文摘

蜱虫疫苗的使用在控制蜱虱传播疾病在蜱虫综合管理已被证明是有效的格式。的控制h·a·anatolicum,Bm86直接同源的h·a·anatolicum是克隆和表达融合蛋白在吗大肠杆菌作为大肠杆菌-pETHaa86。rHaa86的分子量是97 kDa 19 kDa融合标签的硫氧还蛋白的蛋白质。表达蛋白免疫和疫苗功效特征评估。经过120小时的挑战,只有26%的蜱虫可以成功免疫动物。除了在喂养比例显著减少,显著减少49.6毫克;美联储的女性相比,体重的雌性美联储控制动物被记录。产卵后,显著减少68.1毫克;美联储鸡蛋质量的蜱虫免疫动物相比,美联储蜱虫控制动物。减少数量的女性,平均体重的鸡蛋,成年女性和功效的免疫原是73.8%,31.3%,15.8%,和82.3%,分别。结果显示的可能性发展基于rHaa86疫苗蜱虫物种的综合控制的一个组成部分。

1。介绍

three-host蜱虫,Hyalomma a anatolicum,是分布最广泛的蜱虫种印度——牛、水牛、绵羊和山羊和传输焦annulata, t . buffeli lestocardi(t .腋毛)[1,2]。牛的建立分布在印度热带theileriosis高危人群和牛和水牛是有据可查(3]。最近,控制成本蜱虫的寄生虫传播大致估计在4.415亿美元/年。除了的矢量势蜱虫物种,蜱虫的重要直接影响畜牧业生产需要开发蜱虫控制方法对环境安全的方式。

在印度蜱虫控制重点是重复直接杀螨剂的应用主机的动物。在大多数情况下,应用程序的杀螨剂后重复21到30天。杀螨剂的方法有一定的局限性包括发展阻力,环境污染,食品中农药残留的产品和开发新农药的费用(4]。其他蜱虫控制方法显示了承诺是使用anti-tick疫苗(5- - - - - -7]。尽管有一些问题与商业化对牛蜱蜱虫疫苗开发,牛蜱属microplus(7),目前的蜱虫疫苗的成功(TickGARD +和Gavac)在过去的十年里已经清楚地展示了他们潜在的蜱虫控制作为一种有效的方法8]。

在的情况下h·a·anatolicum,一些潜在的抗原识别和测试实验挑战的侵扰,并回顾了Ghosh et al。(9),但工作没有达到在疫苗的发展水平h·a·anatolicum。另一方面,尽管Bm86已经报道的同系物h·a·anatolicum(10),不等的BM86基础疫苗效力有限对实验的挑战h·a·anatolicum。最近,Bm86直接同源的h·a·anatolicum已被克隆和表达吗毕赤酵母属pastoris发现和预防同源挑战侵扰(11]。然而,重组蛋白的表达很低。目标提高表达水平和减少净化的台阶,目前实验进行克隆和表达Bm86直接同源的h·a·anatolicum在原核表达系统和分析对同源蛋白质表达的保护效果的侵扰,挑战。

2。材料和方法

2.1。兔子

新西兰白兔,重约1 - 1.5公斤从实验动物资源获得部分IVRI, Izatnagar。他们保持在消毒的笼子里的小动物寄生虫学的划分和喂养随意。兔子被用于饲养的焦annulata免费的h·a·anatolicum并提高特定的抗体。

2.2。杂交牛

13名男性杂交种小牛(牛Xb . indicus)十到十二个月大的时候被用于这项研究。所有这些杂交种小腿都采购了3 - 4个月时的畜牧管理部门研究所和维护在蜱虫动物饲养设施部门的证明。蜱虫幼稚状态的实验动物。实验动物是维护按照委员会批准守则的控制和监督的目的动物实验(CPCSEA),印度的法定的身体。

2.3。实验室饲养的t . annulata感染免费h·a·anatolicum

的同质群体h·a·anatolicumIzatnagar隔离在昆虫学实验室维护部门的寄生虫学过去15年中(12]。简单,健康新西兰白兔被用于喂养的蜱虫。为了避免应激对动物,6 - 8只兔子被维护的同时,两只兔子被利用为每个喂养周期。

有关大型动物的喂养,杂交男性小腿保持诞生初期的蜱虫,飞摆脱寄生虫学部门的证明。的t . annulata自由状态的小腿被定期检查确定染色染血涂片。

的塞得满满的h·a·anatolicum蜱虫被收集、识别和保持在蜱虫饲养玻璃管mouslin布覆盖着的橡皮筋。保存在玻璃管温度和85%相对湿度(RH)产卵。完成产卵后,死亡的女性h·a·anatolicum从玻璃管中删除。幼虫吃新西兰白兔幼虫蛹(不毛之地的兔模型h·a·anatolicum表现为2-host蜱虫(12]。过饱的女神们收集和维护。刚孵出的成年人都得不到支持的7天,被释放t . annulata免费的雄性杂交小牛。耳袋是日常检查,收集美联储成年人,单独清洗,重、标记和玻璃管和保持温度和85% RH产卵。

2.4。Haa86 rt - pcr扩增的基因

鸡蛋的总RNAh·a·anatolicum是孤立的使用总RNA RNeasy隔离设备(试剂盒)。引物是自我设计的基于序列信息发布(AF347079)。正向引物(HF2)设计BamHI限制站点(HF2 -九GGATCC TTG TTC GTT GGC GCT ATT TTG CTC)和反向引物(HR2)设计KpnI和XbaI (HR2 -CCC GGTACC TCTAGA TGC AAC GGA GGC GGC CAG TAA CAG GA为随后的克隆PCR产品)。一个50L成立反转录反应。最初,25.0L的总RNA (20在RNA存储缓冲区和0.5 g)L的HR2(100点)涨跌互现的DEPC 0.2毫升PCR管和保持在治疗10分钟。上述混合物10L Mu-MLV逆转录酶的缓冲(5 x)(表达载体),2L核糖核酸酶的抑制剂(表达载体)和10(2台)L的核苷酸(10毫米)添加和保存5分钟。互补脱氧核糖核酸合成的2L (Mu-MLV逆转录酶(400台)(表达载体)1小时。逆转录酶酶灭活,使反应混合物10分钟。一个25使用10 x L PCR反应是建立PCR缓冲(MBI-Fermentas)包含2.5毫米三HCl的pH值8.3,2毫米MgCl₂,10毫米每个核苷酸,20点每个引物的HF2和的HR2 4L的第一链cDNA解决方案和2单位的热态启动Taq DNA聚合酶(MBI-Fermentas)。混合物中孵化thermocycler (ptc - 200,乔丹研究)以下循环条件:初始变性5分钟,进一步30周期1分钟,1分钟,2分钟和最后一个扩展10分钟。

2.5。Haa86基因的克隆和测序

PCR产物(2g)和表达载体pPROEXHTb(生命技术)受到双重限制性内切酶消化和BamHI XbaI6小时。消化PCR产物和质粒向量解决在1%琼脂糖和筛选了使用向导SV从凝胶凝胶和PCR清理系统(Promega) 50L核酸酶游离水。一个5L (PCR筛选了消化产品和质粒向量解决1%琼脂糖以及DNA梯100 bp + (MBI-fermentas)和DNA的浓度计算SynGene的微凝胶的文档系统。结扎反应成立10 x结扎缓冲区(10毫米Tris-HCl, pH值7.5,10毫米MgCl₂0.5毫米,0.1毫克/毫升BSA, ATP), 200 ng消化向量(pPROEXHTb), 70 ng消化PCR产品和1单位T4 DNA连接酶和孵化在晚上。结扎DNA转移到主管大肠杆菌DH5细胞治疗0.1 CaCl₂通过热休克方法和阳性克隆筛选基于蓝色/白色殖民地上的选择和氨苄青霉素抗性(13]。重组殖民地经殖民地消散,菌落PCR和质粒提取和限制性内切酶消化。1965个基点Haa86基因的质粒是指定为pPROHA86F。的链插入被dideoxi链终止测序方法。的核苷酸序列(ORF)信息Bm86直接同源的h·a·anatolicumIzatnagar隔离(加入。EU665682)及其推导氨基酸序列与现有的序列信息即。,Bm86直接同源的h·a·anatolicum卢迪亚纳隔离(来自旁遮普州)(加入。和Bm86 AF347079)b . microplus(澳大利亚)(加入。M29321)使用基因工具版本1.0。

2.6。去除信号序列和序列c端锚定PCR

假定的信号序列和c端锚定的ORF序列被删除Haa86 PCR。正向引物(HF3)是自我设计EcoRI限制网站(GAATTC) (HF3 -九棉酚TTC GGT AGA呕吐得到手枪TTC GTG TG)和反向引物(HR4)设计XhoI (CTCGAG) (HR4 -CCC CTC GAG TGT TGC TTC TGT AGT TGT TGC TTC T为随后的克隆PCR产品)。一个25使用10 x L PCR反应是建立PCR缓冲(Ambion)包含2.5毫米三HCl的pH值8.3,2毫米MgCl₂,10毫米每个核苷酸,20点每个引物的HF5 HR3, 1.5L(1: 50稀释pPROHA86F DNA(模板),2单位SuperTaq DNA聚合酶(Ambion)。这个混合物是孵化与以下thermocycler循环条件:初始变性5分钟,进一步30周期1分钟,1分钟,2分钟和最后一个扩展10分钟。

2.7。在原核表达载体克隆PCR产品pET32a (Novagen)

PCR产物和向量pET32a消化EcoRI和XhoI。消化DNA的结扎,转换和克隆大肠杆菌BL21pLys细胞(Novagen)。重组或转基因大肠杆菌基于氯霉素和氨苄青霉素抗性BL21pLys被选中。造成质粒构建被指定为pETHA86和克隆被指定为大肠杆菌——pETHA86.PNovagen。的存在Haa86基因重组质粒提取的重组大肠杆菌证实了克隆与限制性内切酶消化EcoRI和XhoI释放插入。随后,插入的存在也是PCR证实了殖民地。

2.8。表达的研究

选择克隆出了3 - 4个小时的氯霉素(34和氨苄青霉素(100 g / mL)g / mL),直到文化达到600纳米波长的吸光度值高于0.6。文化与1毫米IPTG诱导和文化发展为6 - 7小时后用IPTG诱导。样本将在10000 X g / 10分钟和上层的解决在8% sds - page蛋白MW标记(班加罗尔Genei)。最好的表达克隆(s)是处理供Ni-NTA亲和层析纯化的蛋白质。诱导文化在10000 X g /颗粒状10分钟。颗粒的混合裂解缓冲(8 M尿素,100毫米不₂阿宝₄10毫米三羟甲基氨基甲烷pH值8.0)和孵化液连续摇晃下1小时。溶菌产物是在10000 X g / 10分钟。上层清液的添加与Ni-NTA树脂(试剂盒)100L / 1毫升溶解产物,10 - 20毫米咪唑和允许绑定。混合物被加载到小塑料列(Amersham)和洗了洗10毫升缓冲区(8 M尿素,100毫米不₂阿宝₄10毫米三pH值8.0)。rHaa86被筛选了与洗脱缓冲(100毫米不₂阿宝₄10毫米三8 M尿素,pH值4.5)。

2.9。测定蛋白质浓度的微

的彩色带强度rHaa86 [14)是与乐队相比强度BSA解决不同浓度的sds - page。Syngene凝胶的凝胶是解决存储文件系统和Syngene软件被用于比较蛋白质浓度测定。

2.10。免疫印迹和Anti-histidine Anti-Bm86抗体。

适当的浓度减少条件下rHaa86解决8% sds - page和转移到PVDF膜。膜条分别与孵化主要抗体(鼠标anti-penta组氨酸免疫球蛋白(试剂盒)稀释1% BSA抗体和兔anti-Bm86(超免疫血清)稀释在PBST 1%脱脂牛奶在室温下2小时。洗后五次在PBST条孵化在二级抗体(Anti-mouse IgG - HRPO (Santa Cruz)稀释1% BSA PBST和山羊anti-rabbit IgG-ALP(σ)分别在1%脱脂牛奶稀释PBST在室温下2小时。膜条再次洗PBST和随后孵化适当的基质溶液中(10毫升三羟甲基氨基甲烷盐液pH值(7.6)6毫克轻拍10L 30% H₂O₂碱性磷酸酶和10毫升缓冲区(pH值9.5)100年L电视台股票的解决方案100年L BCIP原液,职责)。将膜条的反应是停止蒸馏水。

2.11。免疫和挑战试验

杂交小牛(),年龄约7个月,随机分为两组每组由五个动物。冷冻rHaa86与相同体积的佐剂乳化彻底(888年Montanide矿物油10%)。所有的动物注射组400个克rHaa86肌内0天,400人g在30和100天g在60天。相应的控制给动物注射相同体积的佐剂在同一天。每个小腿(组1),2)挑战97 postimmunization五十天的未感染的成年人两性(男性和女性由耳袋方法比)。以下职位挑战昆虫学参数记录(15]。

(我)过饱的成年女性蜱虫的数量降至每只动物被记录。(2)塞得满满的蜱虫被单独重下降。(3)塞得满满的女蜱虫产卵和孵化鸡蛋质量是衡量。(iv)DT %100 (1NTV /全国过渡委员会),DT %是雌性的比例减少,NTV,雌性的数量下降的动物组1和NTC,雌性的数量从2组的动物。(v)做%100 (1PATV / PATC), %的百分比减少平均重量是鸡蛋,PATV鸡蛋的平均体重的女性喂动物组1和PATC鸡蛋的平均体重的女性组2的动物。(vi)%博士100 (1PMTV /摩托车),%博士是减少成年女性的平均重量百分比,PMTV成年女性的平均体重下降的动物组1,和摩托车的成年女性的平均重量从第二组的动物。(七)E %100 (1(阴极射线管CRO), E %是抗原的功效,CRT是成年女性的数量减少NTV / NTC, CRO在产卵能力减少,PATV / PATC (PATV,鸡蛋的平均重量的蜱虫喂养的动物组1)/ PATC,鸡蛋的平均体重的女性组2的动物。

2.12。酶联免疫吸附测定

血液样本采集无菌的小腿前后蜱虫挑战时期正则区间。血清分离、整除和存储。最初棋盘滴定法被用来优化试剂。优化后,筛选了抗原用于microtire板(Nunc)的浓度4g / mL,保存在一夜之间。与PBST洗涤三次后,5%脱脂牛奶的井被封锁PBST rt,三洗后2小时,主要是稀释的抗体1% PBST和被用于quadriplicate井和板保持在RT 2小时。洗后,二级抗体(anti-bovine过氧化物酶共轭,σ化学公司,美国)的稀释在1% PBST 2小时。反应停止了50L盐酸3 n /好,吸光度是记录下微型板块ELISA读者(Tecan-Sunrise、奥地利),平均OD_492年一式三份的样品。

2.13。统计分析

显著差异的平均值免疫测定和控制动物使用学生的以及(16]。

3所示。结果

3.1。细菌表达载体建设与Haa86基因片段

Haa86基因片段的大小放大通过rt - pcr引物HF2的HR2 1965个基点。经过确认的基因片段克隆到获取构造pPROHA86F pPROEXHTb向量。序列的长度从144个基点和96个基点最终被删除的ORF Bm86直接同源的h·a·anatolicum通过执行PCR引物HF3和HR4。缩短Haa86 ORF的大小1755个基点是克隆表达载体和质粒构建结果被指定为pETHA86和克隆被指定为大肠杆菌-pETHA86。的存在Haa86基因重组质粒提取的重组大肠杆菌证实了克隆与限制性内切酶消化EcoRI和XhoI释放插入。公布了1.755个基点基因限制性内切酶消化反应(图1)。重组Haa86表达在体外使用pET-32a表达载体amd大肠杆菌应变Bl21 (DE3) pLysS表达系统。亲和纯化rHaa86迁移97 kDa蛋白sds - page 8%,符合预期的分子质量考虑到产生的重组蛋白融合表达载体19 kDa硫氧还蛋白的蛋白质(图2)。根据Ni-NTA树脂、净化rHaa86似乎超过98%纯在sds - page。

探索蛋白质转移时用鼠标antipenta组氨酸抗体,rHaa86约97 kDa的anit-histidine抗体反应强烈(图3)。同样,anti-Bm86 rHaa86蛋白抗体反应强烈。没有注意到当控制兔血清反应被用来探测包含rHaa86 PVDF(图4)。积极的信号也获得较低分子蛋白质,比假定的一个可能的次品,rHaa86。这个结果证明了自然Bm86的交叉反应b . microplus及其直接同源h·a·anatolicum。

3.2。分析序列的信息

身份的Bm86直接同源的h·a·anatolicumIzatnagar隔离(EU665682)h·a·anatolicum卢迪亚纳隔离(AF347079) 99.3%和98.7%在核苷酸序列和推导的氨基酸序列层面上,分别。Bm86的身份b . microplus(澳大利亚)(M29321) 76.1%和60.9%在核苷酸序列和推导的氨基酸序列层面上,分别。8个氨基酸替换观察推导氨基酸序列的Haa86相比Ha98序列。在八、五个氨基酸替换非保守的。20、47、290、421和421位氨基酸的Haa86取代了谷氨酸(E)、甘氨酸(G),赖氨酸(K),丙氨酸(A)和天冬氨酸(A),而不是赖氨酸(K),精氨酸(R)、天冬酰胺(N),谷氨酸(E)和甘氨酸(G),分别。

3.3。饲养和繁殖性能h·a·anatolicum

在所有的动物中,7-10-days-old得不到支持的成年人在48小时内开始在所有的动物喂养他们的释放。经过120小时的挑战,平均数为7.41.9女性蜱虫从第1组的动物,同时下降28.35.0蜱虫从动物的组2和蜱虫的数量的差异从动物的免疫和对照组发现统计学意义()。一个重要的()的体重平均减少49.6毫克蜱虫喂养组1动物相比,美联储蜱虫组2动物。产卵的蜱虫保持下降和平均减少68.1毫克()蛋质量了美联储蜱虫免疫动物相比,蜱虫喂养组2动物发现(表1)。免疫(DT %)的直接影响女性的数量是73.8%。其他昆虫学参数做%,%博士和E %计算为31.3,15.8和82.3%,分别。

3.4。抗体反应在小牛

在第1组动物,一个相当高的anti-Haa86抗体反应相比,组2动物被发现后第一次增加和抗体反应达到峰值124天的第一次免疫(dfi) ()。挑战的时候(97 dfi),小牛的抗体反应组1显著增加()和anti-Haa86抗体干扰的喂养和生殖效率蜱虫免疫动物(图4)。直到129年dfi抗体反应是保持在一个相当高的水平。

4所示。讨论

在我们的不断努力开发疫苗h·a·anatolicum进展,确定本地蛋白质疫苗潜在的(9]。最近,Bm86直接同源基因h·a·anatolicum(Haa86)已经被克隆在pBluescript II KS随后的表达p . pastoris表达载体GS115 (his4)pPICZ(11]。阅读框的结构表达盒由N个终端因素之后,1799个基点Haa86基因与pBluescript II KS 26日英国石油公司(从pPICZ序列)和73个基点这包括cmyc表位和6 X组氨酸标签。编码序列的总大小是1872个基点。线性化pPICZHA86免费结束同源AOX1启动子区域,AOX1转录终止序列p . pastoris,以帮助指导集成的表达盒AOX1的轨迹p . pastoris基因替换的站点特定的同源重组导致内生AOX1结构基因。的重组Haa86甲基热带酵母中表达成功,但成功的净化p . pastoris表示rHaa86 Ni-affinity色谱法。rHaa86的净化是利用蛋白质的颗粒性质的净化p . pastoris对一些修改(表示Bm8617,18]。

虽然蛋白质表达GS115成功(his4)pPICZ表达水平并不令人满意。可能GS115应变不适合Haa86基因的表达。类似的问题是与其他寄生虫基因即指出,变速装置锥虫属evansi。此外,许多步骤即,中断,离心、洗涤、萃取、重折叠、降水和超滤参与净化过程。在漫长的净化过程中大量的蛋白质已经丢失,最终复苏相当低。在目前的实验中,rHaa86蛋白表达融合蛋白,被亲和色谱法纯化涉及最少的步骤,因此在处理过程中损失最小化。表达的程度超过了40%p . pastoris系统。除了最小的步骤在净化过程中,净化协议给相对更高层次的净化(超过98%)比以前已经完成(11]。经济复苏的百分比rHaa86表示大肠杆菌是相对较高(3.0毫克/升)比吗p . pastoris表达的蛋白质(0.8 - -1.0毫克/升)11]。

识别的rHaa86 anti-histidine抗体在免疫印迹显示rHaa86其完整的表达。anti-Bm86的反应与rHaa86表示多克隆抗体交叉反应的本质与Haa86 Bm86。Saimo et al。19]报道anti-Bm86抗体的交叉反应Ra86昆虫细胞表达系统(Bm86同系物扇头蜱属appendiculatus)。这些研究表明保护顺序Haa86之间的抗原表位,Bm86 Ra86。

本实验是第二个试验使用重组抗原的免疫和挑战h·a·anatolicum,rHaa86。因此,昆虫学参数与Bm86疫苗的免疫试验(Gavac)b . microplus和h·a·anatolicum在首次免疫试验和结果。拒绝百分比、繁殖指数、DT %和E %的rHaa86对成人免疫动物h·a·anatolicum在本质上是高度鼓励。的E % Gavac不同毒株的疫苗b . microplus显示,51%到91%。在测试b . microplus应变,一半的菌株都显示E % 51至60和菌株都显示72年至91年的一半。这些结果挑战接种小牛b . microplus幼虫(18]。在目前的实验中,72.0%的功效是通过挑战接种小牛的成年人h·a·anatolicum。本研究的E %值下降的范围内不同实验使用基于Bm86疫苗。的DT % Gavac不同毒株的疫苗b . microplus是9%到74%。在十株,只有两个菌株表现出DT % 50%以上。获得73.8%的较高DT %在目前的实验是非常鼓励和商业化的范围内下降疫苗Gavac [18]。

当immunoprotective糖化的属性和nonglycosylated rHaa86比较,观察到DT %, %博士做%和E %的蜱虫喂养动物免疫与糖化Haa86 58岁9日5 - 61.6%,分别在相应的减少比例的生物参数的蜱虫喂养动物免疫nonglycosylated rHaa86分别为73.8,15.8,31.3和72.0,分别。结果表明,糖基化提供重要的保护并不重要h·a·anatolicum。Bm86抗原,糖基化,这可能代表了大约三分之一的原生蛋白质、高免疫原性,但似乎并没有重要的保护性免疫(20.]。重组Bm86,是否表达大肠杆菌、昆虫细胞或p . pastoris似乎是一样有效的本地抗原(21]。相比之下,李et al。22)报道,保护性的破坏活动强烈表明,高碘酸盐治疗所有保护是由于碳水化合物抗原表位。可能会得出结论,糖基化的重要性保护抗原性需要在案件的基础上评估。

昆虫学参数的显著减少高水平的蜱虫喂养组1动物相比,美联储蜱虫控制动物有直接影响的人口减少蜱虫物种在环境中,进而肯定会减少蜱虫负载的动物。

确认

衷心感谢是由于生物技术,印度政府提供财政支持。实验室工作人员提供的技术支持(Laxmi拉尔先生和库马尔)昆虫学实验室的寄生虫学部门的高度认可。