文摘
背景。Enterococci是临床意义重大,因为他们的不断增加的抗生素耐药性和引起严重的感染能力由于毒性基因的阿森纳。很少有研究发展中国家的毒力因子,可能显著影响病人的结果。本研究描述了抗菌素耐药性资料和五个关键的流行肠球菌的毒力基因头饰,亚撒,cylA,特别是,和hyl在44个临床粪肠球菌和大肠都有效隔离在肯尼亚和与患者的人口统计学和临床特点。结果。所有大肠都有效分离得到从医院皮肤和软组织感染。而粪大肠社区获得性尿路感染。隔离都对红霉素耐药,而11/44(27.5%),25/44(56.8%),28/44(63.6%),37/44(84.1%),40/44(90.0%)和43/44(97.5%)容易四环素、左氧氟沙星、庆大霉素、氨苄西林、呋喃妥英,和teicoplanin分别。所有隔离都容易tigecycline,万古霉素和linezolid。几乎没有抗生素耐药性概要文件之间的差异粪大肠和大肠都有效。的患病率之间的毒性基因44隔离是27 (61.4%)头饰26 (59.1%)asa116 (36.3%)特别是,11 (25.0%)cylA,和1例(2.3%)hyl。72.9%的粪大肠隔离了多个毒力基因的57%相比大肠都有效隔离在没有毒性的基因。的hyl基因只是检测到大肠都有效,而cylA和asa1只检测到粪大肠。观察之间存在显著相关性asa1和esp毒力基因和耐四环素( 和0.0363,分别)。之间的显著相关性也观察到毒性基因的存在头饰和asa1和呋喃妥英电阻( 和0.0225,分别)和氨苄青霉素抗性( 和0.0008,分别)。结论。该研究凸显了高水平的红霉素耐药性粪大肠和大肠都有效、人口因素影响物种分布在患者,和多个毒力基因的累积粪大肠。重要的协会头饰,asa1,和esp毒性和耐药性基因可以解释的致病性成功粪大肠并为未来的研究提供了一个指南。
1。背景
肠球菌的细菌革兰氏阳性球菌物种通常发现在肠道,肠道,喉咙,口腔和阴道共生体(1- - - - - -4]。粪大肠和大肠都有效是主要的致病enterococci eighteen-known物种的物种。然而,只有粪大肠和大肠都有效窝藏菌株毒力基因与人类感染(5),包括尿路(UTI)、骨盆、血液、腹部、皮肤和软组织感染(SSTI) [6]。中描述的主要毒力因子,Enterococci聚合物质(asa1),白明胶酶(头饰)、溶细胞素(cylA),肠球菌的表面蛋白(esp)和透明质酸酶(hyl)。asa1是一个聚合物质,提高依从性肾小管细胞(1]。白明胶酶是一种锌metalloprotease水解纤维蛋白,胶原蛋白和其他肽(7和与生物膜的形成8]。溶血素的分泌,如溶细胞素导致血液细胞的分解和一直在与增加毒性的人类感染(9]。透明质酸酶促进宿主组织的殖民打破透明质酸,一个关键组成部分的结缔组织(10]。肠球菌的表面蛋白(esp)是一种高分子量表面蛋白与生物膜形成相关的特定enterococci (11]。esp中也扮演了重要的角色在殖民化和毅力在尿路12]。肠球菌的毒力基因头饰是最常见的在吗粪大肠隔离,而hyl和esp更常见的大肠都有效比在粪大肠(13]。大部分是什么知道Enterococci物种毒性是基于研究非洲以外(14,15]。
发布数据有限临床enterococci之间的患病率和毒力基因的分布在非洲。然而,在埃塞俄比亚的研究已经证明动物携带肠球菌的分离头饰毒力基因(16),导致医院感染(17和异形其药敏18]。Enterococci物种并不像报道的主要临床病原体在非洲尼日利亚和肯尼亚时点患病率表明5 - 11% (19]。尽管如此,耐糖肤,氨基甙类抗生素,β-lactams和氟喹诺酮类抗生素类正在全世界范围内增加(10,20.)和治疗这些感染可能带来挑战,其余治疗方案,如linezolid daptomycin quinupristin / dalfopristin,万古霉素,是昂贵的在肯尼亚有限的可用性在初级保健中心。虽然罕见,有报道称在肯尼亚耐万古霉素(19),表明日益增长的抵抗这些最后防线药物的可能性。毒力基因的相互作用和抗菌素耐药性在临床感染是值得研究hypervirulent和耐多药Enterococci隔离导致感染可能会出现不良临床结果。邹等人研究了红霉素耐药性和毒力基因之间的相关性,发现积极的存在之间的联系头饰和耐红霉素21]。因此,本研究进行检查的临床分离株粪大肠和大肠都有效在肯尼亚了解患病率和毒力基因的分布,确定有一个协会之间的抗菌素耐药性,临床表现,人口因素,和毒力基因。
2。方法
2.1。研究设计和人口
这个横断面研究是嵌套在一个multi-hospital监测研究患者超过两个月尿或SSTIs招募了2015年5月至2019年12月从六个五肯尼亚县医院。尿样、脓和棉签从软组织感染收集研究对象之后,他们同意参与这项研究。此外,为每个病人人口和收集临床资料,包括性别、年龄、感染类型,或门诊的地位,在社区或医院感染收购,免疫状态。
2.2。细菌的分离和鉴定
样本运往肯尼亚医学研究所以及实验室2 - 8°C的脓和在室温下伤口拭子和硼酸的尿液样本。所有样本接种MacConkey (BD,新泽西,美国),半胱氨酸乳糖电解液不足琼脂(HIMEDIA,孟买,印度),羊血琼脂(SBA)和孵化24至48小时在37°C。宏观上观察菌落形态和文化特征。Enterococci的初步识别是基于观察的革兰氏阳性球菌在链革兰氏染色剂和消极的过氧化氢酶测试。识别和确认肠球菌物种形成VITEK - 2进行了自动化平台(bioMerieux, Marcy-l 'Etoile,法国)。
2.3。抗菌药物敏感性试验
药敏测试进行VITEK2 (bioMerieux, Marcy-l 'Etoile,法国)平台使用AST-P586卡面板组成的13个抗生素:青霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、链霉素,左氧氟沙星,红霉素,quinupristin / dalfopristin linezolid,万古霉素,teicoplanin,四环素,tigecycline,呋喃妥英。结果解释基于临床和实验室标准协会(CLSI 2018)指导方针和VITEK2先进的专家系统。
2.4。毒力基因的检测
从纯粹的DNA提取肠球菌种虫害孤立文化使用快速dna /真菌/细菌提取工具包(美国加州ZymoResearch)根据制造商的指示和量化使用Nanodrop (Thermofisher,麻萨诸塞州,美国)分光光度计。多重PCR定位五个基因(cylA asa1,头饰、esp和hyl)上执行应用生物系统公司9700年thermocycler (Thermofisher,麻萨诸塞州,美国)使用引物发表Vankerkhoven et al . 200413]。每个25μl PCR的混合物包括12μl梦Taq DNA聚合酶(Thermofisher,麻萨诸塞州,美国)。2.5μ0.1 l的DNAμl (cylAasa1,头饰,hyl。0.2μl (esp特定的引物(13]。积极的和消极的控制粪大肠写明ATCC 29212和大肠杆菌分别写明ATCC 25922。PCR条件:初始激活在95°C,持续15分钟,30个周期在94°C的变性1分钟,退火在56°C 1分钟,在72°C扩展1分钟,最后,一个扩展周期在72°C 7分钟。PCR产品运行观察到15μl PCR反应的梯子上1%的琼脂糖凝胶与100个基点(Thermofisher,麻萨诸塞州,美国)和可视化E-box凝胶文档站(Vilber、Marne-la-Vallee、法国)。
3所示。数据分析
人口统计学和临床数据提取研究问卷调查并显示在一个Excel电子表格。定量数据分析了在Excel中。毒力基因之间的关系、人口因素和药敏表型是评估使用的确切概率法 被认为是重要的。
4所示。结果
4.1。人口和肠球菌的感染患者的临床特征
肠球菌分离得到6医院内五个县:内罗毕(16),基苏姆(18),Kericho(2),(7)的基,基利菲(1)37粪大肠隔离和7大肠都有效隔离孤立从44个病人平均年龄37年的研究期间仅占总数的1.89%同期分离获得。大多数的隔离29/44(65.1%)的皮肤和软组织感染(SSTIs), 15/44(34.9%)与尿路感染(尿)。十的44例(23%)是免疫力低下的个人,28/44(63.7%)住院,10/44(23.0%)的医院感染。粪大肠是孤立的从女性21(56.7%)比男性更多。相比之下,6的7大肠都有效隔离来自男性。所有7大肠都有效隔离是来自SSTIs患者住院病人和6/7。44名患者中,大多数社区获得性enterococci感染了,但是大肠都有效感染占大多数的医院感染。只有一个泌尿道感染是医院与六SSTIs相比(表1)。
年龄是Enterococci感染显著相关( )。年龄在14岁至29年了感染的比例最大,其次是年龄31岁到49年和50年以上。没有性别的物种之间的联系肠球菌或免疫功能不全的状态或类型的感染肠球菌的物种。有一个重要的物种类型之间的关联,感染的来源( ),和病人状态(住院或门诊)。社区Enterococci更有可能感染所致粪大肠比大肠都有效而粪大肠更有可能与所有海粪大肠感染住院患者(表中确定1)。
4.2。表型的特点和药敏资料Enterococci spp。隔离
所有37粪大肠和7大肠都有效殖民地出现一样光滑,nonhemolytic黄色殖民地整个边缘cl媒体说明乳糖发酵。他们都是革兰氏阳性球菌在短链显微镜下。44隔离中,有100%对三抗生素(linezolid、tigecycline和万古霉素)。有97.5%,90.0%,84.1%,63.6%,56.8%,和27.5%的易感性teicoplanin,呋喃妥英、氨苄青霉素、庆大霉素、左氧氟沙星,分别和四环素。完成耐红霉素也观察(图1)。补充表1含有抗生素耐药性表型数据的原始数据。
4.3。毒力基因的检测
所有五个毒性基因筛选中被检测到粪大肠和大肠都有效隔离基于预期的存在带大小(图2)。数据表明毒性基因的存在与否的隔离补充表所示1。
头饰最常检测基因在27(61.4%),其次是吗asa126 (59.1%),esp16 (36.3%),cylA11(25.0%)和hyl(表1 (2.3%)2)。所有的asa1和cylA基因检测是在粪大肠。头饰基因被发现在26/27 (96.3%)粪大肠隔离。9/37(24.3%)的粪大肠分离株毒力基因的只有一个,15/37(40.54%)有两个基因,10/37(27.03%)有三个基因,2/37(5.45%)有四个基因。最常见的基因组合头饰和asaI(35.1%)紧随其后asa1 cylA, esp在两只存在于13/44 (24.3%)粪大肠。大肠都有效携带毒力基因少于粪大肠,4/7(57.0%)的基因,两个隔离只有一个基因,一个隔离有两个基因(头饰,和esp)。值得注意的是,hyl才发现一个吗大肠都有效隔离。相比之下,cylA和asa1只检测到粪大肠。
4.4。分布和协会的毒力因子和抗生素耐药性
毒力因子和抗生素耐药性数据补充表中进行了总结1。有一个重要的四环素抗性和存在之间的联系asa1和esp( 分别为0.0363),呋喃妥英阻力和的存在凝胶E和asa1基因( 分别为0.0225)和氨苄青霉素抗性的存在凝胶E和asa1( 和0.0008,分别)(表3)。其他抗生素之间的关联没有测试,因为完全或几乎完全抵抗或对红霉素,teicoplanin,呋喃妥英、linezolid,万古霉素和tigecycline。
5。讨论
这项研究进行了评估的患病率和分布肠球菌种虫害毒性基因在临床中粪大肠,大肠都有效分离获得的5年抗菌素耐药性监测研究。研究发现,肠球菌种虫害并不常见临床病原体肯尼亚人口考虑到采样粪大肠和大肠都有效隔离代表< 2%的隔离恢复从父母的临床样本的研究。在非洲,这与先前的研究一致表明,患病率为2.7%肠球菌儿科(种虫害感染22)13.6%的患病率低得多,在东亚。本研究从SSTIs获得的隔离和尿符合已知的Enterococci spp引起的感染。23]。然而,我们观察到粪大肠是这两个物种的主要病原体粪大肠孤立的五倍大肠都有效。粪大肠”年代优势与高尔等人的研究是一致的在印度北部24),确定粪大肠作为主要在社区获得性尿尿路病原体(CA-UTIs)。有这么丰富的粪大肠在CA-UTI可以归因于的优势粪大肠在病人的肠道菌群(25,26]。大肠都有效虽然不那么经常孤立,被发现主要在男性患者住院SSTIs,表明它作为一个医院的重要性比其他病原体肠球菌物种。
尽管拥有更少的毒性基因测试粪大肠,大肠都有效感染与住院相关感染这意味着更严重的感染。这种明显的差异也报道了Higuita et al。27),观察到大肠都有效造成更严重的感染和死亡率高于粪大肠。根据我们的观察,我们假设医院大肠都有效感染可能是机会主义,影响已经脆弱的病人,并导致更多的不良结果,并可能与毒力因素的存在与否。
当我们检查了抗生素耐药性模式没有发现显著差异的两个物种之间的对比研究发现大肠都有效隔离更有效积累抗性基因(6),导致更大的抗青霉素、氨苄西林、哌拉西林、imipenem,环丙沙星粪大肠隔离的缺乏的稀有物种之间的阻力差异可能反映了人类肠球菌的感染和社区获得性感染的大量不经验抗生素压力将使抗生素抗药性通常使用在医院设置。AST结果显示许多可用的治疗方案的临床管理肠球菌的感染,因为所有隔离测试对万古霉素敏感,tigecycline, linezolid。样品也有高敏感性teicoplanin,呋喃妥英、氨苄青霉素、庆大霉素、左氧氟沙星。变量粪大肠抗生素耐药性结果利福平(60.7%)、四环素(17.9%)、红霉素(14.3%),在肯尼亚和氯霉素(10.7%)记录(27]。抗生素耐药性的发生率高,氨苄西林(80%)和强力霉素(73.3%)也被报道在埃塞俄比亚(18]。
糖肽抵抗介导的范基因簇很少报道研究从肯尼亚28,29日),在这项研究中我们没有观察到任何阻力。Enterococci表达vanA基因是高度耐万古霉素和teicoplanin抗生素,而enterococci表达vanB基因显示高耐万古霉素和易感性teicoplanin [30.]。在这项研究中,没有耐万古霉素,但teicoplanin nonsusceptible隔离观察几个隔离和确认重复测试。不和谐的耐糖肽抗生素是一种罕见但报道出现归结于龙等的研究。31日]小说点突变和缺失的监管区域范转座子基因位于Tn1546类型。分析存在的万古霉素抗性基因和监管组件可以提供线索的机制的研究中观察到不同寻常的不调和隔离。
这项研究观察到的高敏感性(75%)呋喃妥英,第二个最常见的药物治疗细菌感染后的尿路在肯尼亚beta-lactam药物(28]。这么高的敏感性在肯尼亚相比其他国家如伊朗35.5%的阻力水平(32)表明,呋喃妥英使用还不像在其他国家常见的在肯尼亚。红霉素是一种相对廉价的广谱的抗生素用于治疗许多感染,这是不足为奇的阻力水平高。这项研究表明,这种药物不再是有效的治疗肠球菌种虫害感染。在尼日利亚的一项研究也显示,100%红霉素耐药性,表明这一趋势是普遍的在多个撒哈拉以南的非洲地区(33]。本研究对临床分离株发现四环素抗性水平(72.5%)显著高于17.9% Wambui等人2018年的报告的调查进行屠宰牛(27),但2009年在肯尼亚医院符合研究发现四环素电阻率为80%粪大肠71%,大肠都有效(34]。这些高可以归因于四环素常用来治疗感染,因为它是廉价和容易得到的。高耐四环素率也与四环素在牲畜的广泛使用27动物产品(业务),证明了这一点35,36在欧洲[]和家禽37)可以开抗生素耐药性细菌包括Enterococci。
本研究报告耐庆大霉素的36.4%,这表明增加阻力接近1/2不到十年基于报道阻力位在2012年在肯尼亚(19%34]。自氨基甙类抗生素(如庆大霉素)单药治疗已知贫穷吸收进入细胞质,青霉素、庆大霉素治疗建议的结合治疗肠球菌的感染患者通过细菌细胞壁提高庆大霉素的渗透使用青霉素细胞壁活跃,导致协同活动(38]。一项研究在2020年在肯尼亚麦纳et al。39)报道,青霉素的组合和庆大霉素主要在新生儿加护病房(58%)。耐氨苄青霉素大致与耐庆大霉素在这项研究中,这意味着相应的使用。
观察后,抗生素耐药性水平低除了红霉素、四环素我们考虑是否严重威胁生物的致病性毒性基因通过检查配置文件。白明胶酶的基因编码头饰是最常见的毒性基因(36.3%)。这是符合世界各地进行的许多研究的结果,所有的这些发现头饰更普遍比其他基因以本研究[40]。的主导地位,凝集物质的基因asa1排在第二位。两个基因只在在座粪大肠。头饰和asa1是主要的毒性基因相似的研究表现在临床分离株在印度和伊朗也在猪从一项研究在中国21,40,41]。的hyl在只有一个基因被发现大肠都有效隔离,早期的研究,发现一个惊喜hyl基因是主要发现大肠都有效从临床样本中隔离在美国(6]。虽然esp闻名函数在尿道壁粘附[12在这项研究中,也同样出现在从尿和SSTIs隔离。
研究还试图测试协会与抗生素抗性基因毒性。除了协会之间被邹等人凝胶E和红霉素,这项研究已经确定了其他重要的之间的关联asa1基因和esp四环素和呋喃妥英之间,头饰,asa1。的asa1,头饰,esp基因编码biofilm-forming蛋白质参与粘附宿主细胞(8,42]。积极的联系asa1,头饰,esp呋喃妥英和四环素抗性基因是有趣的两种药物是有效的对biofilm-forming隔离(43,44]。Biofilm-forming Enterococci一般细菌对抗生素的抗药性要比nonbiofilm-forming的(45]。我们假设接触biofilm-forming隔离呋喃妥英和四环素可以推动特定的抵抗这些代理。协会asa1,特别是,和头饰在耐药性细菌是有利的,因为它提供了一个双重阿森纳造成和幸存的临床感染的治疗。
这项研究有一些局限性。首先,只有几个肠球菌种虫害隔离在这项研究中,获得有限的统计分析和推断,可以。其次,一些患者合并感染与其他病原体,所以不能仅仅归因于感染肠球菌spp。第三,必不可少的研究只筛选了5毒力基因,而更多的基因参与肠球菌的致病性。第四,尽管大多数的毒性与生物膜形成相关基因检测,生物膜化验没有进行确认的表现型。更广泛的研究结合表型分析和全基因组的方法解决毒性因素更全面,提供隔离的应变类型来解决任何单克隆问题可以倾斜检测协会。
6。结论
研究已经确定了大肠都有效作为一个主要health-care-associated影响男性患者和感染粪大肠作为一个重要的社区获得性尿路感染的病因。肠球菌的感染可以管理由于低电阻观察对大多数抗生素四环素,红霉素除外。所有五个毒力基因检测发现在肯尼亚隔离粪大肠越来越多的基因。的重要性esp、asa1和头饰毒力基因毒性和抗生素耐药性的同现可以解释的临床成功粪大肠并为进一步的研究提供了一个机会。
缩写
| asa1: | 凝集物质 |
| 写明ATCC: | 美式文化收藏 |
| 蔡: | 社区获得性感染 |
| cl: | 半胱氨酸乳糖电解液不足琼脂 |
| CLSI: | 临床与实验室标准协会 |
| cylA: | 溶细胞素一 |
| 背景: | 脱氧核糖核酸 |
| 粪大肠: | 粪肠球菌 |
| 大肠都有效: | 肠球菌都有效 |
| esp: | 肠球菌的表面蛋白 |
| 头饰: | 白明胶酶 |
| 海: | 医院感染 |
| hyl: | 透明质酸酶 |
| IRB: | 机构审查委员会 |
| 以及: | 肯尼亚医学研究所 |
| MLST: | 茎序列类型 |
| 聚合酶链反应: | 聚合酶链反应 |
| 小企业管理局: | 羊血琼脂 |
| 塞鲁船长: | 科学和伦理审查单位 |
| SSTIs: | 皮肤和软组织感染 |
| 尿路: | 尿路感染 |
| WRAIR: | 沃尔特里德陆军研究所的研究。 |
数据可用性
图表、数据和表数据用于支持本研究的结果也包含在这篇文章,上传数据文件中部分和补充文件部分。
伦理批准
本研究通过科学和伦理审查单位(塞鲁# 2767)肯尼亚医学研究所以及沃尔特里德陆军研究所(WRAIR # 2089) IRB。许可被授予由导演以及出版的手稿。没有反对出版。研究者坚持保护人类受试者的政策规定在AR 70 - 25所示。
同意
所有科目提供了书面同意参与这项研究,他们的隔离和数据用于研究和出版物。
信息披露
本文所包含的意见或断言是作者的私人看法和不被视为官方或反映了国防部的真实看法。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
L.M.概念研究和获得资金。M.G.D。M.M., D.M, F.T, E.O., and C.K investigated the study. M.G. and W.M analyzed the data. M.G. wrote the original draft. M.G., E.O., W.M., and L.M. reviewed and edited the manuscript. All the authors read and approved the final manuscript.
确认
作者要感谢的贡献阿曼达罗斯在手稿评论,克里夫Momanyi Fridah Kiage,格拉迪斯Biwott,凯瑟琳Muriuki,阿尔弗雷德·Odindo Mitsanze IHA Thoya和医院的工作人员寻求帮助,样本收集。这项研究是由武装部队卫生监测部门(AFHSD)全球新兴感染监测部门在项目没有。20160270153 FY17-19 PROMIS ID。
补充材料
补充表1:感染类型,抗生素耐药性资料、和毒力基因肠球菌种虫害隔离。(补充材料)