文摘
大肠杆菌是一个共生的细菌和第一个细菌在新生儿出生后的消化道。它的特点是伟大的多功能性和代谢的灵活性,允许其生存在不同的细分市场。本研究旨在分析的多样性大肠杆菌肠道菌群的菌株分离从0到5岁儿童的公社Abomey-Calavi在贝宁。为了这个目的,一个描述性和分析横断面研究。总共135份粪便样本收集Abomey-Calavi儿科诊所的。微生物分析根据标准微生物学分析技术。的分子特征大肠杆菌是由调查八个基因(dinB、icdA pabB, polB, putP, trpA, trpB,和uidA)使用PCR技术。结果表明,粪便样本的平均加载速率为3.74×107TAMF CFU / g。一共有7种细菌被确定在不同比例:葡萄球菌spp(55.36%),大肠杆菌(14.29%),克雷伯氏菌ornithinolytica(12.5%),沙雷氏菌属odorifera(5.36%)和肠杆菌属aerogenes(5.36%)。有趣的是,孤立大肠杆菌提出了一种抵抗100%,头孢噻肟和aztreonam。此外,95.24%和50%的抗性观察对红霉素和萘啶酸,分别。孤立的分子特征大肠杆菌压力让我们发现另一个分子的分离株内变异。基因编码的酶异柠檬酸脱氢酶(icd)和DNA聚合酶II (polB)被发现在96.30%的孤立大肠杆菌菌株。此外,基因编码酶beta-D-glucuronidase (uid)和DNA聚合酶(dinB)被发现在88.89%的孤立大肠杆菌菌株。有趣的是,81.48%,85.19,92.59%,和100%的孤立大肠杆菌菌株表达了色氨酸合成酶基因编码酶亚基(trpA),脯氨酸通透酶(把P)、p-aminobenzoate合成酶和色氨酸合成酶B亚基革命军(trpB),分别。的多样性大肠杆菌压力反映了监管机制的重要性细菌适应的肠道微生物群。
1。介绍
肠道微生物群是由超过1013细菌,大约相同数量的构成人体细胞(1]。它对应于消化道的微生物和执行三个主要和基本功能:新陈代谢,营养,和国防2]。整个消化道微生物群的多样性和丰富的变化。远端结肠最大细菌丰度达到1011每克粪便细菌(3]。近年来,分析肠道微生物群的组成和功能极大的拓展了新的细菌基因组测序技术的出现。然而,每个人都有一个独特的肠道微生物群的细菌种类和相对比例4]。在成人中,90%的肠道微生物群是由门壁厚菌门和拟杆菌门5]。因此,它是承认大肠杆菌物种属于变形菌门的门不是主要的细菌物种在人类肠道微生物群。大肠杆菌香料代表通常占不到1%的人类肠道微生物组(6]。
一般来说,大肠杆菌涉及物种共生的细菌在人体胃肠道。这包括防止上皮细胞损伤(7),调节宿主脂肪存储(8),刺激肠道血管生成(9]。然而,通过收购和毒性和抗生素耐药性的组合因素,这些通常无害的同桌的菌株可以成为致病,导致各种疾病从肠胃炎extraintestinal感染。在肠道大肠杆菌描述了,六个肠道pathovars主要基于生成的临床症状和病原性因素表示:致肠病的大肠杆菌(EPEC) enteroinvasive大肠杆菌(EIEC) enteroaggregative大肠杆菌(EAgg或EAEC),产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)、弥漫性附着大肠杆菌(DAEC)和肠出血性大肠杆菌(肠出血性大肠杆菌)10]。Extraintestinal致病性大肠杆菌(ExPEC)菌株是常见的病原体,导致感染的变量(严重程度11]。
系统学的知识菌株有助于识别潜在的毒性和临床结果。ExPEC毒性因素通常分为群岛与致病性相关(12]。致病性ExPEC属于系统组B2菌株,在较小程度上,D组。相比之下,同桌的隔离被分配到组A和B1。PCR常被用来评估系统组(13]。该方法的精度分配压力根据分子特征是正确的系统组好(14]。
基于文化的传统特征,(15),约占30%的微生物在显微镜下观察和枚举。全球共餐的肠道细菌物种的多样性将是巨大的。在这方面,分子工具的使用表明,绝大多数的占主导地位的细菌物种中观察到一个人的粪便微生物群(大约80%)是特定于个人(16]。如今,人类肠道微生物群的系统发育评估实质上是局限于占主导地位的分数,和我们的知识占第二位优势的细菌,即。在不到10、现在8每克粪便,可能不完整,仍然局限于可耕种的隔离(15]。隔离和微生物生长的能力在体外在获取知识仍然是一个关键步骤,特别是发展史并不提供信息原位微生物的活性。因此,本研究的主要目的是调查的遗传多样性大肠杆菌菌株分离从0到5岁儿童的肠道菌群在Abomey-Calavi的公社。
2。材料和方法
2.1。取样和样品收集
本研究中使用的样本被随机收集从135年0到5岁的孩子Abomey-Calavi儿科诊所,贝宁。Abomey-Calavi儿科诊所是最大的儿科中心位于贝宁最大城市的人口统计,2017 - 2022。2020年10月和11月间的收集粪便样本,期间的孩子回到学校。所有收集到的135份粪便样本在无菌瓶,事先准备,运送到实验室,在冰(约4°C)。一旦在实验室,所有收集到的样本用于微生物分析部分2.2。1和2.2。2)。在抽样、信息收集使用调查形式。收集的数据包括交货方式、喂养模式(乳房/奶瓶喂养),抗生素的使用、出生,和消化紊乱。
2.2。微生物分析
2.2.1。总需氧嗜中温菌群的枚举
每个收集样本(10克)无菌均质到无菌蛋白胨水(90毫升)。从这个解决方案,一个串行十进制稀释。总需氧的检测和枚举嗜中温菌群(TAMF),稀释10−1到10−3被种在了平皿计数琼脂(PCA)和孵化30°C 72 h。
2.2.2。肠杆菌科的识别
英国伊红甲基蓝琼脂(CM0069 OXOID)被用来隔离肠杆菌科。这种细菌的鉴定是由吲哚试验和Api20 E (bioMerieux、法国)画廊16]。
2.2.3。抗生素敏感性的孤立大肠杆菌
分离到8传统抗生素分子的易感性进行使用扩散法[17]。8抗菌药物(英国Oxoid)测试如下:红霉素(E)、头孢噻肟(CTX)、萘啶酸(NA), aztreonam (ATM), imipenem (IPM)、环丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFX)和诺氟沙星(也)。
2.3。分子识别大肠杆菌菌株
2.3.1。DNA提取
DNA提取所有的孤立大肠杆菌菌株进行改编的方法之后拉斯穆森和莫18]。总之,1.5毫升管包含菌株在12000转离心5分钟。丢弃后上层清液,500年μl无菌蒸馏水的细菌颗粒。混合物加热15分钟在95°C和离心5分钟在12000 rpm。获得的上层清液被找到在新管,和500年μl绝对乙醇添加之前在12000转离心5分钟。DNA颗粒悬浮在50μl无菌蒸馏水和维持在4°C。
2.3.2。的分子特征大肠杆菌
存在的八个基本结构和/或管家基因编码蛋白质用于这种类型的孤立大肠杆菌。因此,八个基因(dinB, icdA、pabB polB、putP trpA, trpB,和uidA)是探索使用提供的引物序列表1(19]。对于每个目标基因,放大反应是25日执行μl包含12.5μl 2 x GoTaq混合(美国PROMEGA);1μl底漆F (10μ米);1μl底漆R (10μ米);和3μl的DNA。PCR扩增程序由一个初始变性(94°C 5分钟);35周期的变性周期(94°C, 45°s);杂交(52°C, 30°s)和伸长(72°C, 30°s);和最后一个伸长(72°C, 10分钟)。
2.4。数据处理和分析
数据编码是使用Microsoft Excel 2013电子表格完成。图垫棱镜8 (GraphPad软件,USA Inc .)被用于制造图。为了描述大肠杆菌物种和基因,27日的存在与否大肠杆菌通过DCA物种在8基因筛选(去趋势对应分析)与素食包(20.]。最后,等级提升分类(HAC)是用于构造组使用R软件(R统计计算的基础,维也纳,奥地利)3.6.1版本。
3所示。结果
3.1。总需氧嗜中温菌群堆大便
表2根据不同的粪便样本显示了细菌负荷分析。总需氧嗜中温菌群平均负载率为3.74×107CFU / g。大便的0-1-year年龄组的儿童更比4-5-year年龄组加载。
3.2。微生物多样性的凳子
观察微生物物种多样性在粪便样本进行了分析。事实上,55.36%的样品被污染葡萄球菌spp。革兰氏阴性的物种被确定在不同的比例,即大肠杆菌(14.29%),沙雷氏菌属odorifera(5.36%),克雷伯氏菌ornithinolytica(12.5%),铜绿假单胞菌(1.79%),气单胞菌属hydrophila(1.79%),沙雷氏菌属plymuthica(1.79%),肠杆菌属坂(1.79%)和肠杆菌属aerogenes(5.36%)。图1显示的频率分离出来的菌株135份粪便样本。
3.3。孤立的革兰氏阴性细菌对抗生素的敏感性
磁化率的大肠杆菌隔离对抗生素显示总耐头孢噻肟和aztreonam,紧随其后的是耐红霉素(95.24%)和萘啶酸(50%)(图2)。阻力最低的是观察与诺氟沙星(20%)、环丙沙星(9.52%)、氧氟沙星(6.67%)。所有的隔离是imipenem敏感。
3.4。的分子变化大肠杆菌菌株
寻找家庭的基因大肠杆菌粪便样本中分离出的菌株允许我们发现另一个分子的分离株内变异。因此,基因编码的生产异柠檬酸脱氢酶(icd)和DNA聚合酶II (polB)被发现在96.30%。此外,该基因编码的合成beta-D-glucuronidase (uidA)和DNA聚合酶IV (dinB)被发现在88.89%。孤立的大肠杆菌菌株从凳子上港基因编码色氨酸合成酶单元(trpA),脯氨酸通透酶(putP) p-aminobenzoate合酶,和色氨酸合成酶单元B革命军(trpB)为81.48%,85.19,92.59%,和100%,分别为(图3)。
DCA分析存在/缺失数据的矩阵进行27大肠杆菌物种(图8基因导致了4组4)。组1 (G1)由2大肠杆菌物种,即E3 E50,特点是dinB和icd基因的存在。组2 (G2)包括大肠杆菌E13和E19 pabB有别于其他的基因。组3 (G3)组成大肠杆菌株样品E34隔绝,E35 E37,出价和由uidA杰出,革命军polB, trpB基因。组4 (G4)的特点是剩下的大肠杆菌菌株putP基因的存在。
4所示。讨论
本研究的总体目标是确定的遗传多样性大肠杆菌菌株分离出0 - 5岁儿童的肠道菌群Abomey-Calavi的公社。本研究表明,14.28%的孩子采样消化障碍。Morali [21)已经提到,消化功能紊乱在孩子们频繁的原因寻求保健(21]。尽管这个频率,病理生理学知识是适度的。一些疾病伴随生理消化成熟,和其他代表适应性反应过度严格的教育过程(21]。
微生物群是指所有的细菌与人类居住和同居,不管他们的解剖位置,在皮肤上,耳道,支气管,阴道腔等。22]。然而,对这些细菌的研究主要集中在肠道微生物群,因为他们在消化道中发现更高的数字。此外,影响机体的生理在消化道似乎是决定性的。1克粪便中有1000亿个细菌,多达我们大脑的细胞(22]。在我们的研究中,平均负载率超过一百三十五(135)样品是3.74×107TAMF CFU / g。
往往很难评估肠道微生物群的多样性。然而,微生物代表粪便的重量的40%左右。因此,粪便菌群,方便和可分析的。它包括一组异构的生活和死亡的细菌和酵母的居民和通过植物的。它常常被视为一个近似反映了肠道微生物群。粪便菌群的分析也可以检测病原体的存在或结肠人口的失衡在消化疾病的起源23]。在我们的工作中,所有的粪便样本分析,55.36%是污染葡萄球菌spp,这也代表的总体污染样品和肠道菌的44.64%。葡萄球菌spp是一个频繁的人类肠道微生物群的共生的细菌。在人类病理学、摄入的毒素产生菌体外的冷藏食品不足可能负责一个简短的消化集(24小时内)。在非常疲惫不堪的设置,multiorgan感染葡萄球菌spp,包括腹泻和/或结肠炎,已经写过(24]。相比之下,证据的急性肠道感染免疫活性的从来都(24]。当葡萄球菌spp特别是,在异常数量吗金黄色葡萄球菌孵化,它可以引起急性水样腹泻,通常伴有呕吐和没有发烧;这些迹象在几个小时内愈合。
大肠杆菌是第二个最孤立的细菌在我们的粪便样本。大量的存在大肠杆菌殖民地的凳子上,不做进一步的澄清,是正常的,并不证明自己治疗。只有使用特定的微生物技术允许致病菌株的鉴定大肠杆菌分为五个pathovars(产肠毒素的致肠病的,enteroinvasive, enteroadherent,和肠出血性)。据王et al。25),有一个异常的存在之间的联系大肠杆菌在肠道菌群和溃疡性结肠炎的发展。在临床常规,只有测试肠出血性大肠杆菌O157H7通过选择性培养基电镀表示出血性腹泻,鉴于这种感染的潜在并发症(26]。然而,大肠杆菌主机提供了一些好处,防止某些病原体如殖民沙门氏菌通过生产等,细菌素。这种细菌相互作用密切共生(27,28]。
的大肠杆菌菌株分离我们的样本显示很高的耐红霉素(95.24%)、环丙沙星(9.52%)、氧氟沙星(6.67%)、头孢噻肟(100%)、萘啶酸(50%)、aztreonam(100%),和诺氟沙星(20%)。虽然我们的研究没有报道许多最近住院或抗生素的使用在儿童志愿者,我们发现很大一部分耐药细菌的粪便菌群。对这些孩子来说,很多人可能受到多个疗程的抗生素由于不受限制的或非处方抗生素的可用性在发展中国家(29日]。这些菌株对抗生素有multiresistance属于不同的家庭,也就是说,β-lactams、氨基糖甙类、氟喹诺酮类原料药、sulphonamides-trimethoprim phenicoles、四环素、喹诺酮类。这multiresistance观察到我们的压力是由于可能存在抗性基因(30.]。这可能是由于不受控制的使用抗菌药物。如此高的多药耐药性的发生率可以明显占上风的替代antibiotic-susceptible微生物在环境中由那些对抗生素耐药(31日]。然而,抗生素的使用,imipenem总活动大肠杆菌隔离。这一趋势也观察到在西班牙Guembe et al。32]。然而,Hashemi et al。33)发现imipenem更高的电阻率约为19%。缺乏抵抗imipenem表明这些分子仍对这些细菌的治疗选择。
我们发现的速度对环丙沙星的耐药性(氟喹诺酮类原料药的家庭)为9.52%,略低于12%的报道在摩洛哥[34在突尼斯[],14%35在法国),12% (36]。此外,需要注意的是,药物,如环丙沙星代表一线抗生素常用的病人没有医疗处方。由于可用的治疗选择是有限的,抗生素控制政策和感染控制措施的实施仍然具有十分重要的意义。我们还发现,50%抗萘啶酸(氟喹诺酮类的家庭)。氟喹诺酮类原料药是最常用的抗生素和社区获得性尿路感染。之间的关系增加处方的喹诺酮类和细菌耐药性的增加被报道在一些国家(37,38]。
这些结果可以解释这些不同种类的抗生素的影响粪便菌群,如其他作者所述39,40]。抗生素压力的主要决定因素的出现和传播细菌耐多药(41]。不合适的初始概率抗生素治疗在这群虚弱的病人似乎严重感染的危险因素,建议使用广谱抗生素治疗的第一个患者感染的迹象,即使少数患者担心[42不适合最初的抗生素治疗,不允许任何明确的结论。然而,这个相同的广谱抗生素处方代表发生菌血症的危险因素在6个月后管理。因此,医生的临床意义的重要性决定开始抗生素治疗(广谱从一开始,有针对性的抗生素治疗,或武装备用)和概率抗生素疗法的使用在这些特定的情况下,不影响植物(例如,氨基糖甙类)必须前瞻性研究。
分子特征进行识别大肠杆菌通过针对八个基因。trp B和trp基因(或trp BA基因)色氨酸操纵子的共存大肠杆菌基因组(25]。在我们的研究中,所有的人大肠杆菌菌株分离粪便含有色氨酸合成酶基因编码酶亚基色氨酸合成酶单元B革命军(trpB)和81.48% (trpA)。菌株缺乏色氨酸合成酶亚基(trpA)基因可能是由于贫穷的基因表达大肠杆菌。此外,它可能是由于低效的翻译起始。低效的翻译起始大肠杆菌发生在许多腺嘌呤,thymine-rich基因(43]。
的βuidA -D-glucuronidase,编码的基因,通常用于专门识别大肠杆菌(44]。beta-glucuronidase酶被发现在88.89%的大肠杆菌菌株分离我们的粪便样本。我们获得的结果低于马丁斯et al。45),97.7%的地方大肠杆菌菌株具有uidA基因。这种差异可以解释为uidA结构基因的突变,因为两个uidA结构基因的突变解释缺乏葡萄糖醛酸酶的活动大肠杆菌压力(44]。
在大肠杆菌,通量通过并联控制通过调节异柠檬酸脱氢酶(46]。在我们的研究中,基因编码的酶异柠檬酸脱氢酶(icd)被发现在96.30%。异柠檬酸脱氢酶(icd)是一种酶参与肿瘤发生的规定(47]。异柠檬酸脱氢酶(icd)的酶氧化异柠檬酸α酮戊二酸。有几个同功酶取决于细胞车厢,包括与NAD +一种线粒体参与三羧酸循环和胞质形式NADP +参与脂肪生成异柠檬酸分子的命运大肠杆菌通过乙醛酸分流或柠檬酸循环,是由异柠檬酸脱氢酶,磷酸酶的磷酸化激酶AceK [46]。
5。结论
这项研究提供了重要的分子特征的数据大肠杆菌菌株孤立的孩子大便。重要的观察微生物物种多样性135粪便样本分析。识别微生物种类如下:spp。葡萄球菌,大肠杆菌,沙雷氏菌属odorifera, ornithinolytica克雷伯氏菌,铜绿假单胞菌、气单胞菌属hydrophila,沙雷氏菌属plymuthica,肠杆菌坂,和肠杆菌属aerogenes。对抗生素敏感性的强调传统用于医院透露multiresistance抗生素属于不同的家庭。的分子特征大肠杆菌粪便样本中分离出的菌株显示另一个分子的分离株内变异。这将是有用的扩展期和研究区旨在吸引更多全球及相关结论。
缩写
| ATM机: | Aztreonam |
| 菌落: | 集落形成单位 |
| 国际马铃薯中心: | 环丙沙星 |
| CTX: | 头孢噻肟 |
| dinB: | 基因编码的DNA聚合酶 |
| 艾凡: | 红霉素 |
| G1: | 组1 |
| G2: | 组2 |
| G3: | 组3 |
| G4: | 组4 |
| icdA: | 异柠檬酸脱氢酶的基因编码 |
| IPM: | Imipenem |
| 拿拿淋: | 萘啶酸 |
| 也没有: | 诺氟沙星 |
| OFX: | 氧氟沙星 |
| pabB: | p-aminobenzoate合成酶的基因编码 |
| 主成分分析: | 平皿计数琼脂 |
| 聚合酶链反应: | 聚合酶链反应 |
| polB: | 聚合酶PolII基因编码 |
| putP: | 脯氨酸透性酶的基因编码 |
| TAMF: | 总需氧嗜中温菌群 |
| 三羧酸循环: | 三羧酸循环 |
| trpA: | 对色氨酸合成酶基因编码单元 |
| trpB: | 对色氨酸合成酶基因编码单元B |
| uidA: | 基因编码β葡萄糖醛酸酶。 |
数据可用性
使用的数据来支持这项工作的结果可从相应的作者。
的利益冲突
插入作者宣称他们没有利益冲突。
确认
作者想表达自己的感激之情的儿科诊所的工作人员Abomey-Calavi(贝宁)。