文摘

背景。班氏丝虫淋巴丝虫病的主要原因是由蚊子传播的向量。vector-parasite交互和其他蛋白质,actin-1已经涉及了laboratory-controlled实验的成功传播的病原体。然而,验证这一发现病原体的自然环境是必需的。客观的。本研究的目的是评估actin-1表达式班氏丝虫感染蚊子向量的流行病学研究期间收集的Tsafe当地政府扎姆法拉州,尼日利亚。方法。蚊子是收集和使用形态学键确认,其中包括上颌的触须的长度,淡斑的翅膀,和规模模式在腹部。其次是检测的188个基点SspI的标志班氏丝虫用聚合酶链反应(PCR)感染。的mRNA水平actin-1基因在受感染的评估冈比亚疟蚊sl和这种致倦库蚊和他们的控制,成人在研究地区饲养的幼虫。结果。蚊子被确定冈比亚疟蚊sl和这种致倦库蚊,而感染班氏丝虫证实了188个基点的放大SspI标记。一个相对褶皱增加4.85和4.09actin-1基因表达在班氏丝虫来华的冈比亚疟蚊sl和这种致倦库蚊被观察到。因此,对于我们第一次的报道actin-1基因在野生蚊子向量(冈比亚疟蚊sl和这种致倦库蚊)感染班氏丝虫是调节。结论。的actin-1基因调节和类似的表达w .丝虫研究地区感染蚊子传播的,这可能可以作为一种生物标志物和可行的战略控制寄生虫传播流行地区。

1。介绍

淋巴丝虫病是一种被忽视的热带疾病(元)与淋巴系统的阻塞引起的寄生蠕虫(1]。大约有500种已知感染脊椎动物丝虫属,其中只有8个主要物种感染人类。这些包括班氏丝虫,与象皮病马来,与象皮病timori,盘尾属肠扭结,贷款贷款,Mansonella perstans,Mansonella streptocerca,Mansonella ozzardi。这些寄生虫的首选偏好网站的淋巴管和淋巴结诱导发展毁容和衰弱的临床症状2]。据报道,有8.86亿人居住在不同国家的区域需要预防性化学疗法来阻止感染的传播。大约80%的这些人生活在以下10个国家:安哥拉、喀麦隆、科特迪瓦、刚果民主共和国、印度、印度尼西亚、莫桑比克、缅甸,坦桑尼亚联合共和国,尼日利亚3]。实力雄厚,淋巴丝虫病的负担在尼日利亚主要是引起的班氏丝虫(4]。

地理位置和栖息地类型是主要影响蚊子函数向量在任何特定的流行区域(5]。当前的研究现在注重扩大减轻vector-mediated病原体的传播的新策略,扩展研究逐渐增加优先级mosquito-filarial系统。然而,蚊媒疾病控制的成功往往受到来自新的或重新和复兴残余人类感染进一步传播的向量,特别是有效的人类治疗是不够的。虽然杀虫剂的应用在很大程度上加强蚊虫控制几十年来,毒性对人类和出现insecticide-resistant蚊子种群之间的特征是十分关注的,从而减少其他控制措施的有效性6]。

蚊子经常暴露于病原体在喂养之后通过破坏角质层pathogen-driven表皮退化。山抵制,他们天生的细胞和体液免疫反应有时导致的死亡病原体通过不同机制如溶解、黑化作用,hemocyte-mediated吞噬作用[7]。蚊子的免疫、生理和结构组件可以预防和改善丝虫的寄生虫的建立(7,8]。向量中肠的迁徙时间和机械穿越障碍(7),以及摄入的胸肌细胞线粒体的蚊子,物理策略采用的构成部分班氏丝虫为了适应在蚊子的环境中(9,10]。上皮细胞蚊中肠围食矩阵的第一道防御许多病原体期间获得血喂养,这些细胞可以合成一些抗菌肽(安培数)。先天免疫基因的转录安培编码是高度依赖于几个信号级联途径,包括Janus kinase-signal换能器和转录激活(JAK-STAT), toll样受体,和免疫缺陷通路(11]。体液防御的蛋白质残雪。quinquefasciatus一直在阐明laboratory-controlled实验,在此期间,五个蛋白质调节分子量为66,22日,14日,7日,转铁蛋白和40 kDa, attacin,溶菌酶,defensin,分别和肌动蛋白(12),肌动蛋白是指actin-1在引物设计(13)是最关键的寄生虫感染和发展。这些蛋白质是向量的免疫复合物的一部分,发展以应对他们的交互与生命周期阶段的病原体和功能在各种细胞内过程旨在改善矢量能力(成本14]。然而,蚊子感染班氏丝虫从自然环境没有被检查了这些蛋白质actin-1是最丰富的,经常参与parasite-vector互动(15]。Actin-1是蚊子的肠道组织的一部分参与限制寄生虫感染的一个敌对的函数(16]。评估actin-1表达式在受感染的蚊子可以作为一个可能的生物标记疫苗和药物开发的新战略的控制寄生虫传播流行地区。本研究旨在评估actin-1表达野生捕获班氏丝虫来华的蚊子向量Tsafe扎姆法拉州地方政府,尼日利亚。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

试剂盒试剂、异丙醇、氯仿、乙醇(绝对)获得Sigma-Aldrich(美国),RNase-free水、SDS、引物,从南非Inqaba生物技术和琼脂糖粉,核苷酸和Taq热费希尔科学(美国),合成第一链cDNA工具包和卢娜普遍qPCR主混合来自新英格兰生物学实验室,溴化乙锭和RNAlater获得热费希尔科学(美国)。所有其他试剂的分析和分子级。严格遵守制造商的指令是维护。

2.2。研究区域

研究区是Tsafe在尼日利亚扎姆法拉州地方政府区域坐标11.57′N和6.55′E约五十(50)公里从议员,国有资本。该地区的少数民族主要是豪萨语,富拉尼族和Bare-Bare。主要的农业活动是农业、饲养的动物,和贸易(17]。

2.3。样品收集

方便抽样的方法被用来随机选择从当地政府三个病房区域。在每个病房,两个网站选择和五个房子随后选择收集的感染和控制蚊子除虫菊击倒(PKD)使用作为杀虫剂残杀威的选择。这是用于喷洒indoor-resting蚊子06:00时点和10点之间(3,18]。收集到的蚊子就存储在RNAlater−20°C。100年蚊子幼虫也收集了来自同一人口作为控制。这些幼虫被确定按蚊和库蚊的休息位置的幼虫进一步证实了使用形态学键出现的未生育过的;下颚须的长度,翼点、昆虫等的口器和腹部。

2.4。形态学鉴定野生蚊子向量

所有蚊子样品收集被确定女性形态和男性生殖器。属层次的识别是用多种方法使用形态主要包括下颚须的长度,翼点、昆虫等的口器,腹部结束40×放大(19]。

2.4.1。DNA的提取

DNA提取使用试剂盒®试剂(20.]。蚊子的部分(头、胸和腹部)在试剂盒均质®试剂使用玻璃聚四氟乙烯25°C和漩涡,以确保彻底和完全的隔离和溶液化的大分子。由此产生的混合物被分为三个阶段(较低的红phenol-chloroform阶段,一个界面,无色上层水相)。250年μl反萃取缓冲区(4 M硫氰酸胍;50 mM柠檬酸钠;1米三,pH值8.0)添加到苯酚和间期阶段,和混合物在室温下孵化了10分钟。样本然后离心机在13200 rpm 15分钟在4°C。上阶段摘除,同等体积的100%异丙醇添加和孵化隔夜−80°C。孵化后,样本离心机在13200 rpm 15分钟在4°C。上层清液被免职,颗粒与70%乙醇洗3次,然后筛选了20的TAE缓冲区的最后一卷μl在pH值8.0和纯度测定A260/280 [21,22]。

2.4.2。分子识别班氏丝虫

班氏丝虫从野外收集了受感染的蚊子被确定使用PCR技术。引物(表1)被用来放大188个基点SspI重复的班氏丝虫(23]。PCR在执行thermocycler(应用生物系统公司)与条件设定在96°C 15秒之后,25 94°C的周期为3秒,3秒56°C, 72°C 5秒(24,25]。总反应体积25μl包含2μl的DNA样本,10毫米Tris-HCl MgCl pH值9.2,2毫米₂75毫米氯化钾,每个deoxynucleotide三磷酸的1.2毫米,10 pmol每个SspI正向和反向寡核苷酸引物(表1),2 Taq使用单位。

(1)RNA的提取。明确水表面从蚊子获得匀浆在DNA隔离被转移到一个新的1.5毫升RNase-free管相同体积的RNase-free 70%。乙醇添加后的混合物转移到一个RNeasy旋转列和离心机在18000 rpm,持续30秒。此后,流过被丢弃。700年μl RW1缓冲区的添加到列和离心机在18000 rpm 30秒和500年转移到一个新的集合管μl (RPE缓冲区添加和离心机在最大速度为2分钟。流经被丢弃,列被转移到1.5毫升RNase-free收集管和筛选了20μl RNase-free水。提取核糖核酸测定的浓度和纯度A260 / A280。

(2)互补DNA合成(互补)。反转录的RNA cDNA上标第一链合成系统进行。程序是基于表达载体的协议(新英格兰生物实验室_公司)在20μl逆转录混合物。1μl的孤立的RNA和2μl随机五个一,nuclease-free水被添加到总量。当时在65°C的环境5分钟,之后,ProtoScript II反应混合物(2 x)和ProtoScript II酶混合(10 x)被添加,然后孵化25°C 5分钟后跟42°C 1小时。最后,酶反应是灭活在80°C 5分钟。

(3)Actin-1放大。聚合酶链反应进行了在热循环(应用生物系统公司)总反应体积50μl使用通用引物序列(表1)的放大actin-1互补脱氧核糖核酸(13]。PCR混合包含5μ1.5 l 10 X PCR缓冲μl Mgcl₂(50毫米),1μl核苷酸(10毫米),1μ每个引物l(10毫米),0.4μl聚合酶(5 U /μl), 2μl cDNA、和38.1μl DEPC-treated水条件的设定在96°C 15秒之后,25 94°C的周期为3秒,3秒56°C, 72°C 5秒(25]。

(4)琼脂糖凝胶电泳。PCR获得产品的识别班氏丝虫和actin-1可视化在1.5%琼脂糖凝胶染色0.5μg / ml溴化乙锭检测放大DNA片段。因此,5μL的PCR产品添加到1μL加载染料的电泳。琼脂糖凝胶是由重1.5克的粉和溶解在100毫升TAE缓冲区和倒在一个铸造托盘允许聚合,在室温下固化,然后电泳进行使用1 x TAE在100伏minigel系统为一个小时。凝胶的可视化是一个紫外线透照器,PCR产物的大小估计相比100个基点的DNA分子的流动梯(26]。

(5)测序Actin-1基因的扩增子。使用QIAQUICK PCR产品纯化PCR净化设备(美国试剂盒)后,制造商的协议。测序进行了使用BigDye终结者v3.1循环测序工具在DNA纯化PCR产品热循环。

(6)定量聚合酶链反应(qPCR)。评价mRNA水平做了使用SYBRGreenER™qPCR SuperMix通用(美国热费希尔科学)制造商的指示后,反应总额的20μl。引物(表1)actin-1和GAPDH(内部控制)也同样用于一式三份。的反应,2μl reverse-transcribed产品(互补),10μl Luna普遍qPCR混合,1μl (RNAse-free水,1μl正向和反向引物在场的每个20μl最后的体积。热循环条件下由1−95°C循环15分钟和四十周期为15秒95°C, 15秒62°C, 72°C,持续30秒。融化曲线得到每个定量PCR,和二阶导数最大方法被用来确定交叉点(Cp)对个人样本27]。实时聚合酶链反应(生成的数据表2)进行了分析使用相对量化方法(28]。

2.5。数据分析

为了解决生物差异,实验重复至少三(3)倍和适当的数据被描述成意味着±SEM。群体之间的变化测量使用t以及借助社会科学统计软件包的软件版本20.0。测量水平的意义被认为是统计学意义使用最小意义差(LSD)。

3所示。结果

3.1。蚊子分布和形态识别

表3显示,100年幼虫从繁殖地点收集研究区和在实验室饲养成年,50库蚊和50按蚊从幼虫阶段确定;然而,只有41岁和33了库蚊和按蚊由于死亡率分别。2000年野生捕捉蚊子,784冈比亚疟蚊sl和925年被确定这种致倦库蚊每组的哪一个是积极的w .丝虫。剩下的291只野生捕获蚊子被确定埃及伊蚊而不是感染了w .丝虫。形态学特征用于识别包括上颌长度的触须,翼淡点,和规模模式在腹部如前所述29日]。

3.2。分子检测班氏丝虫和放大Actin-1

丝虫的寄生虫从这项研究确定了聚合酶链反应SspI引物(23]188个基点的扩增子大小如图1。图2显示的扩增子actin-1基因放大使用actin-1通用引物。凝胶的乐队切除(图2)、净化和测序(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。

3.3。表达Actin-1

图4显示了actin-1表达式的结果在野生捕获班氏丝虫来华的冈比亚疟蚊sl和这种致倦库蚊。表达式的褶皱actin-1基因冈比亚疟蚊增加了4.85的这种致倦库蚊4.09相对于控件的显示成倍增加。折叠成比例增加的actin-1基因表达被发现高冈比亚疟蚊sl0.7526相比这种致倦库蚊虽然没有统计学意义( )。

4所示。讨论

班氏丝虫淋巴丝虫病的主要原因是由蚊子传播的向量。vector-parasite交互和其他蛋白质,actin-1已经涉及了成功的病原体的传播。Actin-1识别病原体是一种细胞外因子,介导抗菌防御(12]。昆虫actin-1分泌细胞在免疫挑战通过exosome-independent通路,它绑定到表面的细菌,调解他们的吞噬作用和直接杀死。球状和丝状从而显示不同的功能细胞外免疫因素(30.]。不幸的是,在一个流行国家如尼日利亚,有很少或根本没有关注pathogen-vector交互研究解读所涉及的生物因素。在这个沟通,我们识别和评估actin-1基因表达在野生捕获班氏丝虫来华的蚊子向量获得从他们的自然环境流行病学研究中Tsafe当地政府扎姆法拉州,尼日利亚。

从这项研究中,只有2蚊子被发现感染丝虫的线虫从是哪一个冈比亚疟蚊sl和另一个是这种致倦库蚊。丝虫的标本是班氏丝虫经PCR扩增SspI基因的检测班氏丝虫与相应的扩增子大小为188个基点。这个结果与测试结果证实的假设班氏丝虫可以确定在蚊子向量使用SspI重复(24]。同样,bancroftian丝虫病感染人类和调查库蚊蚊子巴西亚马逊西部地区显示,影响传输和控制使用SspI重复一个签名的寄生虫已被证明是一个强大的工具来评估蚊子在流行地区的污染强度。由于这些优点,它已经取代了传统的解剖方法诊断(31日]。类似地,SspI对限制性内切核酸酶重复有一个独特的识别网站全部或大部分的重复副本。这个DNA家庭分散,genus-specific,存在于所有不同的地理隔离的班氏丝虫测试(23]。

表达式actin-1成倍增加的冈比亚疟蚊被发现是4.85和4.09这种致倦库蚊而控制。这些值表明actin-1表达的调节这种致倦库蚊同意其他报道upregulation actin-1蛋白在感染和丝虫的寄生虫的发展在其向量(12]。Actin-1表达冈比亚疟蚊0.7526以上的这种致倦库蚊这可能是由于这一事实吗按蚊物种是研究区主要的向量和他们已经适应了改善的效果通过各种机制包括melanisation寄生虫感染,封装和吞噬作用。蚊子免疫机制涉及生化反应使用外骨骼表皮,表皮的物理和化学性质,肠道上皮细胞,生殖附腺[32]。这种免疫机制的主要特点是通过模式识别受体识别nonself-parts (PRRs),其为病原体识别的分子模式(pamp)触发激活的细胞和体液免疫反应,两个代理一起消除病原体病原体利用周围的黑色素(33]。通常,细胞反应包括吞噬,有节,封装,而体液包括抗菌系统性分子,一氧化氮(NO)生产和溶菌酶(14]。蚊子也拥有先天免疫对抗病原体感染(11),支持的事实actin-1确实是先天免疫反应的一部分由于parasite-vector互动(12]。吞噬细胞的先天免疫系统包括循环和组织。这些细胞识别和吞噬病原体通过germline-encoded模式识别受体等特定的微生物产品的toll样受体(34]。人数通路被发现蚊子控制血细胞增殖和细胞免疫反应中起着至关重要的作用,对于actin-1的表情,转铁蛋白,defensin蛋白质封装和杀死寄生虫的关键(35]。

5。结论

野了冈比亚疟蚊sl和这种致倦库蚊感染了w .丝虫从当地政府Tsafe尼日利亚扎姆法拉州显示upregulation的领域actin-1基因。因此,针对actin-1作为蛋白质调节由于寄生虫之间的交互和向量可以作为新战略的控制寄生虫传播流行地区。

数据可用性

原始数据和样品用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

摩西Edache Entonu、阿利尤古萨乌默罕默德和亲戚Iliya s Ndams概念化,执行,和解释该研究也参与编写和校对。阿利尤古萨乌默罕默德和亲戚Iliya s . Ndams设计研究。

确认

作者感谢博士的帮助下Muawiya Abarshi穆萨系的生物化学,和阿利尤古萨乌Abdulwahab Agada耶利米的动物学、Ahmadu贝洛大学Zaria。这项研究是由非洲卓越中心被忽视的热带疾病和法医生物技术、Ahmadu贝洛大学Zaria Entonu摩西Edache。