文摘

鸟型分支杆菌是人类和动物病原体感染宿主粘膜表面。过去的研究已经证明细菌可以与呼吸道和胃肠道。双分子层覆盖在身体表面的糖蛋白,粘蛋白,可以作为物理屏障和凝胶含有抗菌和抗病毒的特性。当前的研究表明,不同的菌株米。鸟结核相比,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,单核细胞增多性李斯特氏菌,不能绑定到黏蛋白MUC2和MUC5b,主要在胃肠道和呼吸道黏蛋白,分别。绑定的缺乏是由于细胞壁的特点和受损通过改变脂质,蛋白质或糖脂。米。鸟结核相比,E。杆菌,同样与上皮细胞粘蛋白的存在与否,这表明病原体可以促进细菌的细胞壁运动通过粘蛋白层,粘膜墙。总之,这项研究表明米。鸟结核可以避免粘蛋白的障碍,这也解释了它的能力与粘膜上皮,即使在没有motion-related结构。

1。介绍

分枝杆菌鸟结核无性系种群。hominissuis(米。鸟结核)是一个环境细菌与感染相关的潜在的肺部疾病,如支气管扩张,囊性纤维化,和肺气肿1,2]。引起的感染米。鸟结核也出现在免疫抑制患者,如艾滋病和特定的免疫缺陷(3]。

M。鸟结核与宿主粘膜细胞一旦在呼吸道或消化道。上皮粘膜细胞入侵的病原体在体外(4和体内5作为一个一步感染)。米。鸟结核肺癌的发病机理也与生物膜的形成表面的粘膜(6,7]。这种感染是复杂的,涉及到微团聚体的形成,一旦他们结合的上皮黏膜和刺激细胞骨架重排,阶段,需要许多细菌蛋白质的参与(8,9]。

健康的呼吸道表面涂上一层粘液,很大程度上是由水、盐、黏蛋白和表面活性剂。作为一个步骤的过程中与气道的交互或胃肠道粘膜,病原体需要绕过粘蛋白层,在呼吸道和肠道。在肠道内腔粘蛋白存在于两层,一个相邻的粘膜表面,富含抗菌肽,和更多的外部层,细菌在哪里遇到了(10,11]。同样的安排似乎出现在航空公司(12]。

黏蛋白质量是高分子糖蛋白组成的蛋白质与碳水化合物和硫酸分子的核心。黏蛋白有特点Pro-Thr-Ser重复以及Cys-rich域提供关键的二硫键能力,重要的黏液multimerization和粘液功能。主要分泌黏蛋白在航空公司是生产聚合物黏蛋白MUC5AC和MUC5B13),而在胃肠道粘膜表面,MUC2更丰富(11]。在哺乳动物中,粘蛋白/粘液分泌细胞的协调活动涉及释放高分子粘蛋白糖蛋白和纤毛细胞传输和消除外国材料包括细菌(13]。Bergstrom等人及其同事(14]表明,肠道MUC2可以预防致命的传染性结肠炎结肠粘膜的时光致病性和共生的细菌。作者表明,MUC2生产是至关重要的主机保护在附件和消除细菌感染(大肠杆菌和枸橼酸杆菌属rodentium),但限制了整体细菌病原体和同桌的数字与粘膜表面。黏蛋白还能减少表面粘附和生物膜的形成铜绿假单胞菌(15]。

此外,粘蛋白与肺巨噬细胞(肺泡和粘膜下)在一些能力在不同的解剖位置。环境的粘度由糖蛋白引起的粘蛋白是非常重要的保持病原体粘膜表面的距离。对于一些病原体,能动性在发病机理中起着重要的作用和生物等至关重要铜绿假单胞菌在主机和形成生物膜(16]。

囊性纤维化的表型标志是脱水跨所有上皮粘膜层的表面。

分泌黏蛋白调节mucocellular许可的能力依赖于其聚合物结构通过形成二硫键。enterotoxic等致病菌大肠杆菌EatA产生一种蛋白质,降低肠粘蛋白(17),因此可以迁移,最终结合黏膜表面。

因为黏蛋白的作用尚未研究关于米。鸟结核感染,我们假设的粘蛋白可能是无效的角色从粘膜层分枝杆菌分离的细胞,可能由于分枝杆菌表面的脂质含量,因此促进粘膜细菌运动的墙。目前的调查结果支持假设米。鸟结核表面保护细菌免受黏蛋白的作用。

2。材料和方法

2.1。细菌

米。鸟结核104年是孤立的从病人的血(细菌已经出版的特点(18])。细菌培养在麦德布鲁克7 h10琼脂培养基(Difco实验室、底特律、MI)、补充与油酸、白蛋白、葡萄糖,和过氧化氢酶(OADC)。米。鸟结核3388年获得芭芭拉·布朗(德州泰勒)是培养上述麦德布鲁克7 h10琼脂培养基。这是一个肺病原体。鸟型分支杆菌(MAH) A5和MAH A5 GPL / 4 b2突变以前描述(18,19]。

铜绿假单胞菌PD0300 mucA22黏液状的变体是请提供由马丁·舒斯特(俄勒冈州立大学)。P。绿脓杆菌生长在Mueller-Hinton肉汤。细菌都洗(3000× ),和培养液成立于磷酸缓冲溶液(PBS)和接种7 h9肉汤。大肠杆菌写明ATCC CFT073,金黄色葡萄球菌写明ATCC 25923,单核细胞增多性李斯特氏菌(临床分离)培养Luria-Bertani(磅)琼脂。

执行分析之前,稀释在汉克的平衡盐溶液(hbs)来匹配麦克法兰标准。细菌是准备在10⁵,10⁶,10⁷浓度。

2.2。粘蛋白

纯化胃粘蛋白MUC2和肺MUC5b从Pfaltz购买和鲍尔公司增加了2%的琼脂凝胶为5% 。琼脂2% 是用作控制。二十四好组织培养板使用约400μL在每个绑定化验。

2.3。绑定到粘蛋白测定

细菌培养液准备在哈佛商学院pH值7.3是稀释的浓度约6×10³CFU /毫升与麦克法兰由比较标准。然后,200年μ悬挂的L是添加到每个细胞培养板。板包含琼脂,琼脂+粘蛋白,最终孕育了细菌悬液对3 h在37°C在厌氧条件下(厌氧罐,BD洗液GasPak jar)。潜伏期后,每三次洗了300年μL(哈佛商学院,移除上层清液收集在5毫升塑料管子。然后,它被稀释10⁻³,最后悬浊液镀到7 h10琼脂或磅琼脂板上。盘子上的菌落数确定10天后分枝杆菌和其他细菌(图24 - 48小时之内1)。

2.4。预处理的细菌

评估各种环境条件,通常在感染的过程中,可能遇到的影响米。鸟结核粘蛋白绑定,细菌在不同条件下preincubated,粘蛋白附件实验重复。米。鸟结核遇到在不同的环境条件,例如水。此外,米。鸟结核在到达肠道之前必须经过胃(2 h排空时间)。胃的pH值被认为是3.4,摄入的食物。孵化后在环境条件下,细菌被旋转到4°C,悬浮细菌的浓度是由浊度(20.]。

确定细菌表面的脂质和蛋白质的作用在绑定,分枝杆菌是孵化Tween-20 3 h在37°C或50%胰蛋白酶对3 h在37°C。治疗后,细菌被剥离下来,最后的培养液是准备在4°C,以防止细菌的表型的变化如前所述。

评估细菌表面是否参与粘蛋白的性质不具有约束力,我们使用4 b2突变,它包含一个突变基因pstB参与GPL合成突变体,有一群改变形态类型(19]。

2.5。入侵检测

喉细胞系HEp-2,写明ATCC(美国组织文化集合),购买的是维护rpmi - 1640年补充10%胎牛血清的边后卫。肺肺泡上皮细胞(A549)写明ATCC在DMEM培养获得补充10%的边后卫。层是由播种10⁵细胞的每个好24-well confluency细胞培养板和孵化,直到达到90%。层被覆盖着5%的粘蛋白MUC2或MUC5b和细菌进入上皮细胞的能力被调查之前报道(8,9]。总之,单层膜孵化了米。鸟结核104或P。绿脓杆菌,E。杆菌,年代。葡萄球菌,l。monocytogenes1小时,上层清液被删除了,盘子洗了三次哈佛商学院。上皮细胞单层比孵化为4小时37°C。孵化后,膜是细胞溶解(如前所述)(8,9),溶解产物是连续稀释和镀成7 h10琼脂板(图1)。

在一些化验,细菌处理4μ多粘菌素B g / ml(抗菌肽代理)单独或孵化与多粘菌素B MUC2 HEp-2细胞单层粘蛋白。

2.6。统计分析

数据分析使用GraphPad棱镜。学生的t以及和方差分析是用来确定比较的意义。

3所示。结果

3.1。米。鸟结核粘蛋白粘附

以确定是否米。鸟结核菌株可以绑定到由肠道粘膜的黏液,细菌培养使用大约10的培养液⁸CFU /毫升细菌在MUC2 mucin-covered细胞培养板。在孵化后,每个在mucin-covered板与PBS在室温下洗了三次。细菌是镀,算作nonadhered细菌中删除。类似的试验进行了使用粘蛋白MUC5b。

铜绿假单胞菌PD0300, PAO1 mucA22突变体,作为一个积极的控制分析,结合各种黏蛋白,包括猪胃粘蛋白作为先前建立(21,22]。基本协议,PD0300显示大量的绑定粘蛋白/琼脂与琼脂相比,而米。鸟结核104显示没有大量的绑定粘蛋白/琼脂与琼脂。

是否绑定到黏蛋白与致病性革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,单核细胞增多性李斯特氏菌,金黄色葡萄球菌25923,大肠杆菌CFT073,鸟型分支杆菌菌株104年和3388年化验了粘蛋白MUC2绑定。革兰氏阴性细菌(E。杆菌和P。绿脓杆菌),单核细胞增多性李斯特氏菌显示统计学意义更大比例的绑定粘蛋白/琼脂琼脂相比,和两个年代。葡萄球菌和米。鸟结核显示没有明显的绑定粘蛋白/琼脂琼脂相比(表1)。总共米。鸟结核物种化验,没有显著差异在绑定粘蛋白/琼脂琼脂。获得的结果对于绑定MUC5b粘蛋白(表非常相似2)。

3.2。环境条件对绑定到粘蛋白的影响

进一步调查的可能影响因素绑定米。鸟结核104 MUC2粘蛋白,预处理的试验基本协议之前进行绑定。环境激素的细菌与DI H₂O和盐酸(pH值3.4和H₂O)进行直接测定前;米。鸟结核菌株(104年和3388年)在水中孵化(12小时)或酸性pH值为4 (2 h),并且能够结合粘蛋白检查。如表所示3孵化、环境条件没有影响粘蛋白绑定。

3.3。坚持粘膜上皮细胞

米。鸟结核不表达鞭毛,因此不能迅速通过黏液层。确定一层粘液会干扰的能力米。鸟结核绑定和侵入粘膜上皮细胞,入侵HEp-2 A549肺泡上皮细胞是评估的存在与否MUC2粘蛋白层。如表所示4,虽然粘蛋白干扰的绑定和入侵宿主细胞E。杆菌,它没有影响粘膜细胞的入侵两种不同的菌株米。鸟结核。

3.4。治疗米。鸟结核Tween-20或胰蛋白酶

能够防止绑定的粘蛋白可以与细胞壁米。鸟结核。探讨细菌表面的作用,我们治疗米。鸟结核Tween-20 5%和50%胰蛋白酶,之前确定绑定的黏液。两个治疗显著增加绑定的米。鸟结核粘蛋白,这表明病原体由细胞壁包围,阻止绑定到粘膜表面的黏液和删除一个机械机制(表5)。

指示从先前的结果表明,细菌细胞内容很可能参与了预防与粘蛋白的交互能力。确认的角色绑定上的细菌表面粘蛋白,我们使用了米。鸟结核4 b2突变(突变基因pstB合酶glycopepdolipid合成通路的一部分,34)测定粘蛋白绑定。结果表明,米。鸟结核4 b2突变可以绑定到粘蛋白,与野生型相比细菌(表6)。

3.5。多粘菌素B的影响米。鸟结核和入侵HEp-2细胞

评估是否多粘菌素B,代孕的抗菌肽,对一个系统包含有抗菌效果粘膜细胞和MUC2黏液,两者兼而有之米。鸟结核104 MAH突变4 b2孵化了4μg多粘菌素B的4小时,细菌的数量是量化,对MAH 4 b2显示杀害活动,但不是米。鸟结核104年。当MAH 4 b2是添加到HEp-2单层覆盖与粘蛋白MUC2的多粘菌素B,细菌进入上皮细胞的能力与野生型相比明显减少米。鸟结核104年和单层不包含多粘菌素B(表7)。

4所示。讨论

外部连接人类宿主粘膜表面包含一层或两层粘蛋白、糖蛋白旨在作为一个障碍病原体和其他抗原(10,11),作为吸入和摄入粒子的连续清洗机制或微生物。病理过程影响的金额或流动性粘蛋白层与增加感染有关。普遍观察到的条件是慢性肺部疾病,如支气管扩张、肺气肿和囊性纤维化23]。这些条件与减少肺粘膜的机械防御,以及相同的肠道粘膜。

感染后,细胞生产粘蛋白(主要是杯状细胞)发生增生和粘液分泌增加,证明保护许多不同的病原体(24]。层粘蛋白还参与免疫反应,约将抗菌肽、溶菌酶等酶和抗体(11]。最近出版也确定了先天淋巴细胞细胞(ILC 2)作为一个重要的触发粘蛋白生产的网站与肠道寄生虫(25]。

我们的调查观察肠道和呼吸道粘液的作用复合菌群在粘膜防御非结核分枝杆菌,米。鸟结核。的研究结果米。鸟结核也没有绑定到黏蛋白(MUC2和MUC5b),相比之下E。杆菌和P。绿脓杆菌表明,米。鸟结核轻易穿过粘蛋白层,说明细菌可以附着在粘膜表面不表达伞或长pili已与另一个病原体的能力,P。绿脓杆菌绑定和侵入肺气道粘膜(16]。

粘蛋白预防感染。Bergstrom等人报道的一项研究和他的同事们(14]调查致病菌的作用在致命的传染性结肠炎支持概念,细菌粘蛋白作为屏障,阻止他们与粘膜表面交互。事实上,Hashein等人的工作和他的同事们(26]表明,MUC2不足导致小鼠肠道线虫的易感性增加。

病原体在不同的时尚与粘液。鞭毛,常见的能动性因素是利用病原菌等霍乱弧菌通过粘液屏障迁移。同样,另一个肠道病原体,沙门氏菌,似乎锚黏液层,使用粘连,促进殖民[27,28]。

最近的调查表明,气道粘液限制奈瑟氏菌属meningitides进入鼻咽上皮细胞,保护呼吸道粘膜的细菌和相关的炎症反应(29日]。在具体的研究中,粘液在细胞表面的存在阻止了上皮细胞的炎症反应,这可能改变细菌粘膜细胞之间的交互。在目前的研究中,我们显示上的粘液单层没有改变的能力米。鸟结核菌株与呼吸道上皮细胞,再次确认细菌之间的屏障和粘膜细胞不能干扰绑定。

米。鸟结核是一个多次环境细菌感染宿主通过接触环境来源(30.]。之前的研究表明,通过细菌的环境条件,例如,影响细菌表面的物理性质,使其更耐胃的pH值(22]。自米。鸟结核遇到水,感染肠道粘膜上皮细胞,它需要交叉胃的酸性环境,我们暴露了细菌两种情况下,检查其绑定到粘蛋白的能力,表明这些条件所影响的能力米。鸟结核与粘蛋白相互作用。事实上,缺乏影响力并不令人感到意外,因为绑定到粘蛋白不会留下任何有害影响粘膜细胞结合的能力。

所有收集到的证据表明,细菌表面产生了重大的影响与粘蛋白的相互作用。米。鸟结核表面,就像其他分枝杆菌,含有糖蛋白,脂类和碳水化合物(26]。事实上,通过治疗细菌洗涤剂(渐变)或胰蛋白酶在细胞壁的内容引起了重大的改变,与粘蛋白结合能力的变化。同样的观察被描述在其他微生物粘膜结构的相互作用。所有的工作执行与粘蛋白和细菌表明粘蛋白的作用是保护粘膜表面的病原体,和米。鸟结核已经逐步形成了一种表面,可能改变的方式,它不绑定到MUC2或MUC5b。使用一个米。鸟结核突变体,一个改变醣脂类结构的细胞壁也增加了绑定细菌粘蛋白。因为年代。葡萄球菌也无法绑定到粘蛋白,我们可以假设虽然表面脂质可能抑制绑定的米。鸟结核粘蛋白,也出现在其他结构年代。葡萄球菌表面可能参与抑制。描述了许多其他病原体相互作用的粘蛋白,如弯曲杆菌和寄生虫31日,32),通过改变基因表达或促进粘蛋白诱导T cell-simulation细胞因子。

粘蛋白的缺乏功效来创建一个屏障和病原体之间的粘膜细胞是演示了使用两种不同的上皮细胞系,HEp-2 A549。观察了先前的发现显示米。鸟结核抵抗抗菌肽的作用[33]。考虑在肠道和呼吸道粘膜覆盖两层粘蛋白,穿过表层将细菌接触底层,富含抗菌肽。事实上,在我们的研究中,孵化代孕的抗菌肽显著受损细菌入侵的能力在mucin-containing单层上皮细胞。因此,能够防止抗菌肽的作用补充细菌的表型。

总之,这项研究表明米。鸟结核能够绕过粘蛋白的作用,病原体的天然屏障,与粘膜上皮细胞,尽管缺乏鞭毛。如何米。鸟结核获得致病特点是未知的。未来的工作将探讨这方面的病原体,可能通过筛查突变体结合粘蛋白,如4 b2突变在工作。

数据可用性

所有可用的数据包括在手稿是任何时间要求。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

作者的贡献

JB执行实验,写论文。1进行实验和编辑了手稿。

确认

作者感谢支持本研究由旧金山的微生物学基础提供。作者也感激Lynette霍桑和艾米马准备的手稿。作者萨沙博士也在债务增长的技术帮助。