氧化应激的生物标志物在Balb真菌环境污染指标/ C从西南，尼日利亚监控小白鼠

抽象

在区域中的存在，共同空气真菌的检测是用于过敏性真菌疾病的预防和治疗非常重要。因为真菌的无处不在的性质，四种不同的真菌种类中生产的抗氧化剂和活性氧的产生的在BALB效果的/ C白化小鼠进行了研究。五十四BALB / c小鼠随机分成八组（n = 6）和正常对照组。四个不同的真菌板，其包括黄曲霉，曲霉属真菌penicillioides，桔青霉，和青霉菌chrysogenum,这是在环境采样中最丰富的真菌物种一周进行培养，使2.3×10⁷和3.2×10^五然后在每只老鼠的鼻孔内注射无菌盐水。结果表明，与正常对照组小鼠相比，真菌接种的小鼠均产生显著的活性氧(P<0.05)，抗氧化参数显著降低，且呈剂量依赖性。因此，结论是黄曲霉，曲霉属真菌penicillioides，桔青霉，和青霉菌chrysogenum能改变和降低balb/c小鼠的免疫功能。因此，本研究旨在确定尼日利亚西南部最常见的空气传播真菌种类，并研究其过敏反应。

1.简介

人类气道始终连续地暴露于发生在较高的数量和比花粉或其它已知的空气变应原的持续时间较长的大部分时间真菌。这些真菌最常见的是曲霉属真菌和青霉种类。致敏到空气中的真菌元件已被证明是与哮喘的严重程度和后死亡[相关联1]。现在空气真菌污染已成为因为某些真菌孢子是存在于室内和室外的致敏性的环境健康问题。氧化应激发生不仅作为炎症的结果，但也从暴露于空气污染，香烟烟雾，以及其他因素如真菌孢子和引线的吸入到生产活性氧是由抗氧化剂的在体内的作用平衡[2]。真菌孢子和菌丝存在于环境和呼吸置身于其中全年几乎是恒定的。在热带地区最常见的空气真菌包括种属中发现青霉，曲霉属真菌，镰刀菌素，枝孢属,和链格孢。过敏原的其他来源包括花粉，屋尘螨和猫皮屑，但真菌何况还有发芽呼吸道的能力和分泌额外的分子。真菌也可以寄居在呼吸道。这是关于过敏性炎症的最大差异也可能是最重要的因素在真菌的病理能力。因此，真菌具有在从致敏角度触发针对潜在病原体的宿主免疫应答，同时还产生过敏性反应毒素，酶，和其它促炎因子可在触发和加剧由慢性炎性病症中发挥作用的方面对个体的影响更大刺激先天免疫应答和适应性影响Th2型免疫的（Babiceanu，2011）的发展。易受真菌经由方式，如吸入，皮肤接触，或摄取发生。自由基和活性氧物质能够破坏完整性，并且还改变生物膜的功能，这可能导致许多病理过程的发展（Faix等人。2003）。所有生物体已经发展了已知抗氧化剂，以克服由环境因素引起的毒性时复杂的细胞防御。活性氧物质和抗氧化剂之间的不均衡被称为氧化应激。氧化应激发生在许多过敏性和免疫状况。然而，针对反应性氧物质的主要防御是内源性的抗氧化剂，其包括超氧化物歧化酶（SOD）的家庭，过氧化氢酶，谷胱甘肽过氧化物酶，谷胱甘肽S-转移酶，和硫氧还蛋白和低分子量化合物如谷胱甘肽和硫辛酸[3]。细胞因子时变应原或异物的免疫应答的早期阶段，其触发在接下来的几个小时的细胞炎症应答释放其在复发症状后导致宿主[4，五]。活性氧产生通过该系统被入侵者或其他方式的轰击是一个常数问题为哪些细胞具有发达多重保护机制来生存。鲍勒和Crapo，2002年[6的报告指出，吸入香烟烟雾会增加对超氧化物和过氧化氢的接触。当机体内的氧化力和抗氧化防御系统之间发生不平衡时，氧化应激就会产生，这被认为有利于氧化损伤，而氧化损伤与哮喘和其他疾病的发病机制有关(Marple, 2010)。氧化应激作为真菌过敏的作用还没有得到很好的研究。这些抗氧化剂分子的组合因亚细胞和解剖位置的不同而不同。许多报道表明，氧化应激在哮喘的发病机制中起着重要作用，许多研究者已经表明，哮喘期间活性氧的增加与肺中许多生物分子的破坏有关。在对尼日利亚大气中空气传播的真菌孢子和吸入空气中存在的各种真菌的后果进行环境取样方面做的工作并不多。

因此，这项工作的目的是研究四种真菌抗氧化和活性氧的产生在BALB / c小鼠的肺的效果。

2.材料和方法

2.1。大气真菌收集

航空孢子为期两年每月采样。用于由含有琼脂开口板采样开闭板法（二氯硝基苯甘油18和马铃薯葡萄糖琼脂），将其在实验室中无菌条件下制备。将样品收集一式三份，并转移到植物，拉各斯大学部的真菌学实验室，和在室温下（28-31℃）下进行3至5天温育。菌落计数和生长物外观进行了监测。

2.2。鉴定真菌

一旦有生长，地形，质地和色素沉着菌落的每个特定类型的存在下，以准确地识别真菌指出。这些真菌的身份用文化和形态特征以及它们与相关文本不同种类的确认代表如Alexopolous等比较确定。（2007年），巴尼特和亨特（1999年），和埃利斯等人。（2007年）。

由于形态鉴定存在的局限性，进一步将分子方法用于取样真菌的鉴定(表)1)。

2.3。DNA提取

真菌DNA的提取使用两种不同的协议，即修改十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)协议。

2.4。凝胶的提取和测序

凝胶的提取和测序在美国加州大学河滨分校基因组学研究所核设施进行。

2.5。引物和扩增子设计

为了使100μ引物M个浓度的储备溶液中，n摩尔的在所述管的数目乘以10，得到洗脱缓冲液的用量以将其稀释之后，10μl被吸出来和90混合在一起μ洗脱的L缓存器给一个有效的解决方案。

所选择的靶序列是75bp的之间和100长，50至60％的GC含量不含有二级结构。引物处于C 55和65°之间的熔融温度。寡核苷酸使用Primer-BLAST，通过NCBI开发了一个程序使用该算法的引物的引物3序列进行比较（喷砂），以用户选择的数据库，以确保它们是感兴趣的基因的独特和专门设计的。

实验在符合动物福利。八十BALB / c小鼠（5-6周龄）从伊巴丹大学的兽医教学医院购买，并保存在生物化学系的动物房。动物实验装置之前水土不服一周。他们喂养的老鼠从球团厂Ladokun伊巴丹和水购买随意。驯化后，每笼6只小鼠。四个真菌物种,曲霉属真菌penicillioides，答:flavus，桔青霉，和p . chrysogenum分离并继代培养，直至获得纯培养，并制成两种不同浓度((2.3 x 10 ?⁷和3.2×10^五）在小鼠鼻内滴注前，从而，共八组和一个对照组，其不经任何真菌接种。

2.6。真菌接种

黄曲霉A. penicillioides，产黄青霉，和P.桔在37℃在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）从在Lagos和尼日利亚伊巴丹各种环境中分离，并生长至稳定期（72小时）。分生孢子通过用无菌的不含内毒素的磷酸盐缓冲盐水（PBS）温和洗涤收获。然后将得到的真菌悬浮液通过无菌纱布的两层，以除去菌丝过滤。然后将培养物在无菌无热原盐水洗涤，并用血细胞计数器计数。小鼠在两种不同浓度（2.3×10与不同的真菌接种⁷和3.2×10^五）通过使用在每个鼻孔1ml注射器鼻内给药。

前对动物进行鼻内接种，将小鼠通过腹膜内注射用氯胺酮 - 甲苯噻嗪溶液（2.5毫克氯胺酮（道奇堡动物健康，道奇堡，爱荷华州）麻醉。

2.7。解剖分析

肺中无菌取出并放​​置在10毫升10％福尔马林。肺部（填充有磷酸盐10％缓冲福尔马林）中用于组织病理学评价10％的磷酸盐缓冲盐水中保存。

2.8。氧化应激的生物标志物的评估

动物组织（肺）与1.15％KCl中/ 4_C溶液中漂洗。在此之后，用0.1M磷酸盐缓冲液（pH 7.4 / 37℃）制备60％组织匀浆。细胞核和线粒体级分分离后，制备以10000g / 4℃12分钟从60％组织匀浆用于生化测定的上清液。还原型谷胱甘肽（GSH）是根据Jollow等确定。脂质过氧化作用是根据由Varshney和芥兰中描述的方法确定为丙二醛（MDA）。亚硝酸盐（NO 2 - ）中的组织水平估计为一氧化氮（NO）产生的索引。定量，基于由克雷斯波等人描述的格里斯反应。髓过氧化物酶（MPO）活性，多形核白细胞的积累和活化的指标，用的方法测定由Bradley等人描述。如由Gornal等人所描述的各种样品的蛋白质浓度通过双缩脲法来确定。（1949），有轻微的修改：碘化钾加入到试剂防止Cu析出^{2 +}氧化亚铜等离子。采用Misra和Fridovich(1972)的方法测定SOD活性水平。

Beutler等人的方法。（1963），随后在估计还原型谷胱甘肽（GSH）水平。

过氧化氢产生根据加利F.等人的方法测定的。，2005年。

2.9。统计分析

数据得到使用方差分析（ANOVA）的多个分析进行分析，并使用邓肯多范围检验（的DMTr）的显着性的以P <0.05的水平（95％置信区间）进行分离的装置。

3.结果

上的所有活性氧和除了抗氧化剂参数中的在BALB / c小鼠的肺上生化参数真菌孢子的不同接种物负载真菌孢子的效果方差分析的拟合模型产生的高度显著（P <0.01）影响过氧化氢这表明为两种治疗和接种物浓度没有显著差异。甲显著（P <0.05），用于接种物负载，也观察到对髓过氧化物酶（MPO），超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）（表效果2)。

活性氧和与真菌孢子接种BALB / c小鼠的肺中的抗氧化剂参数的分析的拟合模型表明，对照是显著更高为一氧化氮（NO），而丙二醛下（MDA），髓过氧化物酶（MPO），和过氧化氢（H₂Ø₂)。抗氧化参数的结果表明，对照组的谷胱甘肽含量较高

（GSH），蛋白质含量，和超氧化物歧化酶（SOD）。有没有在接种负载除MPO（活性氧物质）的两个浓度无差异显著而SOD和GSH为（抗氧化剂参数）也显示接种物负载之间显著差异（表3)。

负和显著（p≤0.05）真菌治疗和蛋白质之间的相关性存在（ - 0.55），SOD（-0.71），一氧化氮（-0.44）和GSH（-0.56），而阳性和显著（（p≤0.05）相关变化真菌过氧化氢处理和MPO之间存在。在接种负荷产生的负但不显著（p≤0.05）蛋白，超氧化物歧化酶，一氧化氮，和GSH但显著（p≤0.05）效果的相关性与MPO性（r = 0.31存在）。复制处理产生的正，但不显著（p≤0.05）作用于MDA，过氧化氢，一氧化氮，和GSH（表4)。

示出了在接种的小鼠的不同真菌的关系集群图表明，与对照独自站立和所有四个接种也集中在两个不同的簇的两个主要簇当中。曲霉属真菌penicillioides和桔青霉分别对同一子集群，同时黄曲霉和青霉菌chrysogenum也次级集群在一起。对照是单独独立的群集上（图1)。主成分分析的贡献显示抗氧化剂和反应性氧物质内的主分量的分布的类似水平。首席1最高比例的本征发现大多与SOD和一氧化氮。首席2的24.74征比例，以majorly有助于MDA和蛋白质的增加。第四主成分表现出与过氧化氢强烈增加而第六组分显示出与SOD（表很强的相关性五)。

散点图显示了接种生物对小鼠肺生化参数的活性的主成分轴变化。解释96.81%总变异的PC1与SOD、GSH、和对照呈正相关p . chrysogenum，P.桔，和A. penicillioides而一氧化氮和蛋白质含量与答:flavus与首席1显示负相关关系与一氧化氮表达较强的关联。在PC 2中说明的总变化的2.64％并表现出与对照和实验SOD正相关，而所有其它生化参数呈负PC 2（图相关联的2)。

相关系数的接种物的效果加载A. penicillioides对接种小鼠生化性能的影响表明，r为0.99，斜率为0.96+0.07，截距为-0.94+1.54,p = 4.77 x 10-^五（数字3)。对于P.桔接种量影响的相关系数r为0.997，斜率= 1.16+0.04，截距= -1.03+0.77,p = 6.14 x 10-⁷（数字4)。接种量的相关系数答:flavus上接种小鼠也显示R = 0.95，斜率= 0.68 + 0.10，截距= 2.42 + 2.07和P为0.001的生化特性（图五)。对于p . chrysogenum接种的小鼠中，r为0.97，斜率= 0.77 + 0.08，截距= 2.22 + 1.68，以及p = 0.00022（图6)。

4。讨论

真菌在过敏性疾病中的作用在文学是有据可查的。空气中花粉和真菌孢子过敏已经牵涉在温带地区过敏性呼吸疾病[的主要原因之一7]，但很少有人知道他们在热带致敏性。在西南尼日利亚大气空气真菌的优势种监测整个采样同期分别曲霉属真菌属。和青霉属。这就需要他们滴鼻在小鼠中使用。真菌疾病引起了广泛的疾病包括过敏，浅表感染，和侵入性真菌病[8]，它通常与发病率和死亡率[率高相关联9]。人们普遍接受的是，抗氧化剂是重要的活性氧平衡和超过氧化应激保卫生物体。活性氧（ROS）已经被证明是免疫细胞的微生物破坏的杀灭反应的构建块。目前肯定已经表明，ROS发挥在正常细胞信号转导和细胞周期的因子的关键作用。汉考克等人，2001年[10，他们的研究表明，ROS在细胞信号传导中发挥作用，包括;细胞凋亡;基因表达;以及细胞信号级联的激活。细胞对ROS的保护去除活性氧是所有有氧生命形式生存的首要条件。因此，许多障碍机制已经进化来满足这一需求，并在ROS的产生和清除之间提供一种平衡。细胞有各种强化机制来改善ROS的有害影响。超氧化物歧化酶(SOD)催化两个超氧化物阴离子转化为过氧化氢(H₂Ø₂)和氧(O₂)而谷胱甘肽过氧化物酶是一组含有硒的酶，它也能加速过氧化氢和有机过氧化物对酒精的消耗。谷胱甘肽是最重要的非酶氧化障碍机制。它的含量相对较多(毫米水平)，可用于解毒过氧化物和恢复一些重要的抗氧化剂。

过氧化氢(H₂Ø₂）是针对细胞周期调控的最重要的ROS。一氧化氮具有许多生理功能，并在生物病理生理学效应，并通过酶从L-精氨酸的iNOS / nNOS的/ eNOS的合成。一氧化氮是通过形成过氧亚硝酸盐[接受作为抗氧化剂通过捕获自由基O-和作为氧化剂11]。

在本研究中，两个丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）浓度在肺组织显著增加。桔青霉对MDA的影响最大黄曲霉接种真菌有测定MDA的量最少。对于MPO，p . chrysogenum接种的小鼠肺部测量最高水平。赫沃宁等人，1997年c [12]，类似地观察到的孢子加利福尼亚小S.诱导活性氧类别（ROS）的人多形核白细胞和巨噬细胞两者体外。

在我们的结果中，NO和MDA对真菌浓度的影响并不显著，因为接种物的浓度可能不足以引起小鼠的任何感染。H₂Ø₂也不显著，因为它是与疾病严重程度相关的炎症标志物，因此它的存在可能不足以通过真菌种类的接种量对系统造成显著损害。另一种解释可能是谷胱甘肽的酶防御活性阻止了羟基自由基(OH)的形成。

如发现在这项研究中蛋白质丰度也没四个接种真菌之间变化同样是不同浓度也丝毫不影响其在肺部生产。对于MDA，p . chrysogenum和P.桔表达更多的活性氧物质的相比A. penicillioides和答:flavus而接种量在统计学上也不影响肺部的升高水平。p . chrysogenum有肺MPO海拔最高，而至少表达被发现A. penicillioides接种小鼠。将接种载荷显示出表达水平证实负荷剂量对活性氧物种的表达的影响的变化。过氧化氢水平升高在p . chrysogenum接种的小鼠和最低丰度被发现A. penicillioides接种肺部。丰度没有随浓度变化的负载。生产SOD的表现对活性氧的活动，其反效果。P.桔接种的小鼠中产生比更SODp . chrysogenum，a . flavus和A. penicillioides。较高的接种加载产生的，也观察到更多的SOD。GSH丰度为更多的P.桔接种的小鼠和最低丰度测定在答:flavus接种的组织。不同浓度没有影响它的丰盈。所产生的一氧化氮是在最高P.桔接种的小鼠，而最低的测量是在p . chrysogenum。接种量与其丰度也无明显关系。最近研究表明，人类巨噬细胞在多种炎症条件下产生NO，包括肺结核、类风湿关节炎和疟疾[3]。NO参与人类和小鼠巨噬细胞对细胞外病原体的抗菌宿主防御[3，13]。谷胱甘肽是已知直接与ROS反应并充当非酶抗氧化剂[14]。本研究发现谷胱甘肽表达更多的是P.桔接种小鼠。Noverr等人曾在2004年报道过C57BL/6小鼠对真菌孢子激发的类似反应[15]，谁破坏观察微生物和呼吸道真菌暴露的免疫应答。

此外，在我们的研究中，分析的结果显示四个真菌物种群集不同，因为A. penicillioides和P.桔对小鼠，同时肺类似的效果答:flavus和p . chrysogenum活动还对肺部类似的效果。答:flavus和p . chrysogenum肺上的活动导致细胞中MDA的产生(更多的ROS)。与孢子相比，它们在系统中的活性是致命的P.桔和A. penicillioides。这四个真菌种类的活动已在这项工作中表现出ROS的产生是不同的。

因此，本研究考察了真菌过敏中氧化应激和抗氧化状态的几种指标的变化。综合起来，这些结果提供了关于真菌在氧化应激和小鼠抗氧化水平上的作用的新信息。

五，结论

意见，即接种微生物引起的炎症和肺毒性反应表明，他们可以向相关的健康造成不良影响，如过敏而导致氧化应激的损伤性炎症。相比基于可比的体积剂量，真菌物种p . chrysogenum和P.桔为更有效地诱导比真菌物种的不利影响A. penicillioides和答:flavus。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据是可用的，请相应的作者。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

笔者想工作的过程中，要感谢Farombi教授和生物化学系的伊费Awogbindin博士，伊巴丹大学，为他们提供技术援助和支持。另外要特别感谢杰森Stajich教授，微生物学系和植物病理学，加州大学河滨分校，使真菌菌株的分子鉴定。

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