实验组和对照组的计算,和RNA干扰前后阻力水平进行比较,以确定更改德国小蠊CYP4G19基因与拟除虫菊酯杀虫剂耐药性有关。

9。结果

(1)检测的农药抗性野生菌株德国蟑螂
野生株德国蟑螂有显著提高(26.381,95% CI 23.367729.3893),阻力指数(3.88),贾庆林重庆比敏感菌株(= 6.803,95% CI 5.46478.0795,阻力指数= 0.37)确定使用敏感层的方法。

(2)检测CYP4G19 mRNA表达差异的野生敏感菌株
敏感的肌动蛋白基因和CYP4G19基因和野生菌株(每组包括6个样品)被放大,和PCR产品在1%琼脂糖凝胶电泳(图进行了分析1(一))。乐队的荧光OD值扫描,实验重复3次。一个配对以及分析(图1 (b))表明,敏感品系德国小蠊的基因表达明显低于野生菌株(OD值乐队:敏感的污渍,0.580.13;野生strians, 0.970.31,)。

(3)mRNA表达的动力学CYP4G19基因在野生菌株的德国小蠊RNAi之后
合成dsRNA (0.7每g)注入到腹膜的昆虫,注射后8天存活率进行了评估。一个或两个测试昆虫死于每组,和存活率在80% ~ 90%之间。每组六昆虫收集从2到8天注射后,存储在液氮中。CYP4G19基因的mRNA水平使用半定量rt - pcr方法检测到。CYP4G19基因的mRNA表达的动力学实验组显示CYP4G19基因的表达开始减少注射后2天,并继续削弱在第五天(图的最低水平2(一个)),但没有显著差异表达CYP4G19 dsRNA1基因,dsRNA2, dsRNA1 + dsRNA2组(图2 (b))。

(4)rCYP4G19蛋白质的表达和生产反rCYP4G19抗体在老鼠身上
我们表达和纯化rCYP4G19使用钠十二烷基sulfate-poly-acrylamide从细菌和证实蛋白质凝胶电泳(图3(一个))。小鼠免疫与rCYP4G19产生高水平的免疫球蛋白抗体的免疫抗原。免疫印迹分析表明,小鼠血清抗rCYP4G19绑定专门rCYP4G19和本地CYP4G19蛋白质(图3 (b))。的具体抗血清rCYP4G19用于免疫组织化学。

(5)微分表达式CYP4G19蛋白质的体内后,RNAi野生菌株使用免疫组织化学检测
CYP4G19前后蛋白质RNAi dsRNA1和dsRNA2使用免疫组织化学检测。之前RNAi CYP4G19蛋白的表达明显强于RNAi(图之后4(一))。男性和女性成人显示相同的结果在德国小蠊的微粒体。使用荧光免疫组织化学结果拍照相机,10个地区的表达式选择随机从每一个切片,和该地区的平均密度值进行了分析和计算使用IPP软件。平均密度的平均值相对应的活检之前和之后的RNAi野生菌株被配对分析以及(图4 (b))。

(6)农药抗性野生菌株的德国小蠊RNAi之前和之后
dsRNA注入60随机选择野生菌株德国蟑螂和阻力检测注射一周后执行。昆虫的抗性指数3.076 RNAi处理(= 6.8,95% CI 6.07.6),而未经处理的控制,阻力指数3.969 (= 21.0,95% CI 17.424.5)。结果表明,阻力指数”贾重庆“显著下降RNAi治疗后,虽然昆虫仍很抵制与敏感菌株。

10。讨论

许多压力b .蠊据报道,拟除虫菊酯抗性在世界各地收集的字段。一些Blattella蠊测试显示2-10-fold抵抗拟除虫菊酯cyfluthrin,氰戊菊酯、氯氰菊酯,λcyhalothrin出现在野生菌株(14,15]。在一些地区,拟除虫菊酯杀虫剂可能仍然是有效的b .蠊由于低水平的阻力;然而,潜在的发展严重的耐药性存在是否继续使用拟除虫菊酯。这些人口的未来前景的化学控制必须仔细考虑。

没有统一的监测农药blattaria阻力的方法。莫斯等人报道的一种胶含有一种杀虫剂和评估的能力产生有用的毒理学数据对德国蟑螂,Blattella蠊[16]。Choo等人相比,两个电阻检测方法测定蟑螂(局部应用和世界卫生组织玻璃罐方法)(17]。这里我们time-mortality响应测试方法用于抵抗拟除虫菊酯称为“甲重庆”field-collected菌株(野生菌株b .蠊与敏感菌株相比)根据科克伦的方法(18]。我们认为昆虫敏感如果阻力指数小于2,如果指数大于阻力2,如果指数强劲阻力10。在这篇文章中,我们展示了德国蟑螂收集的野生菌株在市场的地方,在那里人们可以长期使用拟除虫菊酯称为“贾重庆”,防止害虫对贾庆林重庆阻力指数为3.88。“贾重庆”是一个2%组成的混合物的化学杀虫剂胺菊酯和氯氰菊酯6%,和通常用于害虫控制近年来在深圳地区。我们的结果让我们考虑替换或旋转与其他类型的杀虫剂来对付德国蟑螂。抵抗德国蟑螂为进一步的研究提供有价值的实验材料的耐药机制。

一些出版物报道,杀虫剂耐药性水平变化与蟑螂基因的突变和表达,尤其是解毒酶、细胞色素P450等等(19,20.]。新的细胞色素P450基因,CYP4G19,最近被识别和分离差异表达基因ACY杀虫剂敏感和耐药之间Apyr-R德国小蠊菌株使用PCR-selected减法杂交和cDNA阵列技术(11]。的互补序列CYP4G19有1638个核苷酸的开放阅读框编码假定的546氨基酸残基的蛋白质,和它的超表达是与对杀虫剂的抗药性(11]。我们的结果表明,在野外CYP4G19 mRNA表达水平应变明显高于敏感菌株

核糖核酸干扰(RNAi)是一种技术来抑制基因表达的内源性或外源性gene-specific双链RNA(极)。它最初表现为线虫(21),自那以后,被应用在各种各样的生物来研究基因的功能。与传统方法对比研究基因的功能,RNAi技术可以用来关闭或沉默目标基因或基因表达减少。沉默的表情b .蠊RXR体内过去若虫龄的RNA干扰(RNAi)方法描述了马丁et al。(2006) (10),结果显示,大多数的仙女无法发展成人形式。目前还没有研究显示利用RNA干扰技术研究细胞色素P450的德国小蠊的函数。

我们的研究结果表明,CYP4G19基因mRNA表达被抑制后注入的和CYP4G19基因的mRNA表达的动力学实验组显示CYP4G19基因的表达开始减少后2天内注入。这个结果表明,特定dsRNA扮演干扰的作用随着时间的流逝,和干涉效应最强在第五到第七天。

摘要CYP4G19是通过免疫组织化学方法检测到的蛋白表达,并且大多数CYP4G19蛋白质微粒体的表达b .蠊。CYP4G19免疫组织化学分析结果表明,CYP4G19 RNAi治疗前蛋白表达水平明显高于后RNAi在女性和男性成年人半定量rt - pcr和免疫组织化学分析结果初步表明CYP4G19 mRNA表达水平和CYP4G19蛋白质表达水平在拟除虫菊酯耐药菌株明显高于敏感菌株。本研究表明,基因转录和翻译水平的CYP4G19上调拟除虫菊酯耐药菌株。

意思是豪富会killinf时间和阻力指数处理和未经处理的野生菌株的德国小蠊计算使用广口瓶敏感层的方法。结果表明,野生菌株的拟除虫菊酯抗性水平基因表达水平的降低与减少CYP4G19;然而,削弱后的电阻RNAi并不是一个完整的抗性表型的变化。细胞色素P450是一个大型的基因家族。除了CYP4G19之外,还有其他家庭成员:CYP4C21, CYP6K1 CYP6L1, CYP9E2。没有发表的研究在其他细胞色素P450酶的功能,以及其他可能会有一些潜在的相关性P450蛋白质和农药抵抗德国蟑螂。此外,其他解毒酶系统也可能扮演一个角色在抵抗德国蟑螂解毒,如非特异性酯酶系统,glutathione-S-transferase系统等等(22,23]。我们的结果表明可能有其他相关因素与德国蟑螂的拟除虫菊酯抗性有关。虽然野生品系德国小蠊的阻力水平是减少CYP4G19基因mRNA表达的下降,它并不足以完全颠覆野生菌株的耐药性拟除虫菊酯

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