遗传变异性和系统发育关系鲁兹锥体我基于Miniexon基因序列在哥伦比亚孤立

抽象的

系统发育研究鲁兹锥体已经确定了两组的存在：T. Cruzi.我和T. Cruzi.2还有一些方面仍然是未知的遗传变异T. Cruzi.我组。鉴于其流行病学重要性，有必要更好地了解T. Cruzi.传输周期。我们的目的是证实在其中的单倍型存在T. Cruzi.基于微小外显子基因间区发现的单核苷酸多态性(SNPs)，对来自哥伦比亚地区不同宿主和流行病学传播周期的分离菌株进行了遗传变异和系统发育关系的研究。31.T. Cruzi.分离物的分子表征。文学内的系统发育关系T. Cruzi.I株表现出4个单倍型群(Ia-Id)，与它们的传播周期有关。在之前的研究中，我们报道了Ia单倍型主要与国内周期和定居有关Rhodnius propixus.。单倍型IB与国内循环和白细胞循环相关，单倍型IC与锥形循环密切相关，单倍型ID与Sylvatic循环密切相关。本研究中应用的系统发育方法是将分离物之间的关联的工具升高，因此脱落在Chagas疾病流行病学上。

1.介绍

Chagas疾病是一种非常复杂的动物病，是拉丁美洲的主要公共卫生问题，影响了1500万人，有2800万人有收购感染的风险。据估计，较近5％的哥伦比亚人群被感染，20％有可能获得疾病的风险[1］.由原生动物引起的感染鲁兹锥体，影响急性和慢性阶段的人，具有不同程度的严重程度。感染后不久出现急性阶段，慢性阶段可能持续数年。经过多年的沉默无症状时期后，大约25％的患者发育心脏症状可能导致慢性心力衰竭和猝死，6％发育消化病变，主要是兆克隆和兆噬饼，3％患外周神经损伤[2］.这些表现在国家内部并非平均分布[3.］.

由于它们特定的克隆传播方法，T. Cruzi.分离株已被描述为表现出巨大的表型和基因典型异质性[4.那5.］.尽管他们的遗传变异性高，T. Cruzi.分离物可以分为两组，T. Cruzi.我和T. Cruzi.二世(6.]后者分为五个亚组IIA-E [7.]， 然而t cruzi.我包括一个单一的，相对均匀的思工[8.］.

T. Cruzi.I的地理分布范围非常广，从北美洲到南美洲，主要从亚马逊盆地向北，在那里，国内和森林锥蝽物种确保了南美锥蝽病在多个国家的传播，包括委内瑞拉、哥伦比亚、中美洲和墨西哥[9.-13.］.在南锥体中，玻利维亚，阿根廷和智利等国家已经报告存在T. Cruzi.我在国内和Sylvatic传输周期中传播[3.那14.那15.］.

内部内部变体T. Cruzi.我已被分子推论和生物学特征广泛记录。近年来，O'Connor等人。发表了关于遗传变异性的研究T.Cruzi.一世 [9.我们的小组提出了在内部存在四个单倍型T. Cruzi.一世 [16.］.在我们的研究中描述的推论是基于微小外显子基因的基因间部分区域发现的多态性。该基因参与mRNA加工等转录后事件，由于其在蛋白质差异表达调控机制中的重要作用以及其内在的高度可变性，被认为是一个重要的分子标记T. Cruzi.人口[17.-19.］.

鉴定和表征T. Cruzi.我单倍型是一种很好的流行病学工具，了解拉丁美洲流行地区的传输动态。With this study, we show how the previously proposed haplotypes, based on specific polymorphisms in the partial intergenic region of the miniexon gene that are related to the parasite’s transmission cycles, are found in other Colombian isolates and can be usefull to identified other isolates from Latin America.

2.材料和方法

2．1．T. Cruzi.孤立

共计31人T. Cruzi.对来自不同宿主和哥伦比亚地区的分离株进行了评估。特征T. Cruzi.我和T. Cruzi.II株作为对照1）.

2.2。Miniexon基因基因区域的测序

使用Qiamp DNA提取试剂盒（QIAGEN）从维持在培养物中的寄生虫获得DNA，随后储存在4°C。使用先前描述的引物进行Miniexon的表征[22.］.PCR在20时进行 L反应混合物含30ng /l DNA，2.5 mm mgcl₂, 0.2每个引物的M和0.5 U/L Biotools DNA聚合酶。在PT-150 MinicaceCler（MJ Research，Watertown，MA，USA）中在94℃下在55℃下为30秒，30秒，72°C，然后在72°C下进行30秒，然后在72°C下循环在72℃下伸长5分钟。Primers and nucleotides were removed from PCR products by purification using the Ultra Clean PCR Clean-up DNA Purification System (MoBio, Solana Beach, CA, USA) according to the manufacturer’s protocol and resuspended in 50 mL of 10 mM TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.6). DNA purity and concentration were determined using an Eppendorf Biophotometer 6131 at 260/280 nm wavelengths.

采用双脱氧链终止法和Taq染料终止化学试剂盒对两条链进行测序，用于ABI 3730和ABI 3700毛细管系统(Perkin Elmer, Foster City, CA, USA)。使用ClustalW应用程序v.1.8进行多次对齐[23.]默认参数。对齐在Mega 3.0版中编辑[24.]和Staden包版本1.5 [25.］.

2.2.1。系统发育推断

使用最大规定（MP）和最大似然（ML）推断出phylogenies，估计PAUP V.4.0b10 [26.］.使用启发式算法进行MP分析。为了评估内部节点的相对支持，执行引导重采样方法（具有1000个重复）。

对应的32个序列的对准T. Cruzi.我（包括T. Cruzi.在MrModel Test 2.2中评估得到最佳拟合模型[27.]，模型测试的修改版本3.6 [28.[Akaike信息标准（AIC）[29.那30.］.使用启发式搜索进行MP分析，每个周期随机添加10个序列。

基于最大简约结果进行ML方法，并根据这些数据用TreeView (Win32) v1.6.6重建最大似然树。采用启发式研究对1000次重复使用bootstrap方法评估节点的鲁棒性[31.］.使用MRBAYES v 3.1进行了贝叶斯的发育性推理[32.]（根据MRMODEL测试2.2的设置），1000万蒙特卡罗马尔可夫链世代（Bayesian-Monte Carlo Simulation每100次模拟，烧伤10000次，链条4）。

3.结果

3.1。Miniexon基因基因因子序列

所有分离株的迷你外显子SL区基因长度为319 bp。在序列比对中，有263个常量位点和56个简约信息位点。共观察到19.43%的多态位点，对应23个突变、14个转位和19个插入-缺失。平均核苷酸组成(58.4%)是基于GC含量(表2）.获得的序列保存在GenBank-EMBL-DDJB数据库中(登录号为AM259467-AM259480、EU127299-EU127315、EU344771和EU344772)。

根据未转录小外显子基因的56个核苷酸组成的起始区域的多态位点，将分离菌株分为4个单倍型群，显示出连续的微卫星区(TG)n (TATG)m (TG)x。不同的重复次数在4 - 7 (n)、2 - 4 (m)和0 - 3 (x)(位置15-40)之间变化(图15-40)1）.

３．２．部分微小外显子基因间区序列的系统发育分析

拟合基因间区域数据的最佳ML模型为GTR+G+I。获得的ML树(-lnL = 900.8816;不变位点比例= 0.560;Gamma分布形状参数= 0.893)明确地证实了四种支持良好的单倍型的存在T. Cruzi.我隔离分析及其与传输周期的关系（图2）.

ML分析显示出由显着的引导值支持的四个集群（95.）.在图中2和3.，系统发育分析显示为单倍型Id，对应于从Didelphis Marsupialis.和野生triatomines, 96%的自举支持和100%的贝叶斯概率。单倍型Ia、Ib和Ic在98%的引导下得到支持。单倍型Ia和Ib分别对应于家周循环和家周循环，bootstrap值为98%，且与单倍型Ic相关性更高。然而，虽然它们属于该循环，但它们与单倍型Id (sylvatic cycle)关系密切，bootstrap值为98%。

单倍型ID主要与Sylvatic环境有关（从中获得的分离物d . marsupialis和Rhodnius propixus.Sylvatic群体）由96％的重大自发值支持（图3.）.

MRBAYES可信度方法用于提供统计有效性。贝叶斯概率（95.）显示出三种显着的碎片：由国内分离株形成的单分离物，其显示出强多元素的单倍型Ia，第二次思工（IB），贝叶斯概率为100％由国内和周兆子循环形成，以及形成的第三个主要的思工其中单倍型IC和ID密切相关。然而，这些分离株呈现了准时突变，使我们将它们分组在不同的单倍型组中。

4。讨论

T. Cruzi.已发现我的分离株主要与Sylvatic传输周期相关[33.那34.[寄生虫从Marsupials孤立[35.那36.］.T. Cruzi.II主要与家庭传播周期和灵感有关[33.］.这导致了误解T. Cuzi.I总是与传播的sylvatic cycle联系在一起[8.］.最近在南美洲北部地区、中美洲和墨西哥进行的流行病学研究表明，主要是T. Cruzi.I在森林传播周期中，以及在家庭和家庭周期中[11.那12.那37.］.

由于其高异质性和寄生虫基因组中的大型多拷贝基因组阵列的存在，Miniexon基因已被广泛用作分类学标志物[16.那17.］.单倍型T. Cruzi.已经从系统发育分析（如MP，ML和BI）中鉴定了哥伦比亚，如下：单倍型IA，与国内循环和载体相关r. rolixus.；单倍型Ib，与国内和国内周循环和载体相关Triatoma dimidiata；单倍型IC，与平凡的循环相关联;和单倍型ID，与Sylvatic传输循环相关联。

单倍型IB与人类，白云母的向量相关联（t . dimidiata），并与与周膜相关的储存器分离（Canis熟悉）.单倍型IC在特定传输周期内没有明确定义，似乎在国内和杂志之间发挥中介作用。此外，存在与单倍型ID的系统发育联合，其由98％的引导率支撑，分离单位的疏水物（图）2和3.）.为了确认该观察结果需要更大的分离物样本，用于定义单倍型IC作为独立组或将其分类为SylVatic单倍型ID [16.那18.］.

野外的孤立含量r. rolixus.在棕榈树上捕获（阿泰里butyracea）和野生水库d . marsupialis以单倍型Id分组。系统发育分析显示一个强组(单倍型Id)，包括sylvatic起源的分离株，bootstrap值(96%-100%)在统计学上支持该组。这一结果也证实了O'Connor等人的观察[9.]其中“迪特班集团“提出，从本发明中加入来自SylVatic载体的分离物。我们在单倍型ID中基于位于39的核苷酸多态性的基于核苷酸多态性的细分。这种小差异与该组中发现的载体的野生来源有关，并且未被视为第五倍型（图1）.

所提出的单倍型与他们来的流行病学循环有直接关系，但与地理隔离没有直接关系。单倍型之间发现的可变性可以通过不同地区的不同动物群和随着环境变化发生的许可过程来解释。在野生动物群中发生的不利变化和随后的稀疏，有利于传输循环的重叠和寄生虫菌株的随后分子多样化[38.］.

这种现象受环境和免疫因素的影响，包括毒力，致病性和在与载体和脊椎动物相互作用后的菌株和克隆的可能选择。其中几种因素的组合可以解释寄生虫的生物行为中的变异[39.］.

原始传播仅限于热带森林环境，寄生虫最初通过肛门腺分泌物和伊斯特替尔替尔酯的尿液分布[40那41.］.进行了不同的遗传特征T. Cruzi.我孤立建议强大的联系迪特班SPP。，虽然同时，有一个关联T. Cruzi.II犰狳[8.］.有趣的是,r. rolixus.与野生生态区棕榈树中的哺乳动物有亲缘关系。此外，这些关系在北美和南美都可以观察到[42.］.

Omossum Genus在加拿大南部到阿根廷南部发现的世界和范围内的最高分布。D. Albiventris.优先生活在南美洲的寒冷气候中。d . marsupialis栖息在温暖的森林地区，主要在南美洲北部和中美洲，在那里它们保持相同的分布T. Cruzi.一世 [9.］.

协会T. Cruzi.我和迪特班SPP。也在美国观察到，在哪里D.弗吉尼亚州在大约4000万年前的更新世迁移到北美[9.那43.那44.］.寄生虫分离的分子表征D. Albiventris.也表明存在T. Cruzi.已证明的系统发育群T. Cruzi.以优惠的方式感染某些主持人。此外，有证据表明T. Cruzi.II在啮齿动物中产生高寄生虫，而在d . marsupialis那T. Cruzi.ii被淘汰了T. Cruzi.我被扣留了[45.］.

Sylvatic和国内周期之间的关系非常复杂;然而，两个周期中的一个共同特征是迪尔弗利的存在，据称在传输动态中发挥着重要作用[46.］.参与T. Cruzi.我和d . marsupialis表明祖先和亲代关系产生了本研究中确定的寄生虫的所有遗传亚群。这种报道的可变性有利于寄生虫从昆虫到野生哺乳动物再到家养哺乳动物的扩散[8.那16.那33.那34.那47.］.

根据这些观察，我们建议T. Cruzi.我孤立是美国祖先集团的一部分，从媒体和野生储层之间的杂志传播，其中d . marsupialis鉴于其在野生环境中转移到野生环境之间的能力有时会被播放有时会寻找食物的能力[33.那48.］.

不同的研究报告了向量r. rolixus.作为最终选择性传播的因素T. Cruzi.我为人类和水库。这表明这些杂志r. rolixus.，广泛分布于棕榈树上[49.那50.]，可能已经开始通过的过程T. Cruzi.我从野外循环到国内周期，当时他们开始定期过程[49.那51.］.

这些结果支持，这是一个非常密切的关系T. Cruzi.I单倍型Ib, Id和载体r. rolixus.和t . dimidiata， 分别。以前的研究，强调载体在锥虫组亚群中的传播中的作用，显示了基因型之间的紧密相关性t . rangeli和Rhodnius.物种 [51.-54.］.

锥虫与不同锥虫种和种群的相互作用显然是决定拉丁美洲人类感染锥虫流行病学的重要因素。在特定的地理区域，特定的锥虫亚群通常由特定的病媒传播。

未来的研究专注于锥虫组 - 载体相互作用将允许识别共施加过程，这反过来可以支持进化的假设和分布T. Cruzi.和t . rangeli美国的vectors。此外，这些研究将有助于识别通过不同载体物种促进或阻止寄生虫传播的机制[43.］.但是，要建立不同的关系T. Cruzi.我是单倍型，需要使用额外的合适分子标记（例如线粒体和鞭毛基因）进一步分析。

致谢

从项目获得财政支持：欧盟第七框架计划（ChagasePinet）合同编号223034和“Red deInvestigacióndeCenrosde Encermedades Toticales”（RICET，项目编号）。C03 / 04，NO。ISCIII2005-PI050574，没有。伊斯科省蒂瓦西卡斯·德·科技州的REDES Qual-Retic RD06 / 0021/0017，Madrid卫生部FIS Cooperativa。Colciencias No 7155-Co，“支持科学界，国家博士学位计划”Colciencias No。1204-343-19188，科学学院，洛杉矶大学，波哥大，哥伦比亚和Servicio Central de Soporte A LaIncortigaciónScsie，西班牙大学，瓦伦西亚大学。作者希望感谢奥马尔Triana和先天性触乳病例组（ColcienciasProject No.1109-04-18231），他们与本研究中涉及的一些孤立州和JuanA.Sánchez的贡献为他们在系统发育方法的顾问。

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