文摘
布鲁氏菌病流行在孟加拉国在人类和动物。很多原因诊断复杂,因为牛布鲁氏菌病可以通过各种血清学诊断测试。但是测试有限制;生物仍然是细胞内时,疾病进入慢性阶段和抗体滴定度可能会下降。本研究进行隔离和检测布鲁氏菌种虫害的聚合酶链反应(PCR)血清反应阴性的奶牛。共有360头奶牛从三个地理区域被玫瑰红板试验筛选血清(RBPT) 24个样本血清阳性,其余的样品血清检查是阴性。24中血清反应阳性的个体,11从血清学文化积极和6文化积极消极的奶牛。整个seroprevalence牛布鲁氏菌病的6.6%,疾病条件更高的患病率在堕胎(28.07%),其次是不孕(13.33%)。确认布鲁氏菌种虫害在血清反应阴性的奶牛,分离提取并进行了PCR,产生905个基点的扩增子大小6布鲁氏菌种虫害从牛奶样品。所以,布氏杆菌病的检测或根除细菌试验和PCR技术应该执行与牛奶的血清学试验。
1。介绍
布鲁氏菌病是一种最重要的人畜共患疾病感染人类和家畜。它是亚洲流行在许多发展中国家,非洲和拉丁美洲,包括孟加拉国。它是由成员属于属革兰氏阴性细菌布鲁氏菌。这些是小,不动的,兼性厌氧,细胞内,革兰氏阴性coccobacilli并展示强大的主机优先1,2]。五种Brucell已知原因等家养动物的疾病b .流产(牛)b . melitensis(山羊),b羊属(羊)b是(猪)b .犬属(狗)。人类感染所致b . melitensis,b .流产,b是通过直接接触被感染的动物和饮用未经高温消毒或原料奶(3]。
布鲁氏菌病是通过直接或间接接触传播感染动物“经常通过摄入和性病路线”(4]。感染可能发生少通常通过结膜和吸入,在子宫内5]。它也可以通过污染物扩散;布鲁氏菌病的传播通过蜱虫,跳蚤,或从被感染的蚊子群未感染群从未被证明(6]。
世界卫生组织(世卫组织)实验室生物安全手册分类布鲁氏菌风险小组第三。布鲁氏菌病很容易传播给人类,导致急性发热性疾病和布鲁氏菌病,可能发展为更长期的形式,也可以产生严重的并发症影响肌肉骨骼、心血管和中枢神经系统。应采取预防措施防止人类感染。感染通常是由于职业暴露和本质上是通过口腔,呼吸道,或结膜路线,但摄入乳制品构成了主要风险的公众疾病流行。有一个兽医和农民职业风险处理受感染动物和流产的胎儿和胎盘。布鲁氏菌病是一种最容易获得实验室感染,和严格的安全措施处理文化和严重感染时应观察样本,如堕胎的产物。具体建议已经被观察到的生物安全措施布鲁氏菌来华的材料(6]。
生物存活后不同时间的消除从动物的身体。这取决于环境和条件。在悬浮液,布鲁氏菌死于20分钟60°C。阳光直射下几个小时是致命的生物。布鲁氏菌会生存很长一段时间,当暴露于低温。流产布鲁氏菌仍然活在子宫排出长达7个月后存储在冰柜。仍然是可行的30天在冰淇淋存储32°F和黄油142天保持在46.5°F。迅速死亡,而牛奶在室温和生存时间在冰箱温度(7]。
布鲁氏菌病流行在孟加拉国(8,9]。在孟加拉国,它于1967年首次报道在牛10和1983年在人类11]。几项研究在孟加拉国进行记录的seroprevalence布鲁氏菌病牛和水牛(12- - - - - -14]。流产布鲁氏菌已被确认的实时PCR分析直接从临床标本15- - - - - -17]。然而,细菌鉴定布鲁氏菌场隔离尚未执行。牛奶是一种布鲁氏菌病的重要来源在人类当他们摄入未经高温消毒的牛奶和未煮熟的牛奶。很多情况下复杂牛布鲁氏菌病的诊断。的入口布鲁氏菌有机体的身体可以诊断血清学测试。但有一个限制测试疾病生物细胞,进入一种慢性阶段。在这种情况下,抗体滴定度可能下降或保持在诊断阈值。这种类型的动物可能摆脱生物的牛奶,这是对人类威胁(18- - - - - -20.]。因此,本研究旨在孤立布鲁氏菌种虫害从血清反应阴性的个人历史的堕胎,重复繁殖,死胎,胎盘通过使用标准的和保留文化流行病学研究方法建立一个基地,疫情管理,控制和根除程序孟加拉国牛布鲁氏菌病。
2。材料和方法
血液和牛奶样本收集从三个地理区域在位于(23.8583°N 90.2667°E),加兹浦尔Sadar (24.0000°N 90.4250°E)和Mymensingh Sadar (24.7500°N 90.4167°E)。共有360个牛奶和血液样本的收集来自22个奶牛场和个人的历史之前提到收集样品。
大约5毫升的血液收集从每个个人的奶牛抑制和浸泡后颈沟的血液采集网站70%的酒精。收集血液样本的注射器大约4小时在室温下保持原状,然后转移到冰箱,一夜之间保持在4°C。后来,血清涌入一个埃普多夫管,在2000转离心10分钟。离心分离后,得到了清晰的血清,然后血清被转移到一个消毒标记埃普多夫管和存储−20°C到使用。之前的玫瑰红板试验(RBPT)、RBT抗原和样品(血清)在室温下保存。玫瑰红板测试(RBPT)进行测试的存在的血清样本布鲁氏菌据世界动物卫生组织的标准过程种虫害特定抗体(2008)(21]。
在牛奶样品的收集,整个乳房和乳头的牛被洗净晾干。约10毫升的牛奶收集后丢弃的第一个流牛奶从四面八方。从挤奶器是特别注意避免污染的手。猎鹰的牛奶样品收集管在4°C保存在冰箱过夜。然后,1毫升的牛奶是在每个埃普多夫管和离心1500 rpm 15分钟在4°C。颗粒和上层清液收集在一个埃普多夫管进行细菌学上的分析。
在细菌学的研究中,500毫升布鲁氏菌选择性琼脂媒体准备以下成分:布鲁氏菌选择性琼脂基地:22.5毫克,无菌羊血清:25毫升,和抗生素(硫酸多粘菌素B、杆菌肽、制霉菌素,放线菌酮、萘啶酸、万古霉素):10毫升。血清在55°C煮30分钟,过滤,0.2μl无菌过滤,然后混合无菌布鲁氏菌琼脂基地。细菌是从牛奶样品使用孤立的布鲁氏菌选择性琼脂(HiMedia,孟买,印度)。加工过的牛奶样品分别到布鲁氏菌选择性琼脂媒体和接种培养基被放置在一个有限公司2孵化器提供5%的股份有限公司2在37°C 3 - 7天。板块在48小时后检查每24小时。有严格的生物安全测量,隔离的临床标本的操纵布鲁氏菌在生物安全二级种虫害进行A2内阁(美国热科学)。合成殖民地是亚文化和文化特征识别的,革兰氏染色法(22,23血清和二氧化碳增长要求,硫化氢生产、脲酶活性、氧化酶试验。殖民地代表存储−80°C的15%甘油trypto大豆肉汤(TSB)很长一段时间的保护隔离。
由向导®基因组DNA提取DNA进行净化设备(Promega公司)。首先,循环的殖民地是收获和混合1毫升的磷酸盐缓冲溶液和离心机在13000×g 2分钟。然后,浮在表面的被丢弃。然后,600年μl细胞核裂解的解决方案是添加和混合的温柔的吸量。然后,它孕育了5分钟在80°C;然后是冷却到室温。Three-microliter核糖核酸酶的解决方案是混合和孵化37°C 15-60分钟然后冷却到室温。对蛋白质沉淀,200年μl的蛋白质沉淀的解决方案是添加和漩涡。然后,它被保存在冰5分钟,在13000×g离心机。DNA降水和补液,上层清液包含600被转移到一个干净的管μl(异丙醇在室温和正常混合。然后,它在13000×g离心2分钟,上层的套利交易。然后,600年μl(70%乙醇室温正常添加和混合。离心机2分钟13000×g和乙醇吸气,颗粒脱水10 - 15分钟。100年的DNA颗粒水化μl的补液1小时在65°C或一夜之间在4°C。
属特定PCR分析进行识别布鲁氏菌种虫害的放大16 s的905个基点片段核糖体rna基因编码的热休克蛋白24]。引物PCR试验中使用F4 (TCGAGCGCCCGCAAGGGG)和R2 (AACCATAGTGTCTCCACTAA) [24]。聚合酶链反应混合物的总量与PCR主人混合物(美国热科学)是12.5μ底漆(20 pmol / l,前进μl)是1μl,反向引物(20 pmol /μl)是1μl,模板DNA是5μ5.5 l, nuclease-free水μl。执行的反应是在DNA热循环的初始变性温度为95°C 5分钟,其次是35周期在95°C的变性30秒,退火90秒54°C,在72°C扩展了90秒,最终在72°C扩展了6分钟。放大产品进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳和染色与溴化乙锭(0.5毫克/毫升)30分钟在一个黑暗的地方。然后,这种凝胶在蒸馏水10分钟使退色,可视化的紫外线在黑暗中透照器室下图像文档系统。
3所示。结果
从360年开始测试样品,24例(6.6%)被发现被RBPT血清学阳性牛血清检查是阴性的,其余RBPT(图1)。两个样品都培养布鲁氏菌选择性琼脂媒体和血琼脂媒体。RBPT和文化媒体的结果如表所示1。
(一)
(b)
3.1。整体Seroprevalence RBPT牛布鲁氏菌病的
总共有360头牛血清RBPT仅有24个样品的测试显示阳性反应RBPT(图1)。整个seroprevalence牛布鲁氏菌病的6.6%(表2)。
3.2。根据年龄Seroprevalence牛布鲁氏菌病的
根据牛的年龄,年龄牛患病率高于年轻的一个。更高的患病率被更多的牛4岁以上(8.18%)比牛3到4岁(4.29%)(表3)。
3.3。Seroprevalence布鲁氏菌病的牛与生殖障碍有关
牛的疾病状况,更高的患病率被记录的流产(28.07%),其次是不孕(13.33%)(表4)。
3.4。Seroprevalence牛布鲁氏菌病的怀孕状况的基础上
360头牛,87怀孕和妊娠273例怀孕牛布鲁氏菌病的患病率高于妊娠的牛(表5)。
的几个殖民地布鲁氏菌种虫害被观察到布鲁氏菌选择性琼脂媒体3 - 5天后孵化小,半透明,dewdrop-like,圆、凸光滑利润率(图2血液琼脂whitish-grey)和文化特征,强调,闪亮,nonhemolytic,凸殖民地观察(图3)。生化测试的结果记录如下:过氧化氢酶测试:阳性,氧化酶试验:积极、测试先生:消极,副总裁测试:消极,吲哚试验:负面反应;这些是的特点布鲁氏菌spp。在革兰氏染色(图4),细菌隔离被认为是革兰氏阴性coccobacilli单和安排。
检测布鲁氏菌种虫害在牛奶样本血清阴性牛用属特定引物(F4和R2)针对16 SrRNA产生扩增子的905个基点。342份血清阴性样本,有文化积极和放大905 bp PCR扩增子属于属布鲁氏菌(图5)。
4所示。讨论
布鲁氏菌总是细胞内和细胞外。保护性免疫主要是外围细胞介导,但也体液。间接的体液免疫是有用的诊断的血清学测试使用:玫瑰红板测试,补体结合,ELISA (25]。牛牛奶样品中布鲁氏菌病的诊断主要依赖于牛奶环测试,间接检测布鲁氏菌种虫害的主机(26]。的布鲁氏菌生物体内可以诊断血清学测试,但是测试有一个限制有机体时怀有细胞和疾病进入慢性阶段。在这种情况下,抗体滴定度可能下降或保持在诊断阈值和这些动物可能已突破了生物体的牛奶是威胁人类18- - - - - -20.]。在流行地区,这种生物是主要通过传播给人未经高温消毒的牛奶和奶制品的消费从绵羊和山羊27- - - - - -29日]。牛布鲁氏菌病在伊朗进行调查期间,由Razi研究所在十二个月的时间内,收集血清样本和牛奶同时8感染牲畜6472头奶牛的血清学和细菌学的测试和119年布鲁氏菌种虫害隔绝5686血清反应阴性的奶牛,患病率为2.09% (30.]。在现在,在血清反应阴性的奶牛布鲁氏菌病的患病率是1.75%低于Zowghi et al。30.]。一项研究是在埃塞俄比亚2016年在66年进行的血清反应阴性的人;他们培养临床样本,但是所有的样品都文化负面的。在这个研究中,没有获得牛奶和隔离胎儿胃内容(31日]。
在牛,它导致流产,不孕症,保留胎盘,死胎,乳制品行业造成巨大的经济损失(5,32]。有各种根除程序控制布鲁氏菌病包括疫苗接种、血清学测试和屠宰(1,2,33,34]。定期对布鲁氏菌病血清学监测是必不可少的的任务控制措施(35]。每年,全世界一半的布鲁氏菌病报告一百万例。最近,许多国家已经消灭了布鲁氏菌病从他们的牛群,和许多其他国家显著降低感染的患病率在他们的牲畜。
本研究记录总体患病率6.6%布鲁氏菌种虫害的结果低于12% (36),8.1% (13),7.76% (37),15.33% (12),14.14% (38),18.75% (39)和更高的布鲁氏菌病患病率比2.25% (40),3.30% (41),2% (42),2.4% (43),2.66% (44),2.72% (45患病率在牛。布鲁氏菌病患病率的变化可能是由于不同的样本大小、年龄、品种、怀孕状态的动物,研究区域,卫生条件下,群体大小、育种技术、生殖疾病,诊断测试(12,46,47]。
在这项研究中,布氏杆菌病的患病率是4.29%,3 - 4年年龄段时4年以上年龄段的8.18%。与本研究的结果相比,2.59%41]布鲁氏菌病患病率2.5 - 4岁被发现在牛,牛4岁以上为4.35%。同样,据报道,2005年,患病率是2.3%和4%9低于4和高于4年年龄段,分别。对疾病的易感性随着年龄的增加;这似乎是更常见的与性成熟相关(5)和不同的研究报道,年老的动物比年轻更易感的动物。
在目前的研究中,布鲁氏菌病的患病率(11.49%)高于未妊娠的牛(5.13%)。布鲁氏菌病引起流产、胎盘的保留,重复繁殖,不孕,延长intercalving时期由于早期胚胎死亡。本研究记录28.07%的患病率在牛布鲁氏菌病的历史史的堕胎和牛布鲁氏菌病13.33%不孕症,同意报告的201114),记录在奶牛布鲁氏菌病的患病率为15%,前一个堕胎,和布鲁氏菌病的患病率在重复繁殖情况下是45%。1975年,布鲁氏菌病的流行历史的堕胎被报道为14.2% (48),而2011年布鲁氏菌病的流行历史的保留胎盘规定是13.04%14),而在目前的研究患病率为5.71%。
然而,在孟加拉国,牛奶环测试不是练习的筛查布鲁氏菌。RBPT测试被广泛用于检测的抗体布鲁氏菌在一群种虫害。这是简单的执行,价格低廉,适合筛选动物个体。但RBPT也可能产生假阳性血清反应和脂多糖(LPS)鼠疫enterocolitica 0:9,大肠杆菌0157:H7或者从其他细菌,如可交叉反应的抗原沙门氏菌物种和巴斯德菌物种(49- - - - - -54]。因为这个原因确认布鲁氏菌病的个体自由,PCR技术是明智的。
5。结论
在孟加拉国,尽管研究作品的数量seroprevalence布鲁氏菌病的牛和人类,没有报告细菌隔离和标识布鲁氏菌种虫害从血清学-奶牛。在目前的研究中,布鲁氏菌种虫害从血清反应阴性的奶牛被隔离的堕胎,重复繁殖,保留胎盘和死胎。因此,它是非常重要的隔离布鲁氏菌隔离设计孟加拉国的布鲁氏菌病的有效控制措施。所以,建议检测或根除布鲁氏菌病;细菌试验和PCR技术应该执行除了血清学测试的牛奶样品。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者要感谢孟加拉国科学院她是美国农业部(BAS-USDA)提供基金作为PALS-02项目的一部分。作者感谢科技部,孟加拉国、奖学金计划下的国家科技奖学金,和作者也承认美国微生物学和卫生,孟加拉农业大学实验室的支持和合作。作者感谢兽医人员和农民合作在本研究样本集合。