文摘
包虫病的特点是幼虫的长期共存棘球绦虫granulosus和它的主人没有有效的排斥。先前的研究表明一氧化氮(NO)生产(体内和体外)在包虫病。在这项研究中,我们调查了直接在体外的影响没有物种:亚硝酸盐(),硝酸(和过氧亚硝基)protoscolices已经可行性和层包虫囊肿完整24小时和48小时。我们的结果显示protoscolicidal活动和治疗后24小时、3小时320米和80M分别。退行性效果观察胚和层压层。没有物种的体外作用的比较已经表明,可行性细胞毒性比。相比之下,没有效果。这些结果表明可能的参与和在antihydatic行动和点这些代谢物的疗效scolicidal代理。
1。介绍
包虫病是一种慢性感染的医学和兽医重要性引起世界性的幼虫阶段寄生platyhelminth棘球绦虫granulosus。这种疾病在一些国家被认为是重现人畜共患病(1在阿尔及利亚)和流行;它被认为是疾病必须声明的国家公共卫生研究所的高级警官。尽管手术是主要的治疗方法,医疗和经皮治疗近年来被使用(2]。目前,苯并咪唑化合物(阿苯达唑和甲苯咪唑)用于治疗(3]。经皮注射治疗和与scolicidal化合物已成为另一个成功的手术,因为在最近的研究结果4,5]。
幼虫形态发展成大的充满液体的囊肿在中间宿主。包虫囊肿由两层组成:一个内心生发层和外部富含碳水化合物的叠层非细胞层保护的寄生虫宿主免疫细胞(6,7]。生发层(GL)是细胞。它给通过出芽和区分感染protoscolices(已经)。包含这些幼虫的囊肿形成被认为是肥沃的。包虫囊肿壁是重要的建立和持久性的感染(8]。
一氧化氮(NO)已经假定在宿主防御机制中发挥作用在包虫病9,10]。我们以前生产的在血清和囊性液体从病人携带不同的囊性本地化。此外,人类诱导没有合酶(NOS2)表达在包虫病患者的肝脏活检中发现了免疫化学方法。NOS2表达观察葡萄胎患者的肝细胞和Kuppfur细胞(9,11]。
没有是一个重要的监管机构和中介在许多生理和病理生理活动。它是合成了一系列NOS亚型使用精氨酸作为底物。它已经涉及神经传递,血管舒张,和免疫调节12]。刺激,激活NADPH氧化酶和NOS2有助于macrophage-mediated病原体杀死(13]。因此,激活巨噬细胞表达NOS2产生大量的没有。这么高的生产已经涉及到几种细胞抑制剂和细胞毒性行动的病原体,由于没有激进的本质。没有非常被动的对氧气;它产生亚硝酸盐()和硝酸()作为终端产品。同时生产超氧化物阴离子(),没有结合扩散控制利率产生过氧亚硝基()[14]。它比没有更强的氧化剂和细胞毒性中介或独自过氧化物(15]。过氧亚硝基氧化和硝酸盐的各种目标;这是得到太多的关注潜在的中介没有细胞毒性的影响。的贡献微生物杀死已经提出。杀寄生虫药没有被报告对原生动物寄生虫的影响(利什曼虫、锥虫属Entamoeb一)和后生动物包括裂体吸虫属、小束和棘球绦虫。
尽管没有在宿主反应的生产大肠granulosus感染,直接的影响没有代谢物(,,)寄生虫生存不了。本研究的目的是测试这些代谢物的疗效的可行性已经和人类体外包虫囊肿的囊壁。已经被使用的文化系统和囊壁,我们调查的影响(,,)已经被皮和囊壁的完整性。的形态变化是重要的指示代谢物的功效,因为包虫囊肿壁构成macroparasite和主机之间的接口。孵化的时间定义的一个重要因素敏感性体外寄生虫的代谢产物的作用,可能是一个有前途的protoscolicidal代理包虫手术。
2。材料和方法
2.1。寄生虫的材料
十二个大肠granulosus包虫囊肿来源于葡萄胎患者进行肝和肺囊肿手术后消灭。所有患者承认穆斯塔法Bacha医院(外科学系、阿尔及尔、阿尔及利亚)。患者的平均年龄年。他们不存在其他寄生或细菌感染。所有的患者接受药物治疗。所有科目都是知情同意在目前的研究中,旨在根据当地伦理工作组的指导方针。囊肿生育率由自由的存在决定protoscolices(已经)囊性流体。其他参数的囊肿生育被视为如层压层的白色颜色和清澈的囊性流体。
2.2。过氧亚硝基合成
过氧硝酸盐合成亚硝酸钠和过氧化氢使用淬火流方法和化验spectrophotometrically 302海里(消光系数= 1670 )。解决过氧亚硝基被储存在°C (14,16]。
2.3。Protoscolices准备
无菌解剖后完好无损hydatic囊肿,液体被离心机在3000 rpm 30分钟在4°C。颗粒包含已经被resuspended在PBS(磷酸缓冲盐)pH值7.2然后调整,调整到103已经/毫升RPMI1640中补充了15毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值7.5,2毫米谷氨酰胺,10%胎牛血清。实验前的可行性已经得到了证实。这是由肢体动作倒生的显微镜下观察,并与0.1%的亚甲蓝活体染色。所有样本的可行性98%的文化。
2.4。囊肿层制备
生发层(GL)与层压层(LL)切割从开放完整的囊肿。部分这些膜在PBS剪切和冲三次pH值7.2。生发层是仔细的刮层压层。
2.5。Protoscolices的囊壁的文化
Protoscolices的生发和层压层在RPMI1640培养介质补充10%胎牛血清(FCS)。他们培养没有和亚硝酸钠浓度的增加(NaNO的存在2)、硝酸钠(NaNO3过氧亚硝基)和钠(NOONa)(20、40、80160和320M)在37°C的环境潮湿大气中5%的有限公司224小时和48小时。显微镜下观察形态学变化与倒生的阶段。
2.6。统计分析
已经被为每个孵化条件文化进行了一式三份。所有的值表示为意味着±标准差(SD)。数据分析是使用原点Pro.Lab执行。意味着之间的差异进行分析,方差分析(方差分析)。值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。一氧化氮代谢产物对Protoscolices(已经)可行性
硝酸不是在已经被有效可行性。这个观察证实了统计研究(方差分析)24小时和48小时而控制文化。死亡率之间没有显著差异存在的培养已经被硝酸浓度增加24小时()和48小时((表)相比,控制文化1)。的形态已经被治疗24小时后仍然很大程度上undisrupted。显微镜检查显示,大部分已经被认为仍然是可行的;他们表现出不同的动作和守恒conserv细胞膜完整性的钩子,石灰小体。其中,有些是凹入的,其他人则外翻,和吸盘都清晰可见(图1 (c))。这些观察表明的形态演化已经与硝酸培养基尽管治疗。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
培养的形态学方面已经在外源性一氧化氮代谢产物的存在。(一)培养凹入已经被(初始已经生存能力= 98%);(b)培养48小时后已经被孵化没有任何治疗,(c)与320年经过48小时的潜伏期米的后,(d)与320年孵化24小时米的3小时后,(e)与80年的孵化米的,(f)与160年1小时的潜伏期米的。(H):钩子;(CH):钩子的皇冠;(超自然):吸盘;(I.PSC):凹入protoscolices;(E.PSC):外翻protoscolices;(t . PSC):夸张的protoscolices;(R.PSC):收回protoscolices;( ):变更的外皮;(Res):死protoscolices的残留物。 |
已经丧失生存能力在nitrite-treated文化成为24小时后在320年的死亡率米的(表1)。48小时后,我们观察到scolicidal活动受到亚硝酸盐浓度依赖方式的影响。
治疗寄生虫的显微镜检查显示失真的已经被形态和退行性效果。这种效应的特点是能动性与未经处理的已经丢失。我们饶有兴趣地观察肿胀的一些已经和别人的缩进。这tegumental中断有关凹入的两种形式,突出已经被(图1 (d))。变更已经被结构显示外部中断soma(尾地区)与解放的质膜小泡和培养基的石灰小体。自由钩子在培养基的存在表明他们超然和毁灭的外皮(图1 (d))。
显著减少运动性几分钟后观察到的80年文化接受M的过氧亚硝基,已经被生存能力显著影响孵化20分钟后死亡率(100%)(表1)。与40个已经丧失生存能力在治疗后出现过氧亚硝基的M。可行的疟原虫的生存能力降低50%(表1)。
的死亡率已经明显不同治疗寄生虫与不同浓度的过氧亚硝基的孵化24小时后37°C。显微镜检查显示没有运动,我们观察到已经被收回。吸盘消失;他们是不可见的。胎膜残留的存在(鬼膜)表示破坏外皮(数字1 (e)和1 (f))。
3.2。一氧化氮代谢产物的影响(亚硝酸盐和过氧亚硝基)包虫囊膜
孵化孤立的生发层(GL)层压层(LL) 80M的过氧亚硝基显示了一个高细胞毒性效应,改变膜的完整性(图2 (c))相比,亚硝酸盐的作用(图2 (b))。
):变更的膜。(bar = 30米)。未经处理的层压膜(LL)构成的层状层观察显微镜下的倒生的阶段(见图3(一个))。亚硝酸盐的影响观察24小时后的孵化层320m .这些影响的特点是brunishment层显示退行性亚硝酸盐的影响。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
第一个修改相关的细胞毒性作用过氧亚硝基的孵化时间15分钟后出现在80年米的。层状结构也观察到(数据的损失3 (g)和3 (h))。体外研究过氧亚硝基毒性的包虫囊膜过氧亚硝基80显示退行性的影响m细胞毒性作用的特点是强度变暗的生发层的加入层。这些修改取决于两个代谢物的浓度和展览(图的时间3)。
4所示。讨论
细胞毒性的影响没有对包虫囊肿被确定之前调查葡萄胎患者的血清水平和人类囊肿液体(肥沃和不育)(11]。此外,从葡萄胎患者孵化PBMCs干扰素-γ只有有效地杀死已经被体外的10,17]。在目前的工作,没有代谢物的直接影响的比较研究表明,活性氮中间体(RNIs) antihydatic机制发挥重要作用。此外,我们已经观察到是一个最有效和快速scolicidal代谢物的临床价值可能比。因此它可能会使用这个代谢物作为scolicidal代理在可行的手术,以避免传播的风险已经被来自肥沃的液体和生发层,导致继发感染。
基于这些结果,对已经没有生存能力的细胞毒性效应和棘球蚴层显示相关的角色没有在宿主防御棘球蚴感染。我们的结果与大多数研究协议相关的抗作用没有。
内生和外生不一直在抑制细胞内寄生虫的发展包括报道锥虫属,利什曼虫,疟原虫,弓形虫和细胞外的原生动物(痢疾)以及裂体吸虫属(18]。它已经表明,体外诱导细胞凋亡是任何物种痢疾阿米巴并使他们无法生存在仓鼠的肝脏19]。
此外,没有从腹膜巨噬细胞激活和S-nitroso-N-acetylpenicillamine杀死小鼠包虫囊肿的报道棘球绦虫granulosus(20.]。此外,没有从小鼠巨噬细胞激活的杀戮已经被报道棘球绦虫multilocularis在体外(21]。细胞内的表达造成的利什曼虫主要无鞭毛体与生产(22]。有趣的是,治疗皮肤利什曼病的治疗释放药物已经接近[23,24]。
的时间进程和行动,我们的观察表明,过氧硝酸盐是一个快速scolicidal代谢物但亚硝酸盐有缓慢的行动。两个代谢产物对已经被的可行性产生深远的影响。中断的外皮和desorganization钩子的双皇冠与320年孵化24小时后观察到的寄生虫米的;其细胞毒性似乎是一个渐进的过程。显微镜检查的治疗已经显示已经被减少运动性。此外,能动性是一个已经被生存能力的重要特征。细胞毒性的影响没有被检测到肢体动作的寄生虫。在接触到不,与象皮病马来和Onchocera linealis在30分钟内显示减少运动性(25]。这些结果表明功能已经被代谢的改变。
事实上,寄生虫的失活酶似乎没有相关生理功能的抑制导致寄生虫在宿主体内生存和生存能力的影响。抑制没有被提出解释的抑制细胞生长的影响锥虫属brucei gambiense和t . b . brucei。(26- - - - - -28]。
本研究首次展示的体外细胞毒性效应棘球蚴的生存能力已经和囊性层)。该阴离子可能涉及antihydatic体内机制。然而,最近的研究证明了介导的利什曼虫amazonensis无鞭毛体杀死体外(29日]。更多的,可以减少绵羊的肝吸虫的寿命吗肝片吸虫和Dicrocoelium dendriticum在体外(29日]。是一个强大的氧化剂与许多病理生理过程。的功效决定其反应性和扩散性。在这项研究中,引发一个戏剧性的影响已经被可行性与内膜完整性的损失。治疗已经有80米的阴离子显示,快速退化性变化暗示其实用性在手术scolicidal代理(数字1 (e)和1 (f))。诱导细胞损伤通过触发的基本细胞死亡途径,细胞凋亡或坏死。启动脂质peroxydation [30.),导致DNA断裂(31日),与硫醇反应(30.]。过氧亚硝基-诱导蛋白质修改包括氧化和硝化。然而,包含氧化还原酶活性过渡金属中心的首要目标是氧化剂(32]。的反应受到当地的pH值和微环境的影响与疏水膜隔间有利于硝化和水环境有利于氧化。具体来说,二氧化碳与过氧亚硝基的反应生成碳酸激进的阴离子和二氧化氮,其协调一致的行动导致硝化酪氨酸残基形成硝基酪氨酸,有毒的标志没有途径。硝基酪氨酸说明了网站的检测过氧亚硝基生产和氧化应激,提供毒性的证据不33]。
体内leishmanicidal过氧硝酸盐的影响的研究表明,硝化/寄生虫氧化膜蛋白可能是一个重要事件。膜蛋白的功能改变可能影响细胞内离子组成和交通基本代谢物,所有的过程细胞存活的关键(29日]。
这些数据结合我们的研究结果表明可能体内的生产在包虫病,可能与宿主防御机制大肠granulosus。
这没有物种可能是主要的体内巨噬细胞产生的细胞毒性效应。为此,相关调查的细胞毒性效应这个阴离子体内在包虫病。
除了对已经被它的功效,也表现出相当大的破坏性影响包虫囊膜的特点是黑暗的囊性层。生发层的大肠granulosus一直显示也是容易亚硝酸盐。相比这两个代谢产物的细胞毒性影响,我们区分过氧亚硝基细胞毒性大于亚硝酸盐。经过三天的孵化的囊性的墙壁,我们观察残留的生发层培养基分离层压层。
生发层的分离(基准线)层压层(l)剥夺了第一个源营养基本已经被开发,这有助于nonviability包虫囊,这可能是一个治疗方法。前瞻性,没有捐赠者的引入可以帮助患有囊性包虫病接受改善化疗包虫的吸收。
总之,通过这种比较研究,我们在这里提供多个证据的作用没有和许多其他派生的激进分子在免疫反应大肠granulosus。生产没有物种通过激活巨噬细胞可能有能力阻止传播的一个重要的角色大肠granulosus感染。这里描述的结果表明可能的体内的生产及其参与antihydatid机制。除了没有的有益作用,它可以损害宿主器官携带包虫囊肿。需要更多的人类体内调查定义过氧硝酸盐是细胞毒性的机制。
缩写
| 没有: | 一氧化氮 |
| 干扰素-: | 移行细胞 |
| PBMCs: | 外周血单核细胞 |
| 已经被: | Protoscolices |
| : | 硝酸 |
| : | 亚硝酸盐 |
| : | 过氧亚硝基 |
| NOS2: | 一氧化氮synthase-2 |
| 大肠granulosus: | 棘球绦虫granulosus |
确认
作者要感谢的技术和手术人员Mustapha-Bacha阿尔及尔医院提供囊肿样本。特别感谢Hamrioui教授。他们感谢所有自愿参与本研究。他们感谢Wietzerbin博士有益的讨论。这项工作是支持的资助安德烈斯(国家科学研究开发机构)。