文摘
两亲分子生物表面活性剂是由许多微生物,通常是细菌、真菌和酵母。他们拥有的财产减少张力膜的界面。没有进行研究志贺氏杆菌物种显示biosurfactant-like分子的作用(BLM)致病性。本研究的目的是评估的能力志贺氏杆菌环境和临床菌株产生BLM在致病性生物表面活性剂的介入进行调查。我们的研究表明,BLM分泌细胞外介质EI24从80%降至100%。分泌物是根据III型分泌系统(T3SS)。此外,我们的研究结果表明美国flexneri,鲍氏血清,和美国sonnei能够与疏水的地区17.64%,21.42%,和22.22%的疏水性,分别。BLM分泌是完全避免由于100毫米抑制T3SS苯甲酸和1.5毫克/毫升的酸。铜绿假单胞菌窝藏T3SS能够产生100%的BLM T3SS抑制剂的存在或没有。分泌BLM的提取与氯仿等有机溶剂,这完全可以看作是lipopeptide或多肽化合物。的分泌BLM允许一些志贺氏杆菌菌株诱导多细胞现象“蜂拥”。
1。介绍
致病性和致命的微生物一般的摄入影响人民在发达国家和发展中国家。志贺氏杆菌是一种革兰氏阴性细菌属于肠杆菌科家庭,是菌痢或志贺氏菌病的病原体1]。5岁以下儿童是受影响最严重。越来越多的志贺氏菌病被认为是像被忽视疾病;同时,每年是164300的死亡通知2010年世界各地。大多数死亡发生在撒哈拉以南非洲地区和南亚地区2,3]。这包括刚果共和国,令人惊讶的是,在这个领域没有进行流行病学研究。属志贺氏杆菌包括四个物种(美国flexneri,美国sonnei,痢疾杆菌,鲍氏血清)。十个细菌痢疾杆菌1型,100年到180年的细菌美国flexneri或美国sonnei足以产生症状的感染。
志贺氏杆菌的致病性是基于的毒力质粒pWR100 mxi-spa轨迹编码三型分泌系统(T3SS)参与效应生产计划中,C和D(转运蛋白和小费)入侵宿主细胞(4]。一项研究表明,在我们的实验室志贺氏杆菌sp.隔绝布拉柴维尔废水能够从汽油或柴油乳化的碳氢化合物5]。根据两性分子的特性,生物表面活性剂表面显示各种活动,解释他们的应用程序在几个领域与乳化、发泡、洗净、润湿、分散、致病性、疏水性化合物的溶液化(6,7]。生物表面活性剂是由两个革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌和不动杆菌calcoaceticus。鼠李糖脂生物表面活性剂中是众所周知的,很多信息被记录在生物化学和生物技术的应用程序(8]。
志贺氏杆菌研究较多的致病性机制使用5 s flexneri M90T菌株为革兰氏阴性细菌模型。通过这种方式,这项工作的目的是研究通过三型分泌系统的参与BLM (T3SS)通路。此外,这项工作将评估的批准志贺氏杆菌可以使用BLM促进上皮细胞内的入侵和传播。
2。材料和方法
2.1。菌株和文化条件
四个志贺氏杆菌菌株被好心的提供和收集从实验室的分子细菌学(将进医学院学习,Erasme校园,布鲁塞尔自由大学的)。这些措施包括美国flexneri5 M90T,美国flexneri spa40- - - - - -,美国sonnei,鲍氏血清。三个病人的纯培养菌株布拉柴维尔大学和医院中心(CHU-B)在2018年。这些都是由在医院的病毒学和细菌学实验室。三十志贺氏杆菌在环境废水sp.菌株布拉柴维尔使用十进制稀释党卫军中。实验室菌株像铜绿假单胞菌和大肠杆菌全球被用作控制在这个研究。盘子上的菌株是传播包含磅中等与刚果红100μg / mL链霉素24小时37°C为野生型和50μ克/毫升spa40突变体。
2.2。乳化指数(EI24)测定
从5毫升细菌在一夜之间文化、乳化指数(EI24)计算作为BLM生产指标如前所证明(5]。介质pH值调整到7.2,并配以汽油或柴油为300毫升的媒介(1毫升)。EI24调查是通过添加燃料与磅中等1:1比例(v / v)。5分钟的解决方案是涡和孵化24小时在37°C。乳化率计算通过乳化层的高度。此外,EI24决心汽油和柴油燃料的碳氢化合物。所有的实验进行了一式三份;EI24 =身高乳剂层/总高度的解决方案×100。
2.3。细菌群集分析
大量的研究志贺氏杆菌应变用在这项研究中,使用含有0.5%的板化验高贵与0.5%葡萄糖琼脂和LB培养基。混合物在121°C消毒,在15分钟。灭菌后,介质与适当的抗生素包括链霉素100补充μ50 g / mL为野生型和卡那霉素μg / mL弗氏志贺菌spa40突变。大约6小时后倒盘子,细菌接种和传播使用消毒铂丝用指数期细胞(0.6 (OD600))生长在各自媒体用于大量的实验。群集板块却是成像比较端点发展孵化在30°C成像前24小时。
2.4。细菌粘附实验
细菌疏水性表面的粘附是评估根据罗森博格(描述的方法9]。疏水性是评估按照下列公式:% H =一个0−一个/一个0 100∗一个0:在混合和OD一个:OD在水相的涡流。
2.5。感应用刚果红试验
志贺氏杆菌sp.一直在培养5毫升的最后一卷。一夜之间文化是离心机和500毫升之一μL无菌PBS和10μl(刚果红(10毫克/毫升)一直温柔地添加和混合颗粒通过避免破损的细胞。样本孵化与搅拌37°C。30分钟的孵化后,样本离心机在15.000 rpm在室温下15分钟。浮在表面的慢慢恢复,与汽油或柴油混合燃料。乳化指数(EI24)已经决定,在部分2。2。
2.6。提取Biosurfactant-like分子
三种方法被用来提取生物表面活性剂。
2.6.1。盐酸和乙醇沉淀
一夜文化一直在离心机13000 g×15分钟。上层清液收集后,HCl 1 n和90度乙醇添加到上层清液。生成的沉淀已经酝酿样本在一夜之间在4°C。混合物在13000克15分钟离心获得颗粒。获得的颗粒进行了EI24评价乳化的碳氢化合物的能力。
2.6.2。硫酸铵沉淀试验
一夜文化一直在离心机13000 rpm 15分钟分离上层清液和颗粒。然后,15毫升的上层清液混合硫酸铵(80%)15分钟。最后,这是孵化用颤抖的一夜。混合物已经在6000 rpm离心机在室温下30分钟。丸是均质用PBS缓冲。乳化活性已被评估。
2.6.3。生物表面活性剂使用氯仿萃取
24小时文化是严格离心机在15000年15分钟,以避免任何残留的细菌。一个卷的上层清液添加同等体积的氯仿(v / v)。混合物被漩涡强烈不安。在6000转离心后10分钟,非水阶段恢复。只允许溶剂蒸发完全没有加热40°C以上。残渣溶解在PBS缓冲。乳化活性测试通过与汽油或柴油混合燃料相比,上层的起点。乳化指数(EI24)已经被确定。
2.7。苯甲酸和水杨酸对生物表面活性剂分泌的影响
的可行性志贺氏杆菌压力首先评估了不同浓度的苯甲酸和水杨酸。美国flexneri5 M90T是生长在Luria-Bertani肉汤(磅)在不同浓度的苯甲酸(50毫米,100毫米,250毫米和500毫米)和水杨酸(1.5毫克/毫升,3毫克/毫升,6.25毫克/毫升,和12.5毫克/毫升)。在那之后,所有的志贺氏杆菌菌株生长在Luria-Bertani肉汤(磅)添加适当浓度的苯甲酸或水杨酸在37°C,在24小时。所有上层清液离心机和生物表面活性剂的分泌是评估通过乳化试验(EI24)。
2.8。统计分析
GraphPad棱镜7和Excel软件被用于分析。数据代表至少三个复制的算术平均值。数据被表示为平均数±标准差和学生的测试是用来确定统计菌株之间的差异 被认为是重要的。主成分分析(PCA)是用来调查之间可能存在的相关性志贺氏杆菌和乳化指数(EI24)。任命之前,乳化活动的比例数据转化为更好的满足正常使用的假设ln (x+ 1)。所有的分析都使用CANOCO(规范社区祝圣礼,版本4.5)。
3所示。结果
3.1。筛查生物表面活性剂的生产
为了开展我们的研究,我们首先评估如果志贺氏杆菌菌株能够产生BLM在细胞外介质。图1表明,环境压力和临床株能分泌BLM通过展示乳化比例介于15%和100%(图1(一))。美国flex内里spa40突变无法产生BLM相比铜绿假单胞菌作为积极的控制。的菌株产生BLM如图1 (b)。所有菌株并不代表(图1 (b))。
(一)
(b)
EI24菌株的范围从80%到100%。这些措施包括志贺氏杆菌flexeneriM90T,志贺氏杆菌鲍氏(Sbo),志贺氏杆菌sonnei(Sso),志贺氏杆菌sp (Ssp) Ssp2、SE3 SE5, SE9, SE11, SE12, SE13, SE14, SE15, SE16, SE18, SE20, SE21, SE22, SEI24, SE25, SE2626, SE27 SE29, SE30(图2)。积极的控制已经发现率。SE1、SE8 SE23, Ssp1范围在40%和60%之间。SE4、SE10 SE28在20%和40%之间。SE17和SE2从60%降至80%志贺氏杆菌flexneri spa40突变(spa40)不能生产生物表面活性剂,和SE6大约是17%,从0%到20%(图2)。
3.2。的能力志贺氏杆菌在大量的测试
聚集诱导了BLM的生产。为了演示志贺氏杆菌可以传播到上皮细胞,首先调查如果所有志贺氏杆菌菌株用于本研究能够群利用LB培养基+ 0.5%葡萄糖0.5%。作为一个结果,美国flexneri5 M90T,美国sonnei,鲍氏血清能够传播和群体。spa40 -没能群(图3)。的群集配置文件的一些示例志贺氏杆菌菌株24小时后。我们发现美国flexneri spa40——不能群和美国sonnei有一个特定的群集配置文件比其他志贺氏杆菌菌株用于这项研究。
3.3。细菌粘附烃(浴)
强调BLM的生产志贺氏杆菌菌株诱导与疏水区域,我们进行分析评价与碳氢化合物的能力。图4显示了一些细菌粘附的状况志贺氏杆菌菌株。只有美国flexnerispa40突变并不与碳氢化合物的区域(图4(一))。美国flexneri,鲍氏血清,美国sonnei是积极的带浴室的技术包括疏水性的比例为17.64%,21.42%,和22.22%,分别为(图4 (b))。
(一)
(b)
3.4。生物表面活性剂的筛选分泌志贺氏杆菌sp
强调了生化BLM分泌的规范志贺氏杆菌菌株在这项研究中,使用的文化志贺氏杆菌菌株与supernatant-emulsified碳氢化合物(汽油或柴油)被用来识别biosurfactant-like分子的类型。降水在盐酸、硫酸铵和乙醇已经完成。所有菌株表现出沉淀底部的管(图5(a))。乳化指数进行EI24沉淀之后。只有沉淀的美国flexneri spa40 -上层清液不乳化柴油和/或柴油。年代。flexneri,年代。sonnei,年代。鲍氏血清,三志贺氏杆菌sp. EI24的100%(图5(b))。
(一)
(b)
菌株与已知油气乳化能力选择使用生物表面活性剂从氯仿等有机溶剂提取试验。生物表面活性剂可以提取后蒸发的氯仿在40°C美国flexneriM90T。什么也没得到spa40-。蒸发后的提取,悬浮在PBS,能乳化汽油或天然气石油100%的EI24(图5(b))。
3.5。BLM分泌三型分泌系统(T3SS)
包括临床菌株美国flexneri5 M90T,美国sonnei,鲍氏血清,三个志贺氏杆菌sp, 30环境压力包括SE1 SE30培养诱导的分泌效应在刚果红归纳。志贺氏杆菌物种被发现分泌BLM刚果红诱导条件EI24从80%降至100%。突变美国flexnerispa40——没有乳化汽油或柴油燃料的刚果感应0%的EI24(图6(一))。后乳化指数刚果红3型分泌系统的志贺氏杆菌应变外观见图6 (b)。
(一)
(b)
3.6。苯甲酸和水杨酸对生物表面活性剂的生产
所有志贺氏杆菌菌株生长在Luria-Bertani(磅)汤的随机浓度的苯甲酸和水杨酸(数据没有显示)。我们考察了不同浓度的苯甲酸增长包括50毫米,100毫米,250毫米和500毫米。水杨酸而言,1.5毫克/毫升,3毫克/毫升,6.25毫克/毫升,12.5毫克/毫升被随机选中。所有志贺氏杆菌菌株生长正常生理范围内的苯甲酸由CFU /毫升,但大幅增长是有趣的在100毫米苯甲酸和水杨酸1.5毫克/毫升(数据没有显示)。
突出的分泌T3SS BLM的角色,我们评估了苯甲酸和水杨酸的酸抑制生物表面活性剂的生产。细菌以前孵化与100毫米苯甲酸(BA)和1.5毫克/毫升水杨酸(SA),我们发现美国flexneriM90T,年代。sonnei,年代。鲍氏血清,SE5未能产生BLM乳化指数0% EI24(图7(一))。这容易显示志贺氏杆菌株不再乳化汽油或柴油苯甲酸和水杨酸(图7(一))。菌株能够乳化汽油或柴油没有苯甲酸和水杨酸。外观(图所示7 (b))。铜绿假单胞菌以来一直作为积极控制T3SS广泛守恒在大多数革兰氏阴性细菌,和令人惊讶的是吗铜绿假单胞菌能够产生100% BLM的存在或缺乏英航和SA。值得注意的是,spa40——是无法产生BLM既不存在也没有英航和SA如前所述(图7(一)7(一))。
(一)
(b)
4所示。讨论
进行这项工作的主要目标的理解美国flexneri5 M90T上皮细胞的入侵机制。志贺氏杆菌菌株从环境领域,收集医院,或实验室。所有菌株有能力生产BLM在细胞外介质,增长和生产是严格根据T3SS途径。这个结果显示得很清楚,这些分子中分泌细胞外介质所描述的乌斯曼et al。10]。spa40突变体没有T3SS,不能分泌BLM。几项研究已经证明了的角色T3SS分泌的效应蛋白的数量参与入侵和传播(11,12]。
乳化指数是证明能力的菌株的直接法生产生物表面活性剂或不5]。这些分子之间形成乳剂已经知道两个水火不相容的(13,14]。从非细胞浮层显示实验美国flexneri5 M90T以及鲍氏血清,s . sonnei和其他志贺氏杆菌sp.能够乳化汽油和柴油燃料EI24从80%降至100%。革兰氏阴性细菌是有据可查的克服这一现象。这些包括铜绿假单胞菌(13,14),沙门氏菌enteridis(15),不动杆菌sp。16),而粘质沙雷氏菌(17]。革兰氏阳性细菌被称为高效生产BLM。孢子形成的细菌如枯草芽孢杆菌,b . lichenifornis,Lysinibacillus louembei被广泛用于生产BLM [18- - - - - -20.]。
生物表面活性剂的一些多细胞现象,比如爬几位细菌物种中描述21]。通过使用特定的文化媒体,我们都已经表明,菌株志贺氏杆菌在群集分析属是积极的。群集现象促进了生物表面活性剂的生产能力。这一现象与抗生素耐药性有关,毒性和生物膜的形成变形杆菌,沙门氏菌血清型沙门氏菌感染,沙雷氏菌属(22- - - - - -24]。这个想法强化了这一事实志贺氏杆菌sp.还可以使用生物表面活性剂的致病性。没有确定基因直接参与BLM生物合成。在这项工作中,我们发现ygaG是染色体的基因美国flexneriM90T。YgaG,这种基因的产物,股票90%的身份与勒克斯涉及群体感应和生物膜的形成25,26]。RhlA、RhlB RhlR已知蛋白质促进鼠李糖脂分泌(27]。生物表面活性剂与群体感应的分泌28]。
致病性的属志贺氏杆菌是由T3SS,能分泌大量的效应蛋白到目标细胞(29日,30.]。在缺乏细胞接触,分泌器不是功能(31日];然而,一些蛋白质分泌状况泄漏。细胞接触是模仿用刚果红(11]。在刚果红诱导条件下,志贺氏杆菌菌株乳化汽油和柴油燃料,而美国flexneri5 M90T spa40突变不乳化他们了。突变美国flexneri spa40——没有T3SS11]。的美国flexneri spa40——在noninducible条件(32)或不产生BLM刚果红诱导条件。此外,通过阻断T3SS使用苯甲酸和水杨酸的酸化合物,我们证明了BLM不能分泌细胞外介质。这证实了通过T3SS BLM分泌。铜绿假单胞菌能分泌BLM抑制剂的存在或没有。这让我们假定鼠李糖脂分子可以使用另一个途径。一个流出机制是在顶部铜绿假单胞菌(10,33]。这与苯甲酸和水杨酸的酸抑制试验表明BLM的分泌合成一个完美的关联志贺氏杆菌的失活和III型分泌器。
关于BLM特征,降水试验如盐酸、硫酸和乙醇铵允许假定分泌BLM可能lipopeptide或肽的特性。只有肽或lipopeptide生物表面活性剂可以沉淀在一个非常低的pH值或硫酸铵(34,35]。在蛋白质组学研究中,连续的硫酸铵沉淀蛋白质蛋白质可以被“salting-in”或“盐析”效应(36),这必然会导致蛋白质总量,因此降水的形成。BLM沉淀能够乳化汽油和柴油燃料。生物表面活性剂鼠李糖脂一样,surfactin emulsan,由有机溶剂(可推断出的14,37]。此外,我们的研究表明,生物表面活性剂排泄志贺氏杆菌sp.与氯仿提取与更高的效率和稳定在40°C。
BML扮演着几个重要角色特别是微生物的附着,生物利用度,解吸和防御策略。微生物BLM的最重要作用是附着力好的评价——而且交互的接口(38]。铜绿假单胞菌细胞表面疏水性的最好的例子是合理的存在cell-bound鼠李糖脂(39]。我们的新发现表明,通过分泌BLM,志贺氏杆菌sp.可以很容易地结合细胞疏水性界面通过与脂质筏相互作用[30.,40- - - - - -42]。通过结合在细胞膜上,BLM允许减少膜的张力和帮助translocon-like IpaB-C [43,44)和提示组件IpaD (45,46接近宿主细胞膜和细胞质膜内自动插入。
许多机制已经演示了如何美国flexneri可以传播内上皮细胞(47,48),帮助摆脱自噬现象(49和传播宿主细胞内50)通过使用一个特定的域的IcsB与胆固醇(30.]。在这项工作中,我们显示美国flexneri,鲍氏血清,和美国sonnei使用群集现象可能会蔓延。没有研究先前记录的能力聚集在提到的条件。这有效地强调和放大的想法志贺氏杆菌可以使用几种机制,可以帮助从细胞到细胞通过分泌BLM蔓延。我们正在调查BLM的分泌上皮细胞内。根据我们的发现,我们可以建议志贺氏杆菌可以使用BLM在上皮细胞入侵和传播途径。
5。结论
为了促进上皮细胞的入侵机理的理解志贺氏杆菌sp,首先显示志贺氏杆菌菌株以及临床或环境菌株能够分泌biosurfactant-like分子直接在细胞外介质。第二,我们已经表明,biosurfactants-like分子的分泌取决于三型分泌系统(T3SS)。我们的研究表明,生物表面活性剂与lipopeptide或肽的特性,稳定在40°C,可以发挥突出作用志贺氏杆菌致病性机制包括bacteria-host细胞相互作用,细胞代谢和细胞传播。这项工作有助于理解与几个组件相关的基因能够促进生物合成,调节,BLM的分泌。用几个基因敲除掉志贺氏杆菌编码效应蛋白质如计划中,IpaC, IpaD可以东方调查。在继续我们的研究实验中包括MALDI-TOF和高效液相色谱的方法更多的生化BLM的特点。。
数据可用性
Excel表包括数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢教授Eric Deziel(中心Armand-Frappier桑特Biotechnologie)为他的珍贵和明智的建议,教授安妮Botteaux(布鲁塞尔自由大学的)科学讨论,博士Armel Ibala Zamba不断鼓励和有用的数据分析在发表前和女士属性Lakhloufi,卢瓦先生土地肥沃的Djesone Bantsimba Malonga先生Chrislen Kapende提供志贺氏杆菌sp.菌株。