文摘
我们进行了血清学、临床和寄生虫学的后续狗人口在美国内脏利什曼病的流行区域估计间接immunofluorescent化验(IFA)和免疫印迹(WB)。12个月后,IFA获得的结果表明,50%的人血清反应阳性的和两个血清学资料观察:第一个从1/40到1/80,第二个1/160。由世行,观察到相同的比例,从显示积极的狗血清肽的识别29和32 kDa 8个月前IFA血清转换。在积极的狗,所有的血清与组织寄生认识到症状的肽68.5 kDa。我们的结果说明,需要修改的关于狗的消除控制措施。他们也证实高敏感性和特异性的免疫印迹在犬利什曼病的诊断,表明其与IFA协会的可能性。
1。介绍
利什曼病,一种疾病引起的几个物种属原生动物的利什曼虫(Kinetoplatida:锥虫科),在88个国家(1)与流行病学特点根据人类活动等因素,寄生虫族群,和野生和家养沙蝇动物区系组成,等等。在美洲大陆,疾病,叫美国内脏利什曼病发生在热带和亚热带地区。在巴西,除了农村人畜共患病,内脏利什曼病正在成为一个城市周边,甚至城市zooanthroponosis [2]。
国内和野生犬科动物被描述为最重要的储层婴儿利什曼虫chagasi(3,4]。犬利什曼病是一种慢性感染,应考虑viscerocutaneous和现在的比人类疾病更严重的预后。然而,像人类一样,狗可以显示一个无症状的感染或甚至可能演变决议(5]。的公开形式疾病特异性的症状,包括发烧、体重减轻、肾衰竭、嗜睡,onychogryphosis,广义lymphadenomegaly,皮肤,眼部病变(6]。
在巴西,血清反应阳性的狗的利什曼病控制措施包括消除基于间接immunofluorescent化验(IFA)。狗只基于血清滴度的扑杀1/40可能会导致不良的结果,因为像人类一样,狗可以控制感染l . infantum根据他们的细胞免疫反应的能力。消除血清反应阳性的狗已经控制了感染可能会导致替换另一个敏感的动物,一个新的潜在的感染源为男性(7]。
在旧世界,一些研究表明,免疫印迹技术非常敏感和早熟的血清学诊断工具的内脏利什曼病(8,9]。不同,在新世界有稀缺的报告关于技术的使用,以及一些研究在巴西完成证实免疫印迹作为可靠的诊断分析。德波拉et al。10)表明,29岁和32 kDa的肽是公认的极具利什曼虫(我)chagasi寄生狗。
在目前的研究中我们重新评估狗从一个地方性城市周边地区的问题在里约热内卢州,在十一的人类内脏利什曼病已发现病例,25%的猫(11)和29%的负鼠(12]seropositives,Lutzomyia longipalpis代表沙蝇总人口的19%。
本研究的目的是进行血清学、临床、和自然感染的寄生虫学的后续狗AVL的地方性区域,分析动力学的感染比较IFA和世行结果和试图识别潜在的预后标记。
2。材料和方法
2.1。研究区域
Barra de Guaratiba大西洋之间的狭长地带本地化和岩石布兰卡山脉,一个地块属于Serra在里约热内卢州做3月。属热带气候,年平均气温为27.5°C和降雨量1400毫米。二次大西洋森林覆盖的山坡上被人为改变行动。
AVL的措施实施控制程序在这一领域包括扑杀serumpositive狗的血液洗出液(IFA)和喷涂房屋和附件控制成人的向量形式。
2.2。狗的数量
在研究的开始有197只狗。所有的动物都是通过访问监控家里的地方从一个流行地区的直辖市里约热内卢,巴西免疫荧光和免疫印迹分析和测试的特定抗体的存在。许多狗失去了在随访期间,因为扑杀的控制程序,由自然原因死亡,动物的迁移在其他领域的主人。从这个初始样本,剩余60狗每两个月随访,1年期间,如下:月2,4,6,8、10和12相对应,分别2月,4月,6月,8月、10月和12月。尽管控制程序,所有的serumpositive狗其中60仍在后续在该地区。
狗的人口由国内狗很少或根本没有获得兽医保健。这项工作依法进行了动物实验的伦理原则,经伦理委员会批准使用的动物(CEUA) of Fundacao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ),巴西里约热内卢。
临床评估,包括淋巴结触诊,和一个升值的一般健康状况的动物,采血的时候进行。
血液收集的头静脉穿刺。血液样本被允许血栓和血清被离心分离(10分钟/ 30.000g)和存储−20°C到使用。
没有一个动物参与我们的研究是接种疫苗。
2.3。IFA
分析是根据Camargo[以前描述的过程13]。血清稀释从来被测试和截止的积极反应浓度稀释的建立的采用,巴西卫生部。
2.4。免疫印迹
免疫印迹分析是根据爱莎et al。8]。短暂,抗原经蛋白酶抑制剂(邻二氮杂菲10毫米,Phenylmethanesulfonyl氟化物0.1米,碘乙酰胺0.2米)含有可溶性阶段(39.191g / 30分钟)的细胞溶解破坏(minibomb细胞室)l . chagasi菌株l - 579 promastigotes, 12.5%聚丙烯酰胺凝胶上分离并涂抹到硝化纤维素纸(NCP)。血清稀释1/50孵化了一条NCP一夜之间在4°C。结合免疫球蛋白与兔子被孵化antidog免疫球蛋白结合辣根过氧化物酶(σ,圣路易斯,密苏里州)和H和发达2O2(0、06% v / v)和diaminobenzidine (25% w / v,σ,圣路易斯,密苏里州)。
2.5。寄生虫学的后续和狗的尸体剖检
寄生虫学的追问:poplyteal肿大淋巴结中观察到的四个60狗被戳破了通过使用包含NNN Vacuntainer管中,施耐德的完全培养基(σ,圣路易斯,密苏里州)覆盖,其中包括20%的胎牛血清。管是保持在27°C和检查期间每五天两个月。
尸体剖检:四个60的狗被杀与过量的硫喷妥钠(十到二十五毫克/公斤,IV)和氯化钾(100毫克/公斤,IV)。在验尸,Giemsa-stained痕迹和涂片是健康的耳朵和腹部皮肤、肝脏、脾脏、淋巴结和腹水的液体和检查无鞭毛体的存在。
2.6。聚合酶链反应
DNA隔离和PCR分析,狗的脾脏样本与Guanidine-EDTA溶液混合的比例和24小时后的混合物煮1分钟,保持在4°C DNA提取。从培养获得的总DNA也l(l)chagasipromastigotes (MHOM / BR / 1974 / PP75)作为一个积极的控制。PCR是根据Passos et al。14]。
2.7。点污点分析检测利什曼虫chagasi感染
放大产品也由点状杂交分析描述Francino et al。15]。
3所示。结果
3.1。IFA
在后续的开始,41.7%(25/60)的血清反应阳性的狗,他们是无症状的,血清滴度不等来(表1),尽管监视由巴西卫生部的研究领域。
一年后,在研究结束时,50%(30/60)的动物血清反应阳性的,所以,血清转化的发生率为8.3%(5/60)在后续。分别观察患者血清转化,在2月4只狗,2月6日狗,狗和12月1(表1)。
12个月后两个血清学资料观察:第一个,从1/40到1/80,由16个动物呆在全年血清滴度较低,他们没有任何症状;第二,血清滴度1/160,由14个动物,倾向于呈现高血清浓度和一些狗出现症状和组织的寄生。
3.2。临床和狗的感染状况
一年后,五的14只狗属于剖面2显示症状出现在8 - 12个月,他们都IFA滴度1/320。在所有五个狗观察冷漠和减肥。观察肝脾肿大2例动物,离散淋巴结病2例动物,onychogryphosis 1动物,ascitis动物(表12)。的狗死了,其他人是euthanasied和验尸。
3.3。免疫印迹分析
通过免疫印迹结果随访期间,抗原识别的形象没有任何区别,除了狗,有提出增加乐队的数量和强度的认可。
这是观察到的高seroprevalence(50%)与一个强大的和均匀的抗原识别模式。公认的多肽分数在4到220 kDa的范围和确认所有的动物感染系统公认的29岁和32 kDa肽乐队(图1)。只有5狗认识到症状的血清群68.5除了29和32(数字1和2),所有这些动物血清滴度1/320。
血清未感染的狗从流行和nonendemic区域显示等效识别模式,包括弱识别抗原的37岁的42.5和71.5 kDa。30 -血清弱公认的五肽分数最高,不包括肽29日,32岁,或68.5 kDa。
3.4。寄生虫学的评价
在所有四个动物尸体剖检,无鞭毛体被发现在肝、脾、皮肤、淋巴结痕迹(表2)。
在其中一个动物,观察ascitis从这条狗,几公升的腹水的液体被戳破了强烈的感染。四个动物的血清浓度验尸,一种动物分别是1/320和1/1280 3动物。两只狗的血清学1/1280是强烈的感染。
穿刺的poplyteal淋巴结肿大的30血清反应阳性的狗都是底片在试图隔离利什曼虫。
3.5。PCR和点污点分析检测利什曼虫chagasi(利什曼虫)感染
研究样本都是在重复实现。可视化的两只狗在琼脂糖凝胶放大产品的样品,都是阳性,放大产品120 pb,对应的守恒kDNA地区利什曼虫sp。
杂交后的放大产品的具体调查l . infantum,积极的样品确认利什曼虫(我)chagasi和所有负样本维护负(图3)。
4所示。讨论
犬内脏利什曼病,低水平的抗体生产相关的寄生虫血症较低,相反,高抗体生产与临床相关疾病和寄生虫检测的最佳机会7,16,17]。
在目前的研究中,我们观察到的发生两血清学资料后一年的随访IFA的犬类的人口。概要的动物之一,提出了低血清浓度在整个一年,可能是在感染的早期阶段或控制在一个类似的机制中描述利什曼虫Infantum [7,18]。另一方面所有的动物的形象两个显示血清学浓度增加,其中一些达到1/1280,可能表明这些动物失去了他们的能力在控制感染,在几周内呈现症状和大量的寄生虫。
它已被建议作为一个有效的控制措施,感染性的扑杀狗的效价1/40 (19,20.];然而,一些研究反对使用这种方法(21,22]。我们的研究结果表明,采用的控制措施,包括serumpositive狗的撤退,必须维护截止(1/40)作为标准的积极性。然而,只有动物的滴度1/160,属于两个应该取消。这些动物很可能显示高血清浓度和组织的寄生更感染性白蛉,因为狗传染性和白蛉感染的比例已经建议与反密切相关利什曼虫皮肤疾病的抗体水平和强度(4,20.,23]。
与动物属于概要1,他们仍应被监控,因为这些狗可能可能反映了不同clinicalepidemiological情况,如早期感染或自然阻力的主机。
进行一个纵向研究43小猎犬狗接触三个传播赛季(2002 - 2004)的地中海利什曼病,作者观察到的结果与我们的数据证实,至少在某种程度上,因为他们认定为专利感染动物血清滴度和组织的寄生,表现症状。另一方面,狗被认为是与subpatent感染,当他们目前的浓度没有组织的可检测性寄生(24]。
此外,扑杀动物,不表现出疾病往往导致所有者隐藏他们的动物,甚至让他们检查和测试,因此导致寄生狗的持久性。
免疫印迹试验已被视为非常具体和早熟的方法诊断犬美国内脏利什曼病因为寄生肽分数29和32 kDa与发生有关利什曼虫感染的狗(10]。我们的结果证实与观察,因为所有受感染的狗认出这样的血清肽分数29和32 kDa IFA血清转换前8个月,虽然它没有隐含的预后疾病的结果。
68.5 kDa带的识别可能的预后价值;事实上,只有血清5狗反应症状这个分数而没有25无症状的犬血清显示识别(图2)。相同的结果中观察血清12症状的狗42动物从另一个人口的地区不包括在这项研究(数据未显示)。
根据卡雷拉等。25在实验感染狗l . infantum一些抗原的识别更糟糕的动物血清的临床演变与活跃的无鞭毛体乘法。我们认为68.5 kDa肽的识别只有症状狗的血清可以代表一个类似的机制。
关于症状,在我们的研究中,观察到的任何迹象,可以被描述为利什曼病的特征,因为消极的狗也显示相同的症状为积极的,消极的狗的不同症状恢复。减肥是最常见症状中观察到的积极的和消极的狗。在所有的动物皮肤损伤被发现和值得指出,所有的症状动物无鞭毛体在耳朵和腹部的皮肤。这些观察表明,狗即使没有皮肤损伤,可以代表一个重要的白蛉的感染来源。
淋巴结文化也观察到其他作者(26,27]显示不是一个有用的诊断方法,是不可能孤立的寄生虫甚至狗耳朵皮肤无鞭毛体,肝、脾痕迹,可能是因为文化污染发生在函数的字段条件不足。
确认
这项工作获得金融支持CNPq / Fiocruz-Papes IV, Oswaldo Cruz Faperj-APQ1和网页。作者也感激技术支持马科斯安东尼奥多斯桑托斯利马和瓦格纳Lanca Passos。